高效液相色譜法測(cè)定啶氧菌酯懸浮劑及水分散粒劑中有效成分含量

馬騰飛，賈孫悅，劉 琳，周 芹,3,4，高金勝

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150080；2黑龍江大學(xué)化學(xué)化工與材料學(xué)院，哈爾濱150080；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，哈爾濱150080；4農(nóng)業(yè)農(nóng)村部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

0 引言

啶氧菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥，是一類低毒、高效、廣譜的殺菌劑，20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)并且在90年代首次引入市場(chǎng)[1]，由于其良好的環(huán)境相容性，在短短十余年時(shí)間已成為農(nóng)用殺菌劑中的主流產(chǎn)品之一，銷售市場(chǎng)已超過(guò)三唑類，在各類殺菌劑中位列首席[2]。這類殺菌劑的活性位點(diǎn)是甲氧基丙烯酸（酯/酰胺），通過(guò)抑制真菌的線粒體呼吸鏈中細(xì)胞色素Bcl復(fù)合物活性，從而抑制線粒體的呼吸作用，阻斷電子傳遞，干擾真菌體內(nèi)的能量循環(huán)，抑制真菌的生長(zhǎng)[3]。

甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥主要包括啶氧菌酯、肟菌酯、醚菌酯、嘧菌酯[4]、吡唑醚菌酯[5]和烯肟菌胺等十余個(gè)品種[6]。啶氧菌酯化學(xué)名稱為(E)-3-甲氧基-2-{2-[6-(三氟甲基)-2-吡啶氧甲基]苯基}丙烯酸甲酯，主要用于防治麥類葉面病害[7]，如葉枯病、葉銹病、穎枯病、褐斑病、白粉病等[8]，與現(xiàn)有其他甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑相比，對(duì)小麥葉祜病、網(wǎng)斑病和云紋病有更強(qiáng)的治療效果[9]。在中國(guó)，啶氧菌酯還用于水稻稻曲病等病害的防治，其使用范圍和使用量正逐步上升。目前，對(duì)啶氧菌酯檢測(cè)主要集中在殘留的檢測(cè)[1,10-13]，Gao等[9]利用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜，前處理采取改良的QuEChERs方法，同時(shí)檢測(cè)辣椒中啶氧菌酯和吡唑醚菌酯含量，回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均滿足分析要求。勞斐等[14]建立了黃瓜中啶氧菌酯殘留量的檢測(cè)方法，當(dāng)添加濃度在0.02 mg/kg～ 0.10 mg/kg水平時(shí)，回收率在88.2%～ 101.9%之間，RSD值為1.2%～ 2.6%，該方法重現(xiàn)性好、靈敏度高、檢測(cè)限低。楊雅雅等[15]利用QuEChERs前處理，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用建立了蘋果中啶氧菌酯和四螨嗪的測(cè)定方法，簡(jiǎn)單快速，具有很好的精密度及準(zhǔn)確度。無(wú)論是色譜法[16-17]還是色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[9-10,13-15,18-20]的方法，都是針對(duì)啶氧菌酯殘留的檢測(cè)，基質(zhì)包括土壤和植株等等，制劑的有效成分檢測(cè)方法則報(bào)道較少。而隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)和使用技術(shù)的發(fā)展，中國(guó)農(nóng)藥產(chǎn)品已由單一品種向復(fù)配農(nóng)藥轉(zhuǎn)化，且農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量也參差不齊，還有部分農(nóng)藥企業(yè)在產(chǎn)品中添加標(biāo)示外的農(nóng)藥成分，給檢測(cè)部門帶來(lái)了一定的困難。中國(guó)《農(nóng)藥管理?xiàng)l例》對(duì)假農(nóng)藥做了嚴(yán)格規(guī)定：農(nóng)藥所含有效成分種類與農(nóng)藥的標(biāo)簽、說(shuō)明書標(biāo)注的有效成分不符，一律認(rèn)定為假農(nóng)藥[21]。所以，對(duì)制劑有效成分的檢測(cè)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題在于建立一種方法可以同時(shí)適用于啶氧菌酯懸浮劑（suspension concentrate，簡(jiǎn)寫為SC）及水分散粒劑（water dispersable granule，簡(jiǎn)寫為WG）中有效成分的檢測(cè)，采用反相高效液相色譜法，通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相比例、波長(zhǎng)掃描、純度檢驗(yàn)等等，建立的方法完全滿足上述要求，用于具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，同時(shí)，為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀：Aglient1260，二極管陣列監(jiān)測(cè)器(DAD)。色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或色譜工作站。色譜柱：250 mm×4.6 mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝Waters Symmetry-C18、5 μm 填充物。過(guò)濾器 ：濾膜孔徑約0.45 μm。微量進(jìn)樣器：50 μL。定量進(jìn)樣管：5 μL。KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，密理博純水器(Millipore,El Passo,TX,USA)。

