不同產(chǎn)地林下三葉青多糖指紋圖譜研究

訾豪然，許海順，吳盛楠，張單檸，徐 娟，白 巖，王紅珍，吳學(xué)謙

（1浙江農(nóng)林大學(xué)，杭州311300；2浙江省特色中藥資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州311300）

0 引言

三葉青，葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg)的地下塊根部分，又名三對(duì)半，三葉扁藤、石老鼠等；主要分布于中國(guó)長(zhǎng)江以南的大部分省份和地區(qū)，是民間的常用中草藥[1-2]。據(jù)《本草綱目》記載，三葉青性涼、無(wú)毒、味甘微苦，具有清熱解毒，消腫止痛，化痰散結(jié)的功效[3]；現(xiàn)代多用于各種炎癥、病毒感染和癌癥的治療[4]。2018年被浙江省政府列入新“浙八味”重點(diǎn)培育品種之一[5]。由于三葉青的良好功效，近年來(lái)被人們廣泛認(rèn)可并接受，因此，導(dǎo)致市場(chǎng)需求量急速增長(zhǎng)，其野生資源被消耗殆盡，而人工種植的三葉青品質(zhì)卻參差不齊，甚至有他藥冒充三葉青出售的，功效千差萬(wàn)別，嚴(yán)重影響了三葉青產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。因此，必須加強(qiáng)對(duì)三葉青品質(zhì)的控制及其影響因素的研究。三葉青中除了含有黃酮類、酚酸類等多種次生代謝產(chǎn)物外，還含有結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖化合物[6]。三葉青多糖作為其中主要的活性成分之一，也具備降血糖、降血脂和抗氧化等多種生物活性功效[7-8]，因此，多糖也是三葉青質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。而關(guān)于三葉青多糖的研究主要集中在多糖的提取、分離純化以及多糖組分等方面。郭南生等[9]采用水浴提取法提取三葉青根多糖，確定了三葉青根多糖提取的最佳工藝為：提取溫度96℃、液料比34:1(mL/g)、提取時(shí)間2 h，并得到在此工藝條件下三葉青多糖得率為21.23%。黃有強(qiáng)[10]使用微波輔助法提取多糖，對(duì)三葉青多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化并最終使多糖的提取所得率達(dá)到14.36%。饒君鳳等[11]采用IC-PAD法測(cè)定出了三葉青塊根中含有巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等6種單糖。呂蘭等[12]對(duì)優(yōu)化工藝提取后分離得到多糖進(jìn)行三氟乙酸水解，結(jié)果表明，除了饒君鳳等測(cè)得的巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等6種單糖外還有半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖這4種單糖。以上研究對(duì)于三葉青多糖的研究不夠深入，而關(guān)于三葉青多糖質(zhì)量控制的相關(guān)研究較少，目前仍采用傳統(tǒng)的苯酚—硫酸法測(cè)定總多糖[13]，現(xiàn)有的評(píng)價(jià)指標(biāo)缺乏專屬性特征。指紋圖譜是實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥質(zhì)量全面控制的有效技術(shù)，通過(guò)建立多糖指紋圖譜并測(cè)定其組成單糖的含量，可以對(duì)不同批次藥材質(zhì)量的優(yōu)劣進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此，本研究建立了基于酸水解的三葉青多糖指紋圖譜評(píng)價(jià)體系，并測(cè)定了其中的單糖組成及其含量，為鑒別不同來(lái)源的三葉青及其質(zhì)量控制提供了參考方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

FD-1A-50冷凍干燥機(jī)；BioTek-Epoch 2型酶標(biāo)儀；Waters 2695 Alliance系統(tǒng)；Waters 2424型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；CF15RN臺(tái)式離心機(jī)（天美科學(xué)儀器有限公司）；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA公司）

1.2 試劑與對(duì)照品

三氟乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、乙醇、甲醇等均為國(guó)產(chǎn)分析化學(xué)試劑；乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；對(duì)照品鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。10批三葉青樣品分別采自不同產(chǎn)地，經(jīng)浙江農(nóng)林大學(xué)中藥生物工程實(shí)驗(yàn)室吳學(xué)謙教授鑒定，為葡萄科植物三葉青T.hemsleyanum的新鮮塊根，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 藥材樣品來(lái)源

