正交法優(yōu)化‘胭脂蘿卜’紅色素超聲提取工藝

彭 華，宋 霞，張 春

（1四川旅游學院旅游文化產(chǎn)業(yè)學院，成都610100；2四川旅游學院旅游農(nóng)業(yè)發(fā)展研究中心，成都610100；3西南醫(yī)科大學藥學院，四川瀘州646000）

0 引言

蘿卜(Raphanus sativusL.)屬于十字花科蘿卜屬植物，是一年生或二年生植物，在中國分布廣泛，種類繁多[1]。‘胭脂蘿卜’是重慶市涪陵區(qū)兩江交匯處特有的地方蘿卜品種，據(jù)記載已有100多年的歷史，它的肉質(zhì)根和根皮均為深紅色，富含蘿卜紅色素，是提取天然紅色素的好原料[2]。蘿卜紅色素的主要成分為天竺葵素的葡萄糖酐衍生物，為花色素苷類物質(zhì)，其水溶液最大吸收波長在530 nm處[3-4]。蘿卜紅色素具有純天然無毒害、生產(chǎn)成本低、周期短、來源豐富以及有一定的營養(yǎng)和藥效價值等特點，適合用于食品、醫(yī)療、美妝、服裝等行業(yè)的添加劑和染色劑，是中國規(guī)定可以使用的天然食用色素之一[5-9]。

目前關(guān)于蘿卜紅色素的研究主要集中在色素提取工藝、分子合成機制及理化性質(zhì)等方面[10-11]。在紅色素提取方面，研究表明蘿卜紅色素易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑，在溫度大于60℃和陽光照射下穩(wěn)定性會降低，而酸性條件下穩(wěn)定性較高[12-14]。除常規(guī)浸提法外，超臨界CO2萃取法[15]、微波提取法[16]和超聲波輔助法[17]等輔助方法的運用能夠一定程度的提高蘿卜紅色素得率。前人曾經(jīng)嘗試提取‘涪陵胭脂蘿卜’紅色素，但由于條件有限，制得的產(chǎn)物易結(jié)塊且蘿卜氣味較大[17]。目前的研究主要集中于提高蘿卜紅色素的穩(wěn)定性以及有效的去除蘿卜味，對‘胭脂蘿卜’提取工藝系統(tǒng)化及比較分析研究較少[18]。在提取工藝優(yōu)化的研究中運用乙醇、乙酸等單一溶劑較多[19-21]，而多種溶劑配合運用的研究較少，因此，胭脂蘿卜紅色素提取工藝優(yōu)化的研究值得進一步深入。

本研究采用超聲波輔助提取法提取‘胭脂蘿卜’紅色素，研究了乙醇、鹽酸、丙酮和鹽酸-丙酮復合溶液提取劑、料液比、提取溫度和提取時間對‘胭脂蘿卜’紅色素吸光值的影響，并對幾個蘿卜種質(zhì)的紅色素提取液吸光值進行了比較研究，為‘胭脂蘿卜’紅色素的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗選用了7個不同肉質(zhì)顏色的蘿卜，分別為‘野生蘿卜’、‘西昌白蘿卜’、‘大紅袍’、‘紅心 1 號’、‘胭脂紅1號’、‘胭脂紅2號’和‘罐罐蘿卜’。其中‘胭脂紅2號’用于紅色素提取工藝優(yōu)化研究。試驗于2019年12月—2020年5月在四川旅游學院烹飪科學重點實驗室進行。

1.2 試劑與儀器

濃鹽酸、無水乙醇、丙酮等均為分析純，購自成都市科龍化工試劑廠。試驗主要使用的化學儀器列于表1。

表1 試驗主要儀器

1.3 蘿卜紅色素提取、測定流程

取‘胭脂紅2號’肉質(zhì)根洗凈，切成厚約1 mm的薄片，烘干至恒重后粉碎，制得胭脂蘿卜干碎片。準確稱取1.000 g的上述碎片置于離心管中，量取一定量的提取液，放入超聲波清洗機中在一定溫度條件下浸提一定時間，將浸提液于3000 r/min離心3 min，取上清定容至25 mL，于波長530 nm下測定吸光值。

1.4 提取液的選擇

提取液分別為乙醇和丙酮的體積分數(shù)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%水溶液，鹽酸的質(zhì)量分數(shù)3.6%、7.2%、10.8%、14.4%、18.0%、21.6%、25.2%、28.8%、32.4%、36.0%水溶液。以上述溶液為提取液，超聲浸提條件為50℃浸提20 min，采用1.3所述流程進行色素提取并測定吸光值。

