山莨菪堿對小鼠流感病毒性肺損傷的保護作用及機制研究*

唐 虹，楊 洋，劉 曉

（四川省綿陽市中心醫(yī)院兒科，綿陽 621000）

流感是一種在全球流行的具有高度傳染性的急性呼吸道疾病，其發(fā)病率和死亡率較高[1-2]。流感病毒極易發(fā)生變異，以至于人類機體很難對其產(chǎn)生免疫力[3]。由于西藥的大量使用，流感病毒也容易產(chǎn)生耐藥性[4]。因此，尋找新的高效藥物對流感的治療具有重要意義。山莨菪堿常用來治療小兒肺炎，并且其效果也得到臨床上的肯定[5]。但是山莨菪堿對流感病毒引起的肺炎損傷是否具有保護作用尚且未知。本研究以流感病毒甲型鼠肺適應株（FM1）滴鼻感染小鼠建立病毒性肺炎模型，探討山莨菪堿對小鼠肺組織中氧化應激及炎性損傷的影響，揭示其作用機制與Toll樣受體3（Toll-like receptors,TLR3）/TRIF3 信號通路的關系，為山莨菪堿用于治療流感肺損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60 只SPF 級BALB/C 裸鼠，體重18～20 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2016-0002。動物實驗和處置遵守實驗動物管理和倫理委員會章程。

1.2 藥物與主要試劑 山莨菪堿（貨號：83377-50-8）購自上海科順生物科技有限公司；FM1流感病毒（血凝滴度1∶128）由中國中醫(yī)藥研究院饋贈；達菲（貨號：B1354）購自瑞士巴塞爾豪夫邁羅氏公司；實時熒光定量PCR（qPCR）所需試劑均購自美國Thermo Fisher 公司；引物均由上海生工設計合成；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試驗試劑盒購自美國RD 公司。

1.3 動物分組及流感病毒性肺損傷模型的建立 將60只BALB/c小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為對照組、模型組、達菲組、山莨菪堿低劑量組、山莨菪堿中劑量組、山莨菪堿高劑量組。除對照組外，其他5組均建立流感病毒性肺損傷模型：小鼠在乙醚淺度麻醉下，從鼻腔滴入FM1流感病毒液（0.05 mL/g）[6]。對照組同法滴入無菌生理鹽水。

1.4 給藥方法 各組小鼠分別灌胃給藥，2次/d，達菲劑量為27.5 mg/kg，山莨菪堿高、中、低劑量分別為3 mg/kg、1.5 mg/kg、0.75 mg/kg。對照組和模型組給予等量生理鹽水。給藥第7 天感染小鼠，感染后連續(xù)給藥7 d。

1.5 小鼠肺指數(shù) 末次給藥2 h后，稱體重，處死小鼠，迅速摘取肺臟，去除氣管、肺門淋巴結等組織，以生理鹽水洗滌2次，用濾紙吸干肺臟表面水分，稱肺重，計算肺指數(shù)。肺指數(shù)=肺重(g)/體重(g)×100%。

1.6 小鼠肺組織病理檢查 取部分肺組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，行蘇木精－伊紅（HE）染色，封片，顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理損傷情況。

1.7 小鼠肺組織氧化應激及炎癥因子水平檢測 取部分肺組織，制成組織勻漿，離心，取上清分裝，于-20 ℃冰箱中保存待測。采用ELISA 法檢測各組小鼠肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白細胞介素（IL）-6的水平。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書要求進行操作。

1.8 qPCR 法檢測小鼠肺組織TNF-α、IL-6、TLR3、TRIT mRNA 表達及病毒載量 充分研磨肺組織，Trizol 法提取總RNA，使用微量核酸蛋白測定儀檢測RNA 濃度和純度，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照qPCR試劑盒說明書要求配制反應體系，以GAPDH為內(nèi)參進行PCR 擴增。引物序列如下：TNF-α 上游：5’-ATGTGGCAAGAGATGGGGAA-3’，下游：5’-CTCACACCCCACATCTGTCT-3’；IL-6 上游：5’-CTCATTCTGTCTCGAGCCCA-3’，下游：5’-CTGTGAAGTCTCCTCTCCGG-3’；TLR3 上 游：5’-TCTTCCCTGGAACACCTGAA-3’，下游：5’-AGATTACTGCAGCCCACCTT-3’；TRIT 上游：5’-CAGGAAGAAGAGGGCCAGAT-3’，下游：5’-TTCAACAAAGATAGCGCCCG-3’；GAPDH上游：5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下游：5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量，實驗重復3次。