1.3 三葉青多糖含量測(cè)定

1.3.1 供試品溶液制備 精密稱取5.00 g三葉青粉于平底燒瓶中，加100 mL水，沸水水浴2 h，冷卻后離心取上清，重復(fù)此步驟3次，合并濾液濃縮至20 mL，加入無(wú)水乙醇80 mL，4℃下靜置過(guò)夜，離心后沉淀用20 mL超純水復(fù)溶，多糖上清液加入α-淀粉酶，酶解24 h，完全酶解物離心超濾除去小分子化合物，收集上清液，按5:1加入Sevage試劑除蛋白后得到多糖溶液，冷凍干燥后備用[14]。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品2.00 mg于10 mL容量瓶中，經(jīng)溶解并定容后配制成0.20 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液，備用。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20 mL置于2 mL離心管，加水將各試管中液體體積補(bǔ)至0.20 mL，加入0.10 mL苯酚溶液，加入1 mL濃硫酸溶液，混勻離心，使溶液沉至底部沸水浴2 min，冷卻至室溫，在485 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

1.3.4 樣品測(cè)定 精密移取2.1.1項(xiàng)下供試品溶液200 μL，按2.1.3項(xiàng)下顯色測(cè)定。

1.4 三葉青多糖指紋圖譜建立及單糖分析

1.4.1 混合單糖標(biāo)樣制備 精密稱取葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖，將其配成1.05，2.75，2.80，1.20，2.15，2.20，2.25，2.03 mg/mL的單一儲(chǔ)備液，各吸取等量體積混勻，得混合對(duì)照品溶液。

1.4.2 三葉青多糖部分酸水解 取2.1.1中提取得到的三葉青多糖溶液400 μL若干份，加入4.00 mol/L三氟乙酸120 μL，混勻。隨后將混合液置于80℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，采用真空干燥法干燥酸水解產(chǎn)物，用于后續(xù)衍生化處理。

1.4.3 混合單糖標(biāo)樣及多糖酸水解物PMP衍生化 取200 μL的混合單糖標(biāo)樣與等體積0.30 mol/L NaOH溶液混合均勻，加入200 μL 0.50 mol/L的PMP甲醇溶液，漩渦混勻；70℃下反應(yīng)60 min后，取出冷卻。將溶液配至中性，再加水補(bǔ)至1 mL，然后加入等體積的氯仿，劇烈振搖，待靜置分層后，棄去下層有機(jī)相，如此萃取3次[16]，取上層水相過(guò)濾，備用，進(jìn)樣。

取2.2.2中得到的多糖加200 μL水復(fù)溶后，按上述方法進(jìn)行衍生化后上樣分析。

1.4.4 色譜條件 色譜柱WondaSil-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動(dòng)相為[17]：乙腈(A)-0.1 mol/L pH=6.7磷酸鹽緩沖液(B)，流速1.0 mL/min，柱溫23℃，進(jìn)樣量10 μL，梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉青總多糖含量測(cè)定

按1.1項(xiàng)下方法測(cè)定三葉青中總多糖含量，以葡萄糖標(biāo)品質(zhì)量(mg)為縱坐標(biāo)，吸光度值(A)為橫坐標(biāo)，通過(guò)光度測(cè)量后繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0387x+0.0003(R2=0.9991)。按同樣方法分別測(cè)定了10批三葉青藥材中多糖的含量，結(jié)果如表3所示。由下表可知，不同產(chǎn)地的三葉青總多糖含量差異較大，其中遂昌的總多糖含量最高，為35.586 mg/g，其次是溫州，含量為32.926 mg/g。不同產(chǎn)地三葉青多糖純度為73.83%～ 87.36%，RSD值為0.076%～ 1.105%，表明所得到的多糖純度較高，可用于多糖組成分析。

表3 三葉青多糖含量的測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.2 三葉青單糖指紋圖譜建立與分析

2.2.1 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：取遂昌樣品的供試液，每次進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積比值進(jìn)行分析，計(jì)算得到RSD在0.82%～ 1.53%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所用儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)：取遂昌三葉青衍生化后多糖溶液，在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h)分別進(jìn)樣，分析8個(gè)單糖共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積比值，其RSD在1.82%～ 2.52%，表示樣品穩(wěn)定。重復(fù)性試驗(yàn)：取遂昌三葉青樣品6份，按供試品制備方法平行制備并檢測(cè)，考察共有色譜峰保留時(shí)間和峰面積的一致性，RSD值在0.60%～ 2.42%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.2 指紋圖譜共有峰標(biāo)定 將10個(gè)不同產(chǎn)地三葉青多糖按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行水解和衍生化后上樣分析，得到不同產(chǎn)地水解后多糖的指紋圖譜，將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，對(duì)圖譜中的色譜峰標(biāo)定后進(jìn)行多點(diǎn)校正，生成對(duì)照紋圖譜[18]，結(jié)果得到10個(gè)產(chǎn)地的單糖圖譜，并鑒定了8個(gè)色譜峰。結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 混合單糖對(duì)照品圖譜

