環(huán)狀RNAs 與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞潛在關(guān)系的研究

王 杰，劉 健，文建庭，王 馨，杜新雷

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽合肥 230031）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種主要在老年人中出現(xiàn)的慢性自身免疫性疾?。?］，其中骨破壞是在RA 病程中一直伴隨的病理改變，是RA 患者致畸致殘的主要原因［2］，大部分RA 患者破骨細(xì)胞途徑被異常的免疫狀態(tài)激活，并伴有慢性炎癥，導(dǎo)致關(guān)節(jié)周?chē)琴|(zhì)疏松和局部骨質(zhì)破壞［3］。此外，研究表明骨髓破環(huán)是RA 骨破壞發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，RA 患者骨髓中有大量的免疫細(xì)胞形成類(lèi)似生發(fā)中心的聚集物，可發(fā)生“關(guān)節(jié)外”的病理過(guò)程［4］。

經(jīng)大量研究證實(shí)，非編碼RNAs（ncRNAs）在炎癥和自身免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，主要包括microRNA（miRNAs）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）和環(huán)狀RNA（circRNAs）［5］。其中，lncRNAs 指長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸且沒(méi)有蛋白編碼能力的RNA［6］，與RA 發(fā)展也有重要聯(lián)系，目前已發(fā)現(xiàn)大量的lncRNAs 在RA 中表達(dá)異常，并與RA 的疾病活動(dòng)性相關(guān)［7］。Liu 等［8］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)lncRNACASC2過(guò)表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)IL-17 降低RA 免疫炎癥以達(dá)到緩解RA 癥狀的作用。

circRNAs 已被發(fā)現(xiàn)是免疫系統(tǒng)中重要的基因調(diào)節(jié)器，與自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［9］。在20 世紀(jì)70 年代，首次在植物病毒中發(fā)現(xiàn)了閉合環(huán)狀的RNA，無(wú)游離端。此外，circRNAs 在樣品加工過(guò)程中容易被選擇性富集，使它們比其他類(lèi)型的RNA 更適合作為生物標(biāo)志物［10］。

1 circRNAs 概述

1.1 circRNAs 結(jié)構(gòu)特征

目前相比較于其它ncRNAs，人們對(duì)circRNAs了解非常少。circRNAs 是沒(méi)有5'帽子和3'poly（A）尾巴結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵形成的環(huán)狀單鏈。這些獨(dú)特的單鏈分子是通過(guò)在多種真核和原核生物甚至病毒中對(duì)pre-mRNA 進(jìn)行反剪接而產(chǎn)生的。circRNAs不僅通過(guò)調(diào)節(jié)miRNAs 和蛋白質(zhì)活性，還通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄或剪接，在分子途徑的調(diào)節(jié)中起著重要作用［11］。目前，隨著深度RNA 測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)和新型生物信息學(xué)方法的發(fā)展，已經(jīng)有超過(guò)3 萬(wàn)個(gè)環(huán)狀RNAs 被鑒定出其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，并因其高度的生物學(xué)和功能價(jià)值而受到越來(lái)越多的關(guān)注。circRNAs 對(duì)外切酶RNase R 具有抗性，比lncRNAs 更容易保持穩(wěn)定性。

1.2 circRNAs 常見(jiàn)分類(lèi)

目前circRNAs 根據(jù)基因組的來(lái)源以及構(gòu)成序列可分為4 種類(lèi)型：（1）大部分是外顯子來(lái)源的circRNAs（exonic circ RNAs，ecircRNAs）；（2）小部分是內(nèi)含子來(lái)源的circRNAs（intronic circRNA，ciRNAs）；（3）還有一部分是外顯子和內(nèi)含子共同形成的circRNAs（exon-intron circ RNA，EIciRNAs）；（4）最后一類(lèi)是來(lái)自于基因內(nèi)和基因間的circRNAs［12，13］。

