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    不同產(chǎn)地林下三葉青多糖指紋圖譜研究

    2021-10-12 13:35:24訾豪然許海順吳盛楠張單檸王紅珍吳學(xué)謙
    中國農(nóng)學(xué)通報 2021年27期

    訾豪然,許海順,吳盛楠,張單檸,徐 娟,白 巖,王紅珍,吳學(xué)謙

    (1浙江農(nóng)林大學(xué),杭州311300;2浙江省特色中藥資源保護與創(chuàng)新利用重點實驗室,杭州311300)

    0 引言

    三葉青,葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg)的地下塊根部分,又名三對半,三葉扁藤、石老鼠等;主要分布于中國長江以南的大部分省份和地區(qū),是民間的常用中草藥[1-2]。據(jù)《本草綱目》記載,三葉青性涼、無毒、味甘微苦,具有清熱解毒,消腫止痛,化痰散結(jié)的功效[3];現(xiàn)代多用于各種炎癥、病毒感染和癌癥的治療[4]。2018年被浙江省政府列入新“浙八味”重點培育品種之一[5]。由于三葉青的良好功效,近年來被人們廣泛認可并接受,因此,導(dǎo)致市場需求量急速增長,其野生資源被消耗殆盡,而人工種植的三葉青品質(zhì)卻參差不齊,甚至有他藥冒充三葉青出售的,功效千差萬別,嚴(yán)重影響了三葉青產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。因此,必須加強對三葉青品質(zhì)的控制及其影響因素的研究。三葉青中除了含有黃酮類、酚酸類等多種次生代謝產(chǎn)物外,還含有結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖化合物[6]。三葉青多糖作為其中主要的活性成分之一,也具備降血糖、降血脂和抗氧化等多種生物活性功效[7-8],因此,多糖也是三葉青質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。而關(guān)于三葉青多糖的研究主要集中在多糖的提取、分離純化以及多糖組分等方面。郭南生等[9]采用水浴提取法提取三葉青根多糖,確定了三葉青根多糖提取的最佳工藝為:提取溫度96℃、液料比34:1(mL/g)、提取時間2 h,并得到在此工藝條件下三葉青多糖得率為21.23%。黃有強[10]使用微波輔助法提取多糖,對三葉青多糖的提取工藝進行了優(yōu)化并最終使多糖的提取所得率達到14.36%。饒君鳳等[11]采用IC-PAD法測定出了三葉青塊根中含有巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等6種單糖。呂蘭等[12]對優(yōu)化工藝提取后分離得到多糖進行三氟乙酸水解,結(jié)果表明,除了饒君鳳等測得的巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等6種單糖外還有半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖這4種單糖。以上研究對于三葉青多糖的研究不夠深入,而關(guān)于三葉青多糖質(zhì)量控制的相關(guān)研究較少,目前仍采用傳統(tǒng)的苯酚—硫酸法測定總多糖[13],現(xiàn)有的評價指標(biāo)缺乏專屬性特征。指紋圖譜是實現(xiàn)對中藥質(zhì)量全面控制的有效技術(shù),通過建立多糖指紋圖譜并測定其組成單糖的含量,可以對不同批次藥材質(zhì)量的優(yōu)劣進行評價。因此,本研究建立了基于酸水解的三葉青多糖指紋圖譜評價體系,并測定了其中的單糖組成及其含量,為鑒別不同來源的三葉青及其質(zhì)量控制提供了參考方法和依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    FD-1A-50冷凍干燥機;BioTek-Epoch 2型酶標(biāo)儀;Waters 2695 Alliance系統(tǒng);Waters 2424型蒸發(fā)光散射檢測器;CF15RN臺式離心機(天美科學(xué)儀器有限公司);RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司)

    1.2 試劑與對照品

    三氟乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、乙醇、甲醇等均為國產(chǎn)分析化學(xué)試劑;乙腈(色譜純,美國TEDIA公司);對照品鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖均購自上海源葉生物科技有限公司。10批三葉青樣品分別采自不同產(chǎn)地,經(jīng)浙江農(nóng)林大學(xué)中藥生物工程實驗室吳學(xué)謙教授鑒定,為葡萄科植物三葉青T.hemsleyanum的新鮮塊根,樣品信息見表1。