1.5 提取條件的選擇

研究料液比、提取溫度、超聲頻率對‘胭脂蘿卜’紅色素提取率的影響，首先做單因素試驗考察以上條件對提取率的影響，然后采用正交試驗法優(yōu)化最佳工藝條件。

1.5.1 提取液配比的選擇 將10.8%的鹽酸溶液和30%丙酮溶液配制成比例分別為1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的溶液作為提取液，取10 mL加入離心管中，稱取蘿卜碎片1.000 g加入離心管，超聲浸提條件為50℃浸提20 min，按1.3中結(jié)所述流程提取色素并測量吸光值，重復3次。

1.5.2 料液比的選擇 稱取蘿卜碎片1.000 g，取1.5.1中研究所得的最適提取液2 mL（料液比1:2 g/mL），4 mL（料液比1:4 g/mL），6 mL（料液比1:6 g/mL），8 mL（料液比1:8 g/mL），10 mL（料液比1:10 g/mL），12 mL（料液比1:12 g/mL）加入離心管，超聲浸提條件為50℃浸提20 min，按1.3小節(jié)所述流程提取色素、定容并測量吸光值，重復3次。

1.5.3 提取溫度的選擇 取1.5.1中所得的最適提取液10 mL加入離心管中，稱取蘿卜碎片1.000 g加入離心管，設(shè)置提取溫度為20、30、40、50、60℃，浸提20 min，按1.3中所述流程提取色素并測量吸光值，重復3次。

1.5.4 提取時間的選擇 取1.5.1中所得的最適提取液10 mL加入離心管中，稱取蘿卜碎片1.000 g加入離心管，設(shè)置提取時間為20、40、60、80、100 min，超聲浸提條件為50℃，按1.3中所述流程提取色素并測量吸光值，重復3次。

1.5.5 正交試驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，為了獲得提取蘿卜紅色素的最佳工藝條件，采用正交設(shè)計法，選用正交設(shè)計表L16(45)進行表頭設(shè)計，共設(shè)3個因素，分別為提取液配比、料液比、提取溫度。按各試驗號依次完成試驗，每個試驗號設(shè)3次重復，以3次重復的吸光值進行正交分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Office Excel 356進行數(shù)據(jù)的整理和作圖，利用DPS 7.05軟件進行統(tǒng)計分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 提取液的選擇 乙醇浸提從0%～ 30%呈上升趨勢，30%～ 100%呈下降趨勢，因此，乙醇溶液浸提蘿卜紅色素的最適濃度為30%。鹽酸浸提從0%～ 3.6%呈上升趨勢，但3.6%～ 36.0%之間只有輕微變化，因此確定鹽酸提取蘿卜紅色素的最適濃度為3.6%。丙酮浸提從0%～ 30%呈上升趨勢，30%～ 100%呈下降趨勢，因此丙酮浸提蘿卜紅色素的最適濃度為30%（圖1）。3種溶劑浸提蘿卜紅色素效果的順序為：鹽酸＞丙酮＞乙醇，其中鹽酸濃度為10.8%時吸光值最高，為2.054，乙醇和丙酮濃度為30%時吸光值最高，分別為1.428和1.105。

圖1 不同濃度鹽酸、乙醇和丙酮對蘿卜紅色素提取液吸光值的影響

2.1.2 提取液配比的選擇 為了進一步提高提取率，嘗試將濃度均為10.8%的鹽酸溶液和30%的丙酮溶液按比例1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1配置成提取液進行試驗。結(jié)果表明，不同鹽酸和丙酮溶液的比例在1:9到5:5的過程中提取效率越來越高，在5:5到9:1的過程中，吸光值依次下降，所以我們可以得到浸提蘿卜紅色素效果最適比例為5:5（圖2）。并且高于單獨使用鹽酸或丙酮。故選定3:7、4:6、5:5、6:4為正交試驗的4個水平。

圖2 提取液配比對吸光值的影響

2.1.3 料液比的選擇 溶劑的用量過低，因蘿卜紅色素飽和而提取不完全，導致提取率偏低；溶劑用量過大，提取液中有效成分的濃度降低，導致提取效率降低，還會造成溶劑的浪費[23-24]。在控制時間和浸提溫度不變的條件下，考察不同料液比對浸提蘿卜紅色素的影響，料液比從1:2降低到1:6的過程中提取液的吸光值增加，從1:6降低到1:12的過程中，提取液的吸光值逐漸減少（圖3）。料液比在1:6時浸提到的蘿卜紅色素含量最高，故選定1:4、1:6、1:8、1:10 g/mL為正交試驗料液比的4個水平。