1.1.2 試劑 乙腈：色譜純；水：新蒸二次蒸餾水或超純水；啶氧菌酯標(biāo)樣：已知啶氧菌酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%(TM standard)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜條件 流動(dòng)相:Ψ（乙腈:水）=80:20，經(jīng)濾膜過(guò)濾，并進(jìn)行脫氣；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣體積：5μL。

1.2.2 測(cè)定步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取0.05 g（精確至0.000 1 g）啶氧菌酯標(biāo)樣于100 mL容量瓶中，加入20 mL乙腈，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。

（2）試樣溶液的制備

稱取含0.05 g（精確至0.000 1 g）啶氧菌酯的試樣于100mL容量瓶中，加入20mL乙腈，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾。

（3）測(cè)定

在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰兩針啶氧菌酯峰面積相對(duì)變化小于1.2%時(shí)，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 吸收波長(zhǎng)的選擇 啶氧菌酯分子內(nèi)含有不飽和的共軛雙鍵，所以在紫外區(qū)具有吸收，為了獲得啶氧菌酯的最大吸收波長(zhǎng)，利用高效液相色譜配置的二極管陣列檢測(cè)器，在紫外區(qū)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(200～ 400 nm)。結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出啶氧菌酯的最大吸收波長(zhǎng)約在220 nm，在該波長(zhǎng)處?kù)`敏度較高，干擾較少，能夠滿足分析的要求，故將檢測(cè)波長(zhǎng)確定為220 nm。

圖1 啶氧菌酯的紫外光譜圖

2.1.2 色譜柱及流動(dòng)相的選擇 根據(jù)啶氧菌酯的性質(zhì)，色譜柱選擇常用的C18反相柱。反相液相色譜最常用的溶劑包括甲醇、乙腈等等，雖然啶氧菌酯在甲醇中溶解度較大[22]，但是在波長(zhǎng)220 nm的情況下，甲醇的紫外吸收對(duì)目標(biāo)物會(huì)產(chǎn)生干擾，所以綜合考慮選擇乙腈作為溶劑溶解樣品，并以乙腈和水作為流動(dòng)相。隨著乙腈比例的增加，保留時(shí)間減小，最終的比例選擇（乙腈:水）=80:20，流速1.0 mL/min。該條件下，啶氧菌酯色譜峰峰形較好（圖2～ 圖3），與雜質(zhì)能完全分離，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，并且分析時(shí)間較短。

圖2 啶氧菌酯水分散粒劑HPLC圖

圖3 啶氧菌酯懸浮劑HPLC圖

2.2 峰純度檢驗(yàn)