    表1 藥材樣品來源

    1.3 三葉青多糖含量測定

    1.3.1 供試品溶液制備 精密稱取5.00 g三葉青粉于平底燒瓶中,加100 mL水,沸水水浴2 h,冷卻后離心取上清,重復(fù)此步驟3次,合并濾液濃縮至20 mL,加入無水乙醇80 mL,4℃下靜置過夜,離心后沉淀用20 mL超純水復(fù)溶,多糖上清液加入α-淀粉酶,酶解24 h,完全酶解物離心超濾除去小分子化合物,收集上清液,按5:1加入Sevage試劑除蛋白后得到多糖溶液,冷凍干燥后備用[14]。

    1.3.2 對照品溶液制備 精密稱取D-無水葡萄糖對照品2.00 mg于10 mL容量瓶中,經(jīng)溶解并定容后配制成0.20 mg/mL的葡萄糖對照品溶液,備用。

    1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0,0.04,0.08,0.12,0.16,0.20 mL置于2 mL離心管,加水將各試管中液體體積補至0.20 mL,加入0.10 mL苯酚溶液,加入1 mL濃硫酸溶液,混勻離心,使溶液沉至底部沸水浴2 min,冷卻至室溫,在485 nm波長下測定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

    1.3.4 樣品測定 精密移取2.1.1項下供試品溶液200 μL,按2.1.3項下顯色測定。

    1.4 三葉青多糖指紋圖譜建立及單糖分析

    1.4.1 混合單糖標(biāo)樣制備 精密稱取葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖,將其配成1.05,2.75,2.80,1.20,2.15,2.20,2.25,2.03 mg/mL的單一儲備液,各吸取等量體積混勻,得混合對照品溶液。

    1.4.2 三葉青多糖部分酸水解 取2.1.1中提取得到的三葉青多糖溶液400 μL若干份,加入4.00 mol/L三氟乙酸120 μL,混勻。隨后將混合液置于80℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后,采用真空干燥法干燥酸水解產(chǎn)物,用于后續(xù)衍生化處理。

    1.4.3 混合單糖標(biāo)樣及多糖酸水解物PMP衍生化 取200 μL的混合單糖標(biāo)樣與等體積0.30 mol/L NaOH溶液混合均勻,加入200 μL 0.50 mol/L的PMP甲醇溶液,漩渦混勻;70℃下反應(yīng)60 min后,取出冷卻。將溶液配至中性,再加水補至1 mL,然后加入等體積的氯仿,劇烈振搖,待靜置分層后,棄去下層有機相,如此萃取3次[16],取上層水相過濾,備用,進樣。

    取2.2.2中得到的多糖加200 μL水復(fù)溶后,按上述方法進行衍生化后上樣分析。

    1.4.4 色譜條件 色譜柱WondaSil-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動相為[17]:乙腈(A)-0.1 mol/L pH=6.7磷酸鹽緩沖液(B),流速1.0 mL/min,柱溫23℃,進樣量10 μL,梯度洗脫;檢測波長245 nm。梯度洗脫程序見表2。

    表2 梯度洗脫程序

    2 結(jié)果與分析

    2.1 三葉青總多糖含量測定

    按1.1項下方法測定三葉青中總多糖含量,以葡萄糖標(biāo)品質(zhì)量(mg)為縱坐標(biāo),吸光度值(A)為橫坐標(biāo),通過光度測量后繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0387x+0.0003(R2=0.9991)。按同樣方法分別測定了10批三葉青藥材中多糖的含量,結(jié)果如表3所示。由下表可知,不同產(chǎn)地的三葉青總多糖含量差異較大,其中遂昌的總多糖含量最高,為35.586 mg/g,其次是溫州,含量為32.926 mg/g。不同產(chǎn)地三葉青多糖純度為73.83%~ 87.36%,RSD值為0.076%~ 1.105%,表明所得到的多糖純度較高,可用于多糖組成分析。

    表3 三葉青多糖含量的測定結(jié)果(n=3)

    2.2 三葉青單糖指紋圖譜建立與分析

    2.2.1 方法學(xué)考察 精密度試驗:取遂昌樣品的供試液,每次進樣10 μL,連續(xù)進樣6次,對共有峰的相對保留時間及峰面積比值進行分析,計算得到RSD在0.82%~ 1.53%,說明本實驗所用儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗:取遂昌三葉青衍生化后多糖溶液,在6個時間點(0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h)分別進樣,分析8個單糖共有峰的相對保留時間及峰面積比值,其RSD在1.82%~ 2.52%,表示樣品穩(wěn)定。重復(fù)性試驗:取遂昌三葉青樣品6份,按供試品制備方法平行制備并檢測,考察共有色譜峰保留時間和峰面積的一致性,RSD值在0.60%~ 2.42%,表明方法重復(fù)性良好。