圖2 三葉青多糖完全水解產(chǎn)物中單糖的HPLC指紋圖譜

2.2.3 相似度計(jì)算 將不同產(chǎn)地三葉青圖譜中的共有峰面積和相對(duì)保留時(shí)間導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，得到不同產(chǎn)地三葉青的多糖水解產(chǎn)物的相似度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的三葉青多糖水解后產(chǎn)物相似度均較高，其相似度值均在0.934～ 0.997之間，這表明10批藥材樣品間差異較小，不同產(chǎn)地三葉青多糖的單糖組成成分穩(wěn)定。10批樣品多糖水解后其之間的相似度見(jiàn)圖3。

圖3 不同產(chǎn)地三葉青多糖水解樣品相似度熱圖

2.2.4 聚類分析 以10批多糖樣品共有峰的相對(duì)峰面積為原始數(shù)據(jù)，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用組間聯(lián)接法，以平方Euclidean距離作為樣品的測(cè)度[19]。聚類分析表明，當(dāng)分類距離為15時(shí)，10批三葉青多糖樣品被分為3大類，其中遂昌單獨(dú)聚為一類，臨安和桂林為一類，其余的一類。分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 10批三葉青多糖聚類分析樹(shù)狀圖

2.2.5 主成分分析 用IBM SPSS 19.0軟件對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地三葉青藥材UV圖譜中的8個(gè)變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分的方差貢獻(xiàn)率及特征值為依據(jù)，進(jìn)行主成分分析，計(jì)算特征值及方差貢獻(xiàn)率[20]，從其中得到2個(gè)主成分因子，其分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可得知6個(gè)主成分因子的特征值分別為3.476、2.893，累積方差貢獻(xiàn)率為79.618%，表明在HPLC圖譜中這2個(gè)主成分可代表樣品79%以上的信息，可用于進(jìn)行主成分分析。

表4 2個(gè)主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率

將因子分析得到的成分矩陣進(jìn)行正交旋轉(zhuǎn)，得到8個(gè)指標(biāo)的得分矩陣，結(jié)果如表5所示。經(jīng)分析可知，主成分1主要受到來(lái)自氨基葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和阿拉伯糖等因子的影響；主成分2主要受到來(lái)自甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖的影響。

表5 主成份得分矩陣

以上述HPLC圖譜中的2個(gè)主成分因子對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地三葉青多糖進(jìn)行綜合評(píng)分（綜合得分越高表示藥材樣品整體質(zhì)量越好[21]，得到10批樣品主成分因子得分及排序，結(jié)果見(jiàn)表6。根據(jù)得分排序可知，在主成分1中以遂昌得分最高，在主成分2中以溫州得分最高；說(shuō)明遂昌和溫州單糖含量最高。根據(jù)綜合得分可知，遂昌的綜合得分最高，溫州次之，表明遂昌的多糖質(zhì)量最好，溫州的次之，該結(jié)果與總多糖含量測(cè)定一致。

表6 樣品主成分得分、綜合得分及其排序

2.3 三葉青單糖含量測(cè)定

將三葉青多糖的水解產(chǎn)物PMP衍生化后，按照2.2.4項(xiàng)下條件注入到HPLC中進(jìn)行測(cè)定，得到單糖組分和各單糖峰面積，并據(jù)此計(jì)算了各單糖組分的含量、摩爾比和物質(zhì)的量比，結(jié)果分別見(jiàn)表7，表8和表9。

由表7和表8可知，8種單糖含量具有較大差異，其中甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖4種多糖含量較高，其含量為13.618、15.397、83.151、15.131 mg/g，分別占所有單糖組成比例的9.094%，11.451%，56.695%，和11.030%。由結(jié)果可知三葉青多糖均含有甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等8種單糖，但各組分在含量和組成比例上有明顯差異，說(shuō)明產(chǎn)地和生長(zhǎng)環(huán)境不同對(duì)于三葉青多糖的組成有較大影響。由表9可知三葉青中8中單糖平均物質(zhì)的量比為甘露糖:氨基葡萄糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖 =1.000:0.209:0.545:0.431:0.258:1.374:6.221:1.464，其中半乳糖所占的比例最高，表明三葉青多糖結(jié)構(gòu)組成特征是以半乳糖為主。以上結(jié)果為三葉青藥材及其多糖的鑒別提供了依據(jù)。