在色譜分析中，色譜峰的純度鑒定對(duì)于復(fù)雜物質(zhì)的分析具有重要的意義[23]。利用高效液相色譜的二極管陣列檢測(cè)器（簡(jiǎn)寫為PDA或者DAD）可以實(shí)現(xiàn)對(duì)峰純度的檢測(cè)，本試驗(yàn)采用HPLC-DAD峰純度分析法來(lái)鑒別啶氧菌酯。50%啶氧菌酯水分散粒劑和22.5%啶氧菌酯懸浮劑中的啶氧菌酯HPLC-PDA峰純度因子均大于950，啶氧菌酯不存在同分異構(gòu)體，所以有效成分處無(wú)其他物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。峰純度色譜圖見(jiàn)圖4～ 圖5。

圖4 50%啶氧菌酯水分散粒劑HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖5 22.5%啶氧菌酯懸浮劑HPLC-DAD峰純度色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法的線性范圍 按1.2.1標(biāo)樣溶液的制備方法配制5個(gè)不同濃度的有效成分線性相關(guān)溶液，分別標(biāo)記為STD1～ STD5。在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，按照STD1～ STD5的順序測(cè)定每個(gè)溶液中啶氧菌酯的峰面積，取2次測(cè)定的平均結(jié)果。以啶氧菌酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖6可以看出，當(dāng)啶氧菌酯質(zhì)量濃度在100.1～ 1000.8 mg/L之間（進(jìn)樣體積5μL），與相應(yīng)的啶氧菌酯峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，計(jì)算得回歸方程為y=9827.8x+6154.3，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，完全可以滿足定量分析要求。

圖6 啶氧菌酯峰面積與質(zhì)量濃度關(guān)系圖

2.3.2 方法精密度試驗(yàn) 精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或者相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示，本實(shí)驗(yàn)對(duì)同一種農(nóng)藥制劑進(jìn)行了5次測(cè)定，計(jì)算結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。按1.2.2試樣溶液的制備方法分別配制5個(gè)22.5%啶氧菌酯懸浮、5個(gè)50%啶氧菌酯水分散粒劑精密度溶液，分別標(biāo)記為SC-A1至SC-A5、WG-A1至WGA5。分別以STD-SC-A、STD-WG-A為標(biāo)樣溶液，在上述色譜操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、精密度溶液、精密度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1～ 表2。

農(nóng)藥測(cè)定和分析方法中，數(shù)據(jù)結(jié)果的合格性應(yīng)以修改的Horwitz公式(2(1-0.51ogC)×0.67)為依據(jù)[24]，RSD值小于這個(gè)修正值通常被認(rèn)為是合格的。從表1、表2可以看出，22.5%啶氧菌酯懸浮劑中啶氧菌酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果的RSD為1.31%，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=2.09（其中C=0.2274），50%啶氧菌酯水分散粒劑中啶氧菌酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果的RSD為0.69%，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.65，（其中C=0.5053），表明有效成分分析方法精密度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

表1 22.5%啶氧菌酯懸浮劑中啶氧菌酯精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 50%啶氧菌酯水分散粒劑中啶氧菌酯精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 方法準(zhǔn)確度試驗(yàn) 利用在農(nóng)藥制劑中添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法來(lái)驗(yàn)證方法的回收率，分別稱取含0.025 g（精確至0.000 1 g）啶氧菌酯的22.5%啶氧菌酯懸浮劑、50%水分散粒劑于100 mL容量瓶中，再分別加入啶氧菌酯標(biāo)樣0.025 g（精確至0.00001 g），按試樣溶液的制備方法配制5個(gè)有效成分準(zhǔn)確度溶液，標(biāo)記為SCB1～ SC-B5、WG-B1～ WG-B5。以STD-B為標(biāo)樣溶液，在上述液相色譜操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、準(zhǔn)確度溶液、準(zhǔn)確度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3～ 表4。

表3 22.5%啶氧菌酯懸浮劑回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 50%啶氧菌酯水分散粒劑回收率試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，22.5%啶氧菌酯懸浮劑中啶氧菌酯平均回收率為100.64%，50%啶氧菌酯水分散粒劑中啶氧菌酯平均回收率為99.74%，具有良好的準(zhǔn)確度。