    2.2.2 指紋圖譜共有峰標(biāo)定 將10個不同產(chǎn)地三葉青多糖按照上述實驗方法進行水解和衍生化后上樣分析,得到不同產(chǎn)地水解后多糖的指紋圖譜,將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”,對圖譜中的色譜峰標(biāo)定后進行多點校正,生成對照紋圖譜[18],結(jié)果得到10個產(chǎn)地的單糖圖譜,并鑒定了8個色譜峰。結(jié)果如圖1和圖2所示。

    圖1 混合單糖對照品圖譜

    圖2 三葉青多糖完全水解產(chǎn)物中單糖的HPLC指紋圖譜

    2.2.3 相似度計算 將不同產(chǎn)地三葉青圖譜中的共有峰面積和相對保留時間導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”,得到不同產(chǎn)地三葉青的多糖水解產(chǎn)物的相似度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地的三葉青多糖水解后產(chǎn)物相似度均較高,其相似度值均在0.934~ 0.997之間,這表明10批藥材樣品間差異較小,不同產(chǎn)地三葉青多糖的單糖組成成分穩(wěn)定。10批樣品多糖水解后其之間的相似度見圖3。

    圖3 不同產(chǎn)地三葉青多糖水解樣品相似度熱圖

    2.2.4 聚類分析 以10批多糖樣品共有峰的相對峰面積為原始數(shù)據(jù),對其進行系統(tǒng)聚類分析,采用組間聯(lián)接法,以平方Euclidean距離作為樣品的測度[19]。聚類分析表明,當(dāng)分類距離為15時,10批三葉青多糖樣品被分為3大類,其中遂昌單獨聚為一類,臨安和桂林為一類,其余的一類。分析結(jié)果見圖4。

    圖4 10批三葉青多糖聚類分析樹狀圖

    2.2.5 主成分分析 用IBM SPSS 19.0軟件對10個不同產(chǎn)地三葉青藥材UV圖譜中的8個變量進行標(biāo)準(zhǔn)化處理,以主成分的方差貢獻率及特征值為依據(jù),進行主成分分析,計算特征值及方差貢獻率[20],從其中得到2個主成分因子,其分析結(jié)果見表4。由表4可得知6個主成分因子的特征值分別為3.476、2.893,累積方差貢獻率為79.618%,表明在HPLC圖譜中這2個主成分可代表樣品79%以上的信息,可用于進行主成分分析。

    表4 2個主成分因子的特征值和方差貢獻率

    將因子分析得到的成分矩陣進行正交旋轉(zhuǎn),得到8個指標(biāo)的得分矩陣,結(jié)果如表5所示。經(jīng)分析可知,主成分1主要受到來自氨基葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和阿拉伯糖等因子的影響;主成分2主要受到來自甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖的影響。

    表5 主成份得分矩陣

    以上述HPLC圖譜中的2個主成分因子對10個不同產(chǎn)地三葉青多糖進行綜合評分(綜合得分越高表示藥材樣品整體質(zhì)量越好[21],得到10批樣品主成分因子得分及排序,結(jié)果見表6。根據(jù)得分排序可知,在主成分1中以遂昌得分最高,在主成分2中以溫州得分最高;說明遂昌和溫州單糖含量最高。根據(jù)綜合得分可知,遂昌的綜合得分最高,溫州次之,表明遂昌的多糖質(zhì)量最好,溫州的次之,該結(jié)果與總多糖含量測定一致。

    表6 樣品主成分得分、綜合得分及其排序

    2.3 三葉青單糖含量測定

    將三葉青多糖的水解產(chǎn)物PMP衍生化后,按照2.2.4項下條件注入到HPLC中進行測定,得到單糖組分和各單糖峰面積,并據(jù)此計算了各單糖組分的含量、摩爾比和物質(zhì)的量比,結(jié)果分別見表7,表8和表9。

    由表7和表8可知,8種單糖含量具有較大差異,其中甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖4種多糖含量較高,其含量為13.618、15.397、83.151、15.131 mg/g,分別占所有單糖組成比例的9.094%,11.451%,56.695%,和11.030%。由結(jié)果可知三葉青多糖均含有甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等8種單糖,但各組分在含量和組成比例上有明顯差異,說明產(chǎn)地和生長環(huán)境不同對于三葉青多糖的組成有較大影響。由表9可知三葉青中8中單糖平均物質(zhì)的量比為甘露糖:氨基葡萄糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖 =1.000:0.209:0.545:0.431:0.258:1.374:6.221:1.464,其中半乳糖所占的比例最高,表明三葉青多糖結(jié)構(gòu)組成特征是以半乳糖為主。以上結(jié)果為三葉青藥材及其多糖的鑒別提供了依據(jù)。

