肝損傷引起視網(wǎng)膜及血-視網(wǎng)膜屏障的結(jié)構(gòu)功能變化及可能機(jī)制研究進(jìn)展

于絲雨，劉李，劉曉東（中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 211100）

視網(wǎng)膜是人眼內(nèi)最重要的結(jié)構(gòu)之一。視網(wǎng)膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)及血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的存在利于視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)的維持。視網(wǎng)膜電位圖（electroretinogram，ERG）是臨床上常用的檢查視網(wǎng)膜功能的診斷工具，肝損傷患者ERG 表明其振蕩電位、a 波和b 波均有不同程度的降低和延遲，其改變程度與肝性腦病程度和肝纖維化程度成正相關(guān)，說明肝損傷狀態(tài)下視網(wǎng)膜功能出現(xiàn)異常。動物實(shí)驗(yàn)顯示硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）誘導(dǎo)肝損傷和膽管結(jié)扎（bile duct ligation，BDL）誘導(dǎo)肝損傷均可引起視網(wǎng)膜病變，提示肝損傷狀態(tài)下視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，但在不同形式的肝損傷狀態(tài)下，肝性視網(wǎng)膜病變的致病機(jī)制均有所不同[1]。本文綜述視網(wǎng)膜及BRB 的組織結(jié)構(gòu)與功能，重點(diǎn)綜述幾種不同形式的肝損傷狀態(tài)下視網(wǎng)膜及BRB 結(jié)構(gòu)功能變化及可能機(jī)制。

1 視網(wǎng)膜與血-視網(wǎng)膜屏障

1.1 視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)

組織學(xué)上，可將視網(wǎng)膜大體分為兩層，即視網(wǎng)膜色素上皮層（retinal pigment epithelium，RPE）和視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層（可細(xì)分為外限膜、外核層、外叢狀層、內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層及內(nèi)限膜）；其中RPE、內(nèi)限膜、外限膜及Müller 細(xì)胞在某些物質(zhì)由玻璃體向視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起直接屏障作用[1]。Müller細(xì)胞是脊椎動物視網(wǎng)膜中的主要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其參與構(gòu)成BRB，對維持視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)和功能有重要作用[2]。

1.2 血-視網(wǎng)膜屏障組織結(jié)構(gòu)

血眼屏障由兩大主要部分構(gòu)成，即前血-房水屏障和后血-視網(wǎng)膜屏障[3]。BRB 主要由視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其連接構(gòu)成內(nèi)屏障，星形膠質(zhì)細(xì)胞及Müller 細(xì)胞的突起包繞其外，參與構(gòu)成內(nèi)屏障；由色素上皮細(xì)胞及其連接構(gòu)成外屏障。

BRB 上有多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為兩大家族，即溶質(zhì)載體（solute carrier，SLC）超家族和ATP 結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）超家族。在人的BRB 上表達(dá)的SLC 超家族轉(zhuǎn)運(yùn)體包括谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、神經(jīng)遞質(zhì)類轉(zhuǎn)運(yùn)體、一元羧酸類轉(zhuǎn)運(yùn)體、核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體等，ABC 超家族轉(zhuǎn)運(yùn)體包括多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated proteins，MRPs）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）及乳腺癌耐藥蛋白等[4-6]。

1.3 血-視網(wǎng)膜屏障的功能

BRB 構(gòu)成的結(jié)構(gòu)性屏障可限制親水性物質(zhì)由血液至神經(jīng)視網(wǎng)膜側(cè)的非特異性轉(zhuǎn)運(yùn)。Occludin、ZO-1 是其中代表性的緊密連接蛋白，它們參與構(gòu)成細(xì)胞旁屏障，具有調(diào)節(jié)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，常作為評價(jià)緊密連接屏障功能及屏障通透性的指標(biāo)[7-8]。

BRB 也具有一定的通透性。構(gòu)成BRB 的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和RPE 細(xì)胞上表達(dá)有多種特殊轉(zhuǎn)運(yùn)體，可將某些重要的營養(yǎng)物質(zhì)高效地由循環(huán)血液轉(zhuǎn)運(yùn)至視網(wǎng)膜側(cè)，同時(shí)將某些內(nèi)源性、外源性物質(zhì)選擇性地外排至視網(wǎng)膜外[6]。BRB 上也表達(dá)有其他氨基酸類轉(zhuǎn)運(yùn)體[9]，具有轉(zhuǎn)運(yùn)左旋多巴[10]、谷氨酸[11]等物質(zhì)的功能，其他攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體如一元羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也對某些底物在BRB 的轉(zhuǎn)運(yùn)過程具有重要作用[5]。