1.3 circRNAs 在生物體內(nèi)的功能

部分含有miRNA 結(jié)合位點(diǎn)的circRNAs 被稱為“超級(jí)海綿”，主要是由于其與其他競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNAs（ceRNAs）相比，更能與miRNA 相互作用，調(diào)節(jié)其生物學(xué)功能，從而影響其下游靶基因的表達(dá)和功能［12，14］。例如circRNA002136 可以通過(guò)miR138靶向調(diào)節(jié)CTLA-4 和PD-1，從而成為潛在的免疫治療靶點(diǎn)［15］；circRNA0076248 可通過(guò)調(diào)控miR-181a介導(dǎo)的p53 和SIRT1 的表達(dá)參與免疫應(yīng)答［16］。

2 骨破壞是RA 的重要病理特征

RA 的癥狀主要是伴有關(guān)節(jié)軟骨和骨骼破壞的滑膜炎［17］，其是導(dǎo)致成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間代謝不平衡、骨吸收增加、骨組織遭受破壞的重要原因［18］。正常人體骨代謝是一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)，主要由骨破壞和骨吸收共同維持。RA 患者的骨破壞與病程進(jìn)展相互作用、相互影響，造成破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞功能紊亂，動(dòng)態(tài)水平失衡，進(jìn)而加重骨質(zhì)破壞［19］。因此在研究RA 骨破壞時(shí)，需重點(diǎn)關(guān)注RA患者成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的功能活動(dòng)，以及骨髓干細(xì)胞的的分化等情況。

3 circRNAs 與RA 的關(guān)系

circRNAs是一類(lèi)新型的RNA，可作為臨床血液標(biāo)本的生物標(biāo)志物。然而，circRNAs在RA中的作用還沒(méi)有得到廣泛的研究。 Luo 等［20］研究表明circRNA0000175、circRNA0008410 以及circRNA0000175和circRNA0008410聯(lián)合檢測(cè)可提高RA的診斷準(zhǔn)確率。此外，circRNA0000175和circRNA0008410 的表達(dá)水平與RA 的疾病活動(dòng)性和嚴(yán)重程度相關(guān)。根據(jù)Wen等［21］研究發(fā)現(xiàn)RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中circRNA0001200、circRNA0001566、circRNA0003972和circRNA0008360 的表達(dá)可能是RA 診斷的潛在生物標(biāo)志物，這些circRNAs 可能影響RA 的發(fā)生發(fā)展。因此可以認(rèn)為將來(lái)RA 的診斷以及疾病發(fā)展程度可以從circRNAs入手。

4 circRNAs 與RA 骨破壞的潛在關(guān)系

4.1 circRNAs 與成骨細(xì)胞分化

骨是一種極具活力的組織，其一生中都在經(jīng)歷不斷的重塑，但由于骨破壞或缺損，骨的再生或增強(qiáng)能力難以持續(xù)。骨的穩(wěn)態(tài)是由多個(gè)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在一個(gè)連續(xù)的吸收和形成周期中維持的［22］。

目前對(duì)circRNAs 在骨形成過(guò)程中調(diào)控機(jī)制尚不清楚，研究較少。Zhang 等［23］研究circRNAs 在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中出現(xiàn)的表達(dá)譜時(shí)，發(fā)現(xiàn)抑制circRNAIGSF11 的表達(dá)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，增加了miR-199b-5p 的表達(dá)。故可以認(rèn)為circRNAmiRNA 可以在一定程度上對(duì)骨髓干細(xì)胞的成骨分化具有促進(jìn)功能。有研究將人骨髓間質(zhì)細(xì)胞在成骨或成軟骨培養(yǎng)基中維持7 d，利用RNA 雜交陣列鑒定哪些circRNAs 差異表達(dá)［24］。研究發(fā)現(xiàn)在早期軟骨形成中，起源于SMYD3 基因的circRNAs 可能發(fā)揮重要作用，導(dǎo)致miR-181a-5p、miR-181b-5p 和miR-671-5p 高表達(dá)。然而，由于SMYD3 蛋白已經(jīng)與miRNA 的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)，這種關(guān)聯(lián)是否通過(guò)miRNA 海綿活性的降低而存在還有待證實(shí)。