圖3 料液比對吸光值的影響

2.1.4 提取溫度的選擇 溫度對提取率的影響主要有2方面，一方面能提高色素在提取液中的溶解度，另一方面高溫下色素自身分解，鹽酸和丙酮會加速揮發(fā)，從而降低色素在提取液中的溶解度[25]。由圖4可知，隨著提取溫度的提高，提取率呈先增大再持平后減小的趨勢，當提取溫度為50℃時，提取率較高，60℃時提取率下降。因此，選定30、40、50、60℃為正交試驗提取溫度的4個水平。

圖4 提取溫度對吸光值的影響

2.1.5 提取時間的選擇 考察提取時間對浸提液吸光值的影響，結(jié)果表明浸提的時間從20～ 100 min的過程中，吸光值呈下降趨勢，說明紅色素溶于鹽酸丙酮溶液的速度很快，20 min已經(jīng)能夠達到最大值。從20～ 60 min的過程中，下降的較為明顯，60～ 100 min變化不太明顯（圖5）。降低的原因可能是提取時間過長增加鹽酸和丙酮蒸發(fā)，從而降低色素在提取液中的溶解度。由數(shù)據(jù)分析可得出蘿卜紅色素浸提的最適時間為20 min。

圖5 提取時間對吸光值的影響

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取試驗提取液配比、料液比、提取溫度等3項因素中有意義的水平確定正交試驗方案（表2）。試驗完成后，對結(jié)果進行方差分析，計算各因素平均值和極差，以確定最佳的提取條件。

表2 正交試驗方案及結(jié)果

正交試驗的直觀分析結(jié)果列于表3～ 表5。由表3方差分析表明，提取液配比對吸光值影響達顯著水平，料液比、提取溫度和料液比×溫度互作對吸光值影響達極顯著水平，而料液比×提取液配比互作對吸光值的影響不顯著。因此，有必要對料液比、提取溫度、提取液配比和料液比×溫度互作進行因素內(nèi)多重比較。同因素中不同水平的結(jié)果均值反映了不同水平在該因素中對結(jié)果的影響，極差的大小反映了該因素的變化對結(jié)果影響的大小，由此可見對吸光值的影響從大到小依次為提取溫度、料液比、料液比×溫度互作和提取液配比。

表3 正交試驗方差分析表

2.2.1 料液比對吸光值的影響 料液比的極差分析結(jié)果在5個因素中居第2位，因此，試驗中優(yōu)化料液比是保證高提取率的重要因素。表4顯示，當料液比為水平3即1:8時吸光值最大，因素內(nèi)的多重比較表明，水平3（料液比=1:8）與水平2（料液比=1:6）達顯著差異，與水平4（料液比=1:10）和水平1（料液比=1:4）差異達極顯著水平。因此料液比選擇水平3（料液比=1:8）為宜。.

2.2.2 提取溫度對吸光值的影響 提取溫度的極差分析結(jié)果在5個因素中居第1位，因此，試驗中優(yōu)化提取溫度是保證高提取率的首要因素。表4顯示，當提取溫度為水平3即50℃時吸光值最大，因素內(nèi)的多重比較表明，水平3與其他水平相比均達極顯著差異，因此50℃是提取溫度的最佳選擇。此外，正交分析結(jié)果表明料液比×溫度互作對吸光值的影響極顯著，可能是由于溫度影響了紅色素的溶解度，在高料液比的情況下，溶液飽和后溫度越高，紅色素溶解度越高，從而吸光值越高。二者互作的極差分析結(jié)果在5個因素中居第3位，對吸光值的影響低于提取溫度和料液比，因此不必考慮兩者互作對最優(yōu)提取條件的影響。

表4 因素均值表

2.2.3 提取液配比對吸光值的影響 由表5可知，鹽酸丙酮提取液配比和料液比×提取液配比互作的極差在5個因素中是最小的2個，比另外3個因素少了1個數(shù)量級，說明酸化丙酮提取液配比和料液比×提取液配比互作對吸光值的影響是5個因素中最小的。由表4可知，提取液配比的4個水平中，水平3即鹽酸：丙酮=5:5的吸光值是最大的，因素內(nèi)的多重比較表明，水平3和水平2（鹽酸：丙酮=4:6）、水平 4（鹽酸：丙酮=6:4）差異不顯著，和水平1（鹽酸：丙酮=3:7）差異顯著。因此，10.8%鹽酸：30%丙酮=6:4、4:6和5:5均可作為提取液配比的配方。