1.4 影響血-視網(wǎng)膜屏障功能的因素

BRB 功能受多種因素影響，缺血、缺氧、滲透壓改變、某些內(nèi)源性物質(zhì)及化學(xué)物質(zhì)均會影響屏障結(jié)構(gòu)和功能[12]，特別是BRB 上轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能與表達(dá)水平變化可直接對視網(wǎng)膜屏障功能產(chǎn)生影響。

1.4.1 BRB 上轉(zhuǎn)運(yùn)體對視網(wǎng)膜屏障功能的影響除具有轉(zhuǎn)運(yùn)營養(yǎng)物質(zhì)和內(nèi)源性廢物的功能，BRB上也有多種具有不同生理功能的轉(zhuǎn)運(yùn)體和通道表達(dá)。多項(xiàng)研究表明P-gp 具有主動外排功能[5，13]，且在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系及人原代RPE 細(xì)胞中有外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP 存在[14-15]。另一類是攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體，如人RPE 細(xì)胞上表達(dá)有Na＋-依賴的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體家族[16]、Na＋-Cl－依賴的神經(jīng)遞質(zhì)類轉(zhuǎn)運(yùn)體[5]、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體[17]；在轉(zhuǎn)基因大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)有對半胱氨酸的攝取具有飽和性且受底物氨基酸抑制的谷氨酸/半胱氨酸交換轉(zhuǎn)運(yùn)體[18]等。

1.4.2 氧化應(yīng)激對視網(wǎng)膜屏障功能的影響 氧化應(yīng)激變化可通過多種機(jī)制影響細(xì)胞進(jìn)程。早期用過氧化氫處理BRB 所得的研究結(jié)果包括肌動蛋白的重組、細(xì)胞間連接蛋白的再分布、RPE 屏障通透性的增加等[19-22]。

1.4.3 某些細(xì)胞因子對視網(wǎng)膜屏障功能的影響在糖尿病性視網(wǎng)膜疾病狀態(tài)下，其代謝功能異常通常會導(dǎo)致某些細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、白介素的生成異常增多，進(jìn)而導(dǎo)致血管系統(tǒng)內(nèi)白細(xì)胞增多，發(fā)生血管堵塞、周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的丟失，使血管通透性增加，從而引發(fā)黃斑水腫[23-25]。特別是由VEGF 激活蛋白激酶C 引起Occludin 磷酸化水平變化，進(jìn)而導(dǎo)致Occludin 蛋白遷移，而后期因Occludin 磷酸化導(dǎo)致的Occludin 蛋白含量降低會使視網(wǎng)膜屏障功能受到進(jìn)一步的損傷[26]。

2 肝損傷對視網(wǎng)膜屏障功能的影響及可能機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，某些死于肝損傷（包括肝性腦?。┑幕颊咂湟暰W(wǎng)膜Müller 細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)變化，這種變化與肝性腦病患者腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞（阿爾茨海默-Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞）形態(tài)學(xué)變化相似[1，27]，因此將肝損傷狀態(tài)下的視網(wǎng)膜病變定義為肝性視網(wǎng)膜疾病。實(shí)驗(yàn)對11 名患肝硬化（由不同種肝疾病發(fā)展而來）并伴有肝性腦病的患者分別進(jìn)行眼部常規(guī)檢查、色彩辨認(rèn)測試及標(biāo)準(zhǔn)視網(wǎng)膜電位測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下[1]：

① 病情嚴(yán)重患者暗適應(yīng)、明適應(yīng)條件下a 波及b 波均表現(xiàn)為振幅顯著下降，潛伏期延長，且患者振蕩電位的振幅顯著縮小，潛伏期顯著延長[1，28]。a 波反映感光細(xì)胞電位水平，b 波主要反映雙極細(xì)胞對視覺沖動的傳導(dǎo)情況及Müller 細(xì)胞電位水平，振蕩電位主要反映無長突細(xì)胞電位水平[29]。

② 病情嚴(yán)重患者出現(xiàn)藍(lán)-黃顏色識別障礙、視敏度降低、黃斑反射異常甚至消失、RPE 層細(xì)顆粒狀改變現(xiàn)象[1]。

因此，為研究此種由肝損傷引起的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能障礙及可能機(jī)制，以下將介紹兩種常用肝損傷模型及一種外源性誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變狀態(tài)下，視網(wǎng)膜及BRB 結(jié)構(gòu)和功能變化的可能機(jī)制。