Qian 等［25］檢測(cè)在BMP2 誘導(dǎo)MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化前后circRNAs 的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circRNA19142、circRNA5846 不僅通過(guò) miRNAmRNA 影響成骨分化過(guò)程，還與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、Wnt 信號(hào)通路等有潛在聯(lián)系。Ouyang 等［26］采用堿性磷酸酶和茜素紅染色法檢測(cè)circRNA0074834對(duì)骨髓干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)circRNA0074834 通過(guò)miRNA-942-5p 作為調(diào)節(jié)ZEB1和VEGF 表達(dá)的ceRNA，可以促進(jìn)成骨分化。Wen等［27］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)circRNA0076906 通過(guò)調(diào)節(jié)miR-1305/ OGN 通路，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，從而達(dá)到緩解骨破壞的目的。

上述5 例試驗(yàn)研究結(jié)果并不完全相同，其circRNAs 對(duì)成骨細(xì)胞分化作用結(jié)論略有不同：有通過(guò)circRNA-miRNA 影響分化，也有通過(guò)miRNAmRNA 進(jìn)行影響，還有通過(guò)對(duì)信號(hào)通路的影響。結(jié)論有所差異可能與骨破壞患者病情輕重、檢測(cè)手段等不同有關(guān)，但是可以明確部分circRNAs 對(duì)骨破壞的成骨細(xì)胞分化有確切作用，可以為更好地了解成骨分化過(guò)程打開(kāi)一扇新的窗口，同時(shí)也為今后尋找治療和診斷RA 骨破壞潛在有效靶點(diǎn)提供了新的途徑。

4.2 circRNA 與破骨細(xì)胞分化

破骨細(xì)胞是由通常為單核-巨噬細(xì)胞系的前體細(xì)胞產(chǎn)生的，在RA 中，破骨細(xì)胞的形成和功能會(huì)被免疫系統(tǒng)的異常所影響［28］。破骨細(xì)胞過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致骨內(nèi)環(huán)境平衡失調(diào)，RA 患者骨代謝紊亂、骨破壞發(fā)生都與破骨細(xì)胞的分化密不可分。Chen 等［29］通過(guò)檢測(cè)未處理組中circRNAs 的差異表達(dá)，分析并鑒定RANKL + CSF-1 處理的骨髓單核/巨噬細(xì)胞（bone marrow derived macrophages，BMM）細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化過(guò)程中差異表達(dá)的miRNA。通過(guò)生物信息學(xué)分析，miR-195a 可能與circRNA28313 和CSF-1 結(jié)合，共同形成circRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)。circRNA28313 通過(guò)ceRNA 網(wǎng)絡(luò)來(lái)緩解miR-195 介導(dǎo)的對(duì)CSF1 的抑制，從而調(diào)節(jié)BMM 細(xì)胞中的破骨細(xì)胞分化。從circRNAs 調(diào)控的角度來(lái)探討RA 患者骨破壞中破骨細(xì)胞過(guò)度分化將會(huì)為以后臨床治療RA 骨破壞提供新得思路。

4.3 circRNA 與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖

RA 骨破壞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與凋亡息息相關(guān)，BMSCs 的成骨化、脂肪化以及細(xì)胞周期的改變都嚴(yán)重影響著RA 患者骨破壞的發(fā)展。然而circRNA 在BMSCs 中的作用及其潛在功能尚不完全明確。BMSCs 具有自我更新和多向分化成脂肪、骨骼和肌肉等多種組織細(xì)胞的潛力［30］。此外，BMSCs 對(duì)正常骨發(fā)育和維持骨代謝至關(guān)重要［31］。Ren等［32］使用降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）刺激BMSCs，檢測(cè)circRNAs 和FOSL2 的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)有58 個(gè)circRNAs 發(fā)生顯著差異表達(dá)，包括44 個(gè)circRNAs 表達(dá)下調(diào)和14 個(gè)表達(dá)上調(diào)。其中circRNA003795 可以通過(guò)海綿化miR-504-3p 間接調(diào)控FOSL2 的表達(dá)，從而導(dǎo)致BMSCs 增殖的改變。