表5 因素極差表

綜上，提取‘胭脂蘿卜’紅色素的條件可優(yōu)化為：提取料液比取1:8，提取溫度取50℃，提取液選用鹽酸丙酮提取液，其配比為10.8%的鹽酸:30%的丙酮=1:1，提取時間選20 min。但這個處理組合不在正交設(shè)計試驗中，故進一步以該組合做補充實驗。結(jié)果表明，3次重復的平均吸光值為2.311，高于正交試驗中吸光值最高的7號處理，證實了試驗得出的理想組合確實是最佳組合。

2.3 不同顏色蘿卜紅色素含量

用優(yōu)化后的方法提取并比較了7個蘿卜品種蘿卜根皮和蘿卜肉質(zhì)根的紅色素提取液的吸光值。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，各材料間的吸光值存在顯著或極顯著差異，且吸光值和蘿卜顏色關(guān)系密切，即目測顏色較深的蘿卜，吸光值也較大，白蘿卜的吸光值最低（表6）。此外，數(shù)據(jù)表明蘿卜根皮的吸光值高于蘿卜肉質(zhì)根的吸光值，說明蘿卜根皮的紅色素含量高于肉質(zhì)根。

表6 不同蘿卜品種紅色素提取液吸光值

3 結(jié)論與討論

浸提法是蘿卜紅色素的主要獲取方法之一，蘿卜紅色素在酸性條件下具有較好的穩(wěn)定性且易溶于極性分子，采用浸提法提取蘿卜紅色素常用的溶劑主要有乙酸、水、檸檬酸、乙醇等極性和酸性溶劑，最高產(chǎn)率能達到3%左右[26]。本研究在前人對各種溶劑篩選的基礎(chǔ)上，試圖通過復合溶劑進一步提高蘿卜紅色素的提取率，結(jié)果表明在本研究條件下，鹽酸丙酮復合溶劑所得的紅色素提取液的吸光值高于僅用鹽酸或丙酮的吸光值。前人研究表明，復合溶液提取可以獲得更高的提取率，張晶晶[27]研究發(fā)現(xiàn)0.15 mol/L鹽酸-65%乙醇復合溶劑提取彩葉草色素的效果最佳，于開源等[28]研究表明乙醇:水:石油醚=1:2:6混合溶劑是提取南瓜β-胡蘿卜色素的最優(yōu)溶劑，本研究結(jié)果說明蘿卜紅色素提取率可以通過復合溶劑得到進一步提高，這是對前人研究結(jié)果在蘿卜紅色素提取上的擴展，也為進一步提高蘿卜紅色素提取的效率提供了參考。熊勇等[14]以檸檬酸溶液為溶劑，提出蘿卜紅色素最佳提取工藝條件為：提取溫度為43.07℃、提取pH 2.88、提取時間為3.65 h、料液比為1:4，在此條件下提取率為65.21%。閆亞茹等[29]通過熱水浸提法篩選提取蘿卜紅色素的最佳條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當提取溫度達到65℃、提取時間100 min、提取料液比為35:1時，提取的效率最高，三者對蘿卜紅色素的提取效率影響力度為提取時間＞提取料液比＞提取溫度。本研究結(jié)果表明，提取液配比對吸光值影響達顯著水平，料液比、提取溫度對吸光值影響達極顯著水平，對吸光值的影響從大到小依次為提取溫度、料液比和提取液配比。在提取料液比取1:8，提取溫度取50℃，提取液選用鹽酸丙酮提取液，其配比為10.8%的鹽酸:30%的丙酮=1:1，提取時間選20 min的條件下，紅色素提取液吸光值最高，但由于與前人研究所用蘿卜原材料和提取溶劑不盡一致，故本研究與前人所得結(jié)論存在一定差異。

本研究還利用優(yōu)化后的提取工藝對紅心蘿卜種質(zhì)資源進行了評價，發(fā)現(xiàn)7份蘿卜種質(zhì)中以‘胭脂紅2號’色素含量最高，蘿卜根皮的色素含量比肉質(zhì)根更高，該結(jié)果為蘿卜紅色素進一步開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。