2.1 硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝損傷狀態(tài)下視網(wǎng)膜屏障功能變化及可能機(jī)制

首先以大鼠為研究物種，研究TAA 誘導(dǎo)的肝損傷大鼠視網(wǎng)膜免疫形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化。光學(xué)顯微鏡下，肝損傷大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)腫脹。在免疫組織學(xué)水平上，通過對肝損傷大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞膠質(zhì)特異性標(biāo)記蛋白進(jìn)行免疫染色，同對照組相比，在光學(xué)顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞末梢和玻璃體干細(xì)胞突起處表現(xiàn)為視網(wǎng)膜膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性，肝損傷大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）免疫反應(yīng)性明顯增強(qiáng)，具有GS 標(biāo)記的細(xì)胞末梢范圍增大[27]。在超微結(jié)構(gòu)上，肝損傷大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞突起空泡化，特別是細(xì)胞末梢含有許多腫脹的線粒體[30]。此外，分別給予亞毒性至毒性劑量的NH4＋，體外培養(yǎng)的正常Müller 細(xì)胞也表現(xiàn)出與上述相近的一系列免疫組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化[31]。對于TAA 誘導(dǎo)的肝損傷引起視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞免疫形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化的機(jī)制已有諸多研究[27-32]：

① 研究發(fā)現(xiàn)對于培養(yǎng)的家兔Müller 細(xì)胞，給予氨水平（NH4＋）的劑量升高會伴有視網(wǎng)膜GS 免疫反應(yīng)性的增強(qiáng)，這與從TAA 誘導(dǎo)的肝損傷大鼠上獲得的結(jié)果一致。小鼠視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞若暴露于興奮性氨基酸（包括谷氨酸）下，會刺激GS 活性。而GS 活性的增強(qiáng)可能與谷氨酰胺合成增多密切相關(guān)。

② 在大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)釋放谷氨酸的細(xì)胞數(shù)量減少，感光細(xì)胞變性的情況下，Müller 細(xì)胞會下調(diào)GS 表達(dá)水平。

③ 腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹是急性肝性腦病特征之一，且在暴露于高濃度氨的Müller 細(xì)胞和TAA 誘導(dǎo)的肝損傷小鼠Müller 細(xì)胞上均可觀察到細(xì)胞腫脹，其可能與黃斑反射的消失有關(guān)[31-32]。

④ Müller 細(xì)胞是視網(wǎng)膜內(nèi)唯一具有將谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺功能的細(xì)胞，在急性氨升高條件下，大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺濃度升高，且大鼠星形細(xì)胞谷氨酸凈攝取量及最大攝取速度提高。其中Müller 細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺濃度升高與滲透性水內(nèi)流及細(xì)胞腫脹密切相關(guān)。

因此，由以上諸多研究可以推斷TAA 誘導(dǎo)的肝損傷大鼠眼部發(fā)生變化的原因：TAA 誘導(dǎo)的肝損傷大鼠血清氨濃度升高，Müller 細(xì)胞暴露于高濃度氨供應(yīng)條件下時(shí)，其可能通過某種底物調(diào)節(jié)機(jī)制上調(diào)GS 的表達(dá)或活性，促進(jìn)氨和谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺（這可能是Müller 細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺合成增多的原因），進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，發(fā)生細(xì)胞腫脹和細(xì)胞突起空泡化。

另有研究發(fā)現(xiàn)，Müller 細(xì)胞損傷可能會通過影響視色素代謝使感光細(xì)胞應(yīng)答和a 波振幅減弱[33]。Müller 細(xì)胞內(nèi)存在細(xì)胞視網(wǎng)膜連接蛋白和視黃醇連接蛋白，因此推測在正常視網(wǎng)膜內(nèi)，Müller 細(xì)胞參與視色素的合成與再生循環(huán)[33]，當(dāng)Müller 細(xì)胞受損時(shí)，此過程將受到影響。另外由于視網(wǎng)膜活動神經(jīng)元的能量代謝依賴于Müller 細(xì)胞與神經(jīng)元的共生，因此Müller 細(xì)胞功能障礙會導(dǎo)致神經(jīng)元代謝繼發(fā)性障礙和神經(jīng)信息處理中斷[1]，最終引起視網(wǎng)膜功能障礙。