4.4 circRNA 與骨相關(guān)信號(hào)通路

最新的研究表明，circRNAs 調(diào)控了多種與骨代謝相關(guān)的分子和信號(hào)通路，通過(guò)信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的平衡，進(jìn)而能夠影響RA 骨破壞發(fā)展。目前已知Wnt/β-catenin、mitogen-activated protein kinases（MAPKs）、BMPs、Toll-like receptors（TLRs）、estrogen receptor β（ERβ）等信號(hào)通路都與成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的平衡有關(guān)［33］。Yang 等［34］采用q-PCR 檢測(cè)成骨標(biāo)志基因mRNA 表達(dá)及BMP 通路主調(diào)節(jié)基因表達(dá)，驗(yàn)證了MAPK 通路對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用。但是circRNAs 對(duì)mRNA 以及相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用仍需要進(jìn)一步研究。

4.5 circRNA 與免疫炎癥

最近的研究表明，許多細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞具有破骨作用。盡管由于人體免疫網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，很難確定它們?cè)诓±頎顟B(tài)中的確切作用［35］。Li 等［36］通過(guò)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)比較RA 患者和健康志愿者的mRNA 表達(dá)，以識(shí)別在滑膜組織中特異表達(dá)的基因位點(diǎn)，然后繪制環(huán)狀circRNA-miRNA-mRNA 的相互作用圖。此外，還在體外對(duì)候選circRNAs 進(jìn)行了功能喪失和挽救分析。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)29 個(gè)circRNAs差異表達(dá)，并且關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥活性的降低是通過(guò)抑制circRNA0001859 的活動(dòng)，從而降低ATF2 表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。circRNAs 能夠降低RA 患者的免疫炎癥反應(yīng)，因此可以緩解RA 患者骨代謝紊亂，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化，緩解骨破壞的進(jìn)程。

5 總結(jié)與展望

circRNAs 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，功能復(fù)雜，來(lái)源多樣，分布廣泛。目前有關(guān)circRNAs 的研究大多關(guān)注circRNA-miRNA-mRNA 的機(jī)制、功能，以及相應(yīng)蛋白的關(guān)聯(lián)。然而，單個(gè)circRNA 對(duì)一個(gè)miRNA 有許多結(jié)合位點(diǎn)，可以與多個(gè)miRNAs 相互作用，因此，需要更廣泛的研究來(lái)闡明circRNAs 和miRNAs 之間功能的相互作用。此外，circRNAs 在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯和與RNA 結(jié)合蛋白在各種疾病中的作用還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，目前對(duì)circRNAs 與RA 骨破壞的研究成果較少，且對(duì)ceRNAs 在RA 骨破壞中調(diào)節(jié)作用機(jī)制還尚不明確。關(guān)于RA 骨破壞的潛在病理機(jī)制，大量研究人員觀察到circRNAs 在BMSCs、成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞分化、分子信號(hào)通路、免疫炎癥反應(yīng)的差異表達(dá)，并提出了它們之間可能的聯(lián)系。因此，可以作出假設(shè)：circRNAs 在RA 骨破壞的發(fā)展中發(fā)揮著獨(dú)特的作用，并可能在RA 骨破壞的治療中發(fā)揮重要作用。解決這些問(wèn)題可能有助于RA 骨破壞的預(yù)防和治療靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)，故今后的研究應(yīng)從RA 骨破壞的數(shù)據(jù)挖掘，篩選相關(guān)circRNAs 與細(xì)胞因子進(jìn)行機(jī)制研究與干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

劉?。禾岢鑫恼轮黝}，負(fù)責(zé)構(gòu)思修改文章框架；王杰：主要負(fù)責(zé)全文撰寫(xiě)，后期的修改；文建庭：負(fù)責(zé)全文文字的修改，對(duì)邏輯關(guān)系把控；王馨、杜新雷：負(fù)責(zé)前期參考文獻(xiàn)查找，把控文獻(xiàn)質(zhì)量。