表7 不同產(chǎn)地三葉青多糖的單糖組成及含量 mg/g

表8 不同產(chǎn)地三葉青多糖中單糖的摩爾質(zhì)量百分?jǐn)?shù) %

表9 不同產(chǎn)地三葉青多糖中單糖的物質(zhì)的量比

3 討論

多糖是植物中的初生代謝產(chǎn)物，是一類高分子聚合物，其在植物中具有多種重要功能，是許多中草藥發(fā)揮藥效作用的主要物質(zhì)之一[22]。多糖也是三葉青中重要的活性物質(zhì)，已有研究表明，三葉青多糖具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗炎癥以及降血糖等[23-24]。多糖的生物活性與其組分緊密相關(guān)，不同組份組成的多糖，其藥理活性相差較大[25-26]，因此，控制多糖質(zhì)量至關(guān)重要，其中多糖中單糖組分測(cè)定是多糖質(zhì)量控制的主要指標(biāo)[11]。呂蘭等對(duì)優(yōu)化工藝提取后分離得到多糖進(jìn)行三氟乙酸水解，經(jīng)PMP柱前衍生化后液相色譜分析，測(cè)得的巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖等10種單糖[12]。雖然該研究測(cè)定出了三葉青多糖中更為完整的單糖組成，但對(duì)多糖結(jié)構(gòu)組成的研究不夠深入，并未對(duì)單糖含量差異進(jìn)一步測(cè)定和分析，而單糖含量彼此間的差異能反映出多糖的主要特征及其專屬性，有助于對(duì)多糖進(jìn)行質(zhì)量控制[27-28]。因此，本研究通過(guò)建立單糖指紋圖譜并分析主要單糖組成與含量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同批次藥材質(zhì)量的優(yōu)劣進(jìn)行鑒別研究。

續(xù)表7

本研究仍采用水提醇沉法提取多糖，通過(guò)測(cè)定三葉青中總多糖含量發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的三葉青總多糖含量差異較大，多糖純度為73.83%～ 87.36%，表明所得到的多糖純度較高，可用于多糖組成分析，測(cè)得所有三葉青多糖均包含葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖等8種單糖（圖2），但根據(jù)已有研究表明三葉青含有10種單糖[12]，分析原因是由于本實(shí)驗(yàn)所采用的多糖為經(jīng)α-淀粉酶除去三葉青中淀粉而得到的功能型多糖。對(duì)多糖進(jìn)行酸水解和PMP衍生化后建立了三葉青多糖的HPLC指紋圖譜并進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，根據(jù)分析可知產(chǎn)地不同對(duì)多糖中單糖組成成分影響較?。▓D3），并且根據(jù)綜合得分可知，遂昌的樣品質(zhì)量最好，溫州的次之。測(cè)定三葉青單糖含量發(fā)現(xiàn)，雖然不同產(chǎn)地的單糖組分并無(wú)區(qū)別，但其含量卻有較大差異。三葉青多糖包含的8種單糖中甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖4種單糖含量較高，并且半乳糖的含量最高，這表明三葉青多糖是以半乳糖為主的組成特征，是其中的主要組成成分。不同產(chǎn)地多糖含量差異主要體現(xiàn)在葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖三種單糖含量差異較大，表明不同產(chǎn)地的多糖結(jié)構(gòu)上可能存在差異。

本文建立了基于酸水解的三葉青多糖指紋圖譜并測(cè)定出其中單糖組成及其含量，雖然對(duì)于三葉青多糖結(jié)構(gòu)研究有一定參考意義，但關(guān)于多糖結(jié)構(gòu)的研究不夠深入，今后的研究可以采用甲基化分析多糖的糖苷鍵等結(jié)構(gòu)信息，以及將多糖酶解后建立起PACE糖譜來(lái)對(duì)三葉青多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，10個(gè)不同產(chǎn)地三葉青中以遂昌的質(zhì)量最佳，并且得到半乳糖在所有多糖組成中占比為56.695%，三葉青多糖結(jié)構(gòu)組成是以半乳糖為主。因此，本研究為三葉青多糖的鑒定及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)，這對(duì)完善三葉青產(chǎn)地的劃分及品種鑒別具有參考價(jià)值。