    表7 不同產(chǎn)地三葉青多糖的單糖組成及含量 mg/g

    表8 不同產(chǎn)地三葉青多糖中單糖的摩爾質(zhì)量百分數(shù) %

    表9 不同產(chǎn)地三葉青多糖中單糖的物質(zhì)的量比

    3 討論

    多糖是植物中的初生代謝產(chǎn)物,是一類高分子聚合物,其在植物中具有多種重要功能,是許多中草藥發(fā)揮藥效作用的主要物質(zhì)之一[22]。多糖也是三葉青中重要的活性物質(zhì),已有研究表明,三葉青多糖具有多種藥理活性,如抗腫瘤、抗炎癥以及降血糖等[23-24]。多糖的生物活性與其組分緊密相關(guān),不同組份組成的多糖,其藥理活性相差較大[25-26],因此,控制多糖質(zhì)量至關(guān)重要,其中多糖中單糖組分測定是多糖質(zhì)量控制的主要指標(biāo)[11]。呂蘭等對優(yōu)化工藝提取后分離得到多糖進行三氟乙酸水解,經(jīng)PMP柱前衍生化后液相色譜分析,測得的巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖等10種單糖[12]。雖然該研究測定出了三葉青多糖中更為完整的單糖組成,但對多糖結(jié)構(gòu)組成的研究不夠深入,并未對單糖含量差異進一步測定和分析,而單糖含量彼此間的差異能反映出多糖的主要特征及其專屬性,有助于對多糖進行質(zhì)量控制[27-28]。因此,本研究通過建立單糖指紋圖譜并分析主要單糖組成與含量,從而實現(xiàn)對不同批次藥材質(zhì)量的優(yōu)劣進行鑒別研究。

    續(xù)表7

    本研究仍采用水提醇沉法提取多糖,通過測定三葉青中總多糖含量發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的三葉青總多糖含量差異較大,多糖純度為73.83%~ 87.36%,表明所得到的多糖純度較高,可用于多糖組成分析,測得所有三葉青多糖均包含葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖等8種單糖(圖2),但根據(jù)已有研究表明三葉青含有10種單糖[12],分析原因是由于本實驗所采用的多糖為經(jīng)α-淀粉酶除去三葉青中淀粉而得到的功能型多糖。對多糖進行酸水解和PMP衍生化后建立了三葉青多糖的HPLC指紋圖譜并進行化學(xué)計量學(xué)分析,根據(jù)分析可知產(chǎn)地不同對多糖中單糖組成成分影響較?。▓D3),并且根據(jù)綜合得分可知,遂昌的樣品質(zhì)量最好,溫州的次之。測定三葉青單糖含量發(fā)現(xiàn),雖然不同產(chǎn)地的單糖組分并無區(qū)別,但其含量卻有較大差異。三葉青多糖包含的8種單糖中甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖4種單糖含量較高,并且半乳糖的含量最高,這表明三葉青多糖是以半乳糖為主的組成特征,是其中的主要組成成分。不同產(chǎn)地多糖含量差異主要體現(xiàn)在葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖三種單糖含量差異較大,表明不同產(chǎn)地的多糖結(jié)構(gòu)上可能存在差異。

    本文建立了基于酸水解的三葉青多糖指紋圖譜并測定出其中單糖組成及其含量,雖然對于三葉青多糖結(jié)構(gòu)研究有一定參考意義,但關(guān)于多糖結(jié)構(gòu)的研究不夠深入,今后的研究可以采用甲基化分析多糖的糖苷鍵等結(jié)構(gòu)信息,以及將多糖酶解后建立起PACE糖譜來對三葉青多糖結(jié)構(gòu)進行進一步的研究。

    4 結(jié)論

    研究結(jié)果表明,10個不同產(chǎn)地三葉青中以遂昌的質(zhì)量最佳,并且得到半乳糖在所有多糖組成中占比為56.695%,三葉青多糖結(jié)構(gòu)組成是以半乳糖為主。因此,本研究為三葉青多糖的鑒定及質(zhì)量控制提供參考依據(jù),這對完善三葉青產(chǎn)地的劃分及品種鑒別具有參考價值。

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