2.2 膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝硬化狀態(tài)下視網(wǎng)膜屏障功能變化及可能機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)BDL 組小鼠出現(xiàn)膽汁淤積現(xiàn)象，與假手術(shù)組和對照組小鼠相比，BDL 組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層厚度顯著增加，視網(wǎng)膜形態(tài)發(fā)生變化，其他視網(wǎng)膜層（外核層、外叢狀層、內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層）厚度無明顯變化[34]。相比于BDL 組，BDL 誘導(dǎo)的肝硬化小鼠給予納曲酮（naltrexone，NTX）后小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞厚度顯著降低，且與假手術(shù)組和對照組相比無顯著性差異。另有實(shí)驗(yàn)表明假手術(shù)組日常給予NTX注射不會引起小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層厚度增加[34]。由此可以推斷內(nèi)源性阿片類物質(zhì)的生成增多可能與BDL 小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層厚度過度增加有關(guān)。早期研究表明視網(wǎng)膜上表達(dá)有多種特定類型的阿片類受體，另有研究發(fā)現(xiàn)阿片類物質(zhì)可影響神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的活性，且內(nèi)源性阿片類物質(zhì)具有調(diào)節(jié)處于生長狀態(tài)大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞增殖的作用[35]。

以上研究結(jié)果表明，小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化可能由BDL 誘導(dǎo)的肝硬化小鼠影響正常的阿片類物質(zhì)代謝，進(jìn)而阿片類物質(zhì)激活視網(wǎng)膜上特定的某種或某幾種阿片類受體，使視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞過度增殖，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層厚度增加。另有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變狀態(tài)下，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層厚度也顯著增加[36]。目前還未有研究表明神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層厚度的增加對視網(wǎng)膜及BRB 功能是否有直接影響，推測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層厚度增加可能會使視網(wǎng)膜厚度增加，影響視網(wǎng)膜及BRB 的多種功能。

2.3 肝炎病毒誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜屏障功能障礙及可能機(jī)制

一項(xiàng)臨床研究結(jié)果顯示，在患有丙型病毒性肝炎的患者群組內(nèi)視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病率顯著高于對照組[37]，因此丙型病毒性肝炎與視網(wǎng)膜疾病發(fā)生之間的關(guān)系有待研究。

研究表明，鼠肝炎病毒以玻璃體內(nèi)接種途徑感染白變種實(shí)驗(yàn)室小鼠會引發(fā)急性或慢性的眼部病變。在感染第一階段（1～7 d）可觀察到視網(wǎng)膜血管炎癥產(chǎn)生，并伴有病毒蛋白和侵染性病毒的存在；第二階段（10～140 d）視網(wǎng)膜內(nèi)病毒蛋白和侵染性病毒消失，動物血清內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在抗病毒中和抗體，視網(wǎng)膜血管炎癥消失，視網(wǎng)膜退行性改變，包括感光細(xì)胞層減少、感光細(xì)胞間連接蛋白丟失、RPE 異常、視網(wǎng)膜脫落等，進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜屏障功能受損。這種退行性變化可能與抗視網(wǎng)膜和抗RPE 細(xì)胞自身抗體的生成有關(guān)。且在第一階段及第二階段，神經(jīng)視網(wǎng)膜（神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、Müller 細(xì)胞內(nèi)等）及RPE 層均存在病毒RNA。研究發(fā)現(xiàn)在動物肝組織中也檢測到相似的病毒類型，表明病毒誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變與系統(tǒng)性持久性病毒感染密切相關(guān)[38]。

RPE 細(xì)胞不僅具有調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜生理結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，且具有重要免疫作用。RPE 細(xì)胞可生成主要組織相容性復(fù)合體，其可呈遞外源性病毒蛋白及視網(wǎng)膜蛋白給輔助T 細(xì)胞，從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生；視網(wǎng)膜內(nèi)病毒RNA 的持續(xù)存在可啟動自身免疫反應(yīng)，進(jìn)而造成免疫性損傷[38]。因此，在肝炎病毒誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變狀態(tài)下，病毒RNA 及低水平病毒蛋白的存在與視網(wǎng)膜內(nèi)多種病理學(xué)過程包括視網(wǎng)膜屏障功能障礙相關(guān)聯(lián)。

3 結(jié)語

綜上，視網(wǎng)膜的屏障功能受多種因素影響。不同形式的肝損傷可通過引起機(jī)體內(nèi)某些物質(zhì)水平紊亂而誘發(fā)肝性視網(wǎng)膜病變，但其機(jī)制不盡相同。