2.3.4 不同實(shí)驗(yàn)室方法驗(yàn)證 為了驗(yàn)證建立的方法在不同實(shí)驗(yàn)室的適用性，分別在3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，22.5%啶氧菌酯懸浮劑、50%啶氧菌酯水分散粒劑重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.8052%、0.6003%，再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDR分別0.8560%、1.5625%，都小于相應(yīng)的Horwitz公式理論計(jì)算值，表明不同單位間的檢測(cè)結(jié)果符合性良好，本研究報(bào)告建立的啶氧菌酯液相色譜分析方法可以滿足日常檢測(cè)工作需要。

表5 不同實(shí)驗(yàn)室方法驗(yàn)證結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

3 結(jié)論與討論

目前的研究結(jié)果主要集中在啶氧菌酯殘留的檢測(cè)方面，對(duì)于農(nóng)藥制劑的有效成分報(bào)道較少，采用同一種方法進(jìn)行啶氧菌酯兩種制劑有效成分的測(cè)定則未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器，乙腈溶解樣品，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，乙腈-水作為流動(dòng)相，等度洗脫，建立了在同一條件下啶氧菌酯水分散粒劑及懸浮劑的測(cè)定方法。

高效液相色譜測(cè)定波長(zhǎng)一般利用二極管陣列監(jiān)測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得出樣品溶液的最大吸收波長(zhǎng)，除此之外，還要避開(kāi)其它物質(zhì)的干擾。本實(shí)驗(yàn)選用220 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)處響應(yīng)值最高，干擾較小。并進(jìn)行了色譜峰特異性檢驗(yàn)（純度檢驗(yàn)），多數(shù)情況下，純度檢驗(yàn)可以輔助人們進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)[26]。不同物質(zhì)具有不同的紫外吸收光譜，但是對(duì)于具有手性對(duì)映異構(gòu)體的物質(zhì)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)色譜峰純度的檢測(cè)。鑒于啶氧菌酯不存在手性異構(gòu)體，可以通過(guò)純度檢查色譜峰是否為單一物質(zhì)峰。本實(shí)驗(yàn)中峰純度均滿足要求。

農(nóng)藥制劑有效成分的提取一般會(huì)考慮各方面的影響因素[25]，首先根據(jù)農(nóng)藥在不同溶劑中的溶解度，其次要兼顧液相色譜所用的流動(dòng)相及吸收波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑溶解樣品。實(shí)際上，啶氧菌酯在甲醇中的溶解度高于乙腈，而且甲醇的成本相對(duì)較低，所以，首先選用甲醇溶解樣品，但是由于甲醇存在干擾，色譜峰峰形較差，而且實(shí)驗(yàn)中選用的波長(zhǎng)為220 nm，為了減小對(duì)目標(biāo)物的干擾，最終選擇乙腈溶解樣品。在反向色譜柱方法開(kāi)發(fā)中，廣泛使用的兩種常見(jiàn)的流動(dòng)相是甲醇和乙腈。用甲醇做流動(dòng)相，紫外波長(zhǎng)需要設(shè)置大于230 nm，而乙腈則大于210 nm即可。另外從色譜峰形上來(lái)看，乙腈的粘度較甲醇小，從速率方程角度說(shuō)，流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗小，有利于柱效提高，色譜峰較窄，峰形較好。啶氧菌酯保留時(shí)間在6 min左右。本方法具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間、靈敏度高、準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，目前正在探索多種農(nóng)藥制劑有效成分的聯(lián)合檢測(cè)方法，以期獲得更高的效率。

本研究建立的啶氧菌酯的測(cè)定方法，兩種制劑中啶氧菌酯的回收率分別為100.64%、99.74%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值分別為1.31%、0.69%。準(zhǔn)確度、精密度、RSD值均滿足分析要求，適用于啶氧菌酯水分散粒劑及懸浮劑中有效成分的測(cè)定。