采用qPCR 法檢測病毒載量，提取上述基因的DNA，以DNA為模板進行擴增，擴增1 kb片段后制備反應體系30 μL，按照Real Master Mix SYBR Green（北京天根生物科技有限公司）說明書進行操作，取ABI 專用光學八連管，反應體系：DNA 2 μL，上、下游引物各2 μL、2×SuperReal PreMix 13.5 μL、RNase-free ddH2O 補足至30 μL；反應條件：95 ℃4 min，95 ℃30 s，59 ℃30 s，68 ℃35 s，72 ℃30 s，共40 次循環(huán)，應用ABI 7500 型熒光定量PCR 儀進行PCR擴增，讀取數(shù)據(jù)[7]。

1.9 Western blotting 法檢測小鼠肺組織中干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）蛋白表達 將肺組織充分研磨，加入RIPA 裂解液，于冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min；取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min；電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h；洗膜，加入IRF3一抗（1∶1 000，美國Santa Cruz 公司），4 ℃冰箱過夜孵育；洗膜，加二抗（1∶2 000，美國Santa Cruz 公司），室溫下孵育2 h；ECL發(fā)光、顯色，凝膠成像儀拍照，應用Image J軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 6組小鼠肺組織病理改變 對照組肺泡結構清晰，未見明顯的病理損傷現(xiàn)象；模型組肺泡出現(xiàn)病變，肺泡可見大量的炎性細胞浸潤，血管出現(xiàn)明顯的充血現(xiàn)象，肺組織結構破壞；與模型組比較，達菲組肺泡內(nèi)炎性細胞和血管充血明顯減少，肺組織損傷得到顯著改善，組織結構與對照組相近；與模型組比較，山莨菪堿低、中、高劑量組肺泡炎性細胞浸潤逐漸減少，血管充血逐漸減輕，肺組織損傷逐漸改善；山莨菪堿高劑量組肺組織結構與達菲組相近，見圖1。

圖1 小鼠肺組織HE染色圖（×200）

2.2 6組小鼠肺指數(shù)和肺組織病毒載量比較 與對照組比較，模型組肺指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，山莨菪堿低、中、高劑量組和達菲組肺指數(shù)和病毒載量顯著降低（P＜0.05）；與達菲組比較，山莨菪堿低、中劑量組肺指數(shù)和病毒載量顯著升高（P＜0.05），山莨菪堿高劑量組與達菲組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；山莨菪堿降低小鼠肺指數(shù)和病毒載量的作用呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖2。

2.3 6組小鼠肺組織SOD和MDA水平比較 與對照組比較，模型組肺組織SOD活性顯著降低，MDA水平顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，山莨菪堿低、中、高劑量組和達菲組肺組織SOD 活性顯著升高，MDA水平顯著降低（均P＜0.05）；與達菲組比較，山莨菪堿低、中劑量組肺組織SOD 活性顯著降低，MDA水平顯著升高（均P＜0.05），山莨菪堿高劑量組與達菲組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；山莨菪堿對肺組織SOD和MDA的作用呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖3。

圖3 山莨菪堿對肺炎小鼠肺組織中SOD活性及MDA水平的影響

2.5 山莨菪堿對肺炎小鼠肺組織炎性因子TNF-α及IL-6水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠的肺組織TNF-α、IL-6 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，山莨菪堿低、中、高劑量組和達菲組肺組織TNF-α、IL-6 水平顯著降低（P＜0.05）；與達菲組比較，山莨菪堿低、中劑量組肺組織TNF-α、IL-6 水平顯著升高（P＜0.05），山莨菪堿高劑量組與達菲組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；山莨菪堿對小鼠肺組織炎性因子TNF-α、IL-6 的抑制作用呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖4。

2.4 6組小鼠肺組織TNF-α、IL-6、TLR3 及TRIT mRNA相對表達量比較 與對照組比較，模型組肺組織TNF-α、IL-6、TLR3和TRIT mRNA相對表達量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，山莨菪堿低、中、高劑量組和達菲組TNF-α、IL-6、TLR3 和TRIT mRNA相對表達量均顯著降低（P＜0.05）；與達菲組比較，山莨菪堿低、中劑量組TNF-α、IL-6、TLR3 和TRIT mRNA 相對表達量均顯著升高（均P＜0.05），山莨菪堿高劑量組與達菲組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；山莨菪堿對小鼠肺組織TNF-α、IL-6、TLR3 及TRIT mRNA 表達的抑制作用呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖5、圖6。

2.7 6組小鼠肺組織IRF3 蛋白表達量比較 與對照組比較，模型組肺組織IRF3蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，山莨菪堿低、中、高劑量組和達菲組肺組織IRF3 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；與達菲組比較，山莨菪堿低、中劑量組肺組織IRF3 蛋白表達量顯著升高（P＜0.05），山莨菪堿高劑量組與達菲組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；山莨菪堿對小鼠肺組織IRF3 蛋白表達的抑制作用呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖7。

圖4 山莨菪堿對肺炎小鼠肺組織炎性因子TNF-α及IL-6水平的影響

圖5 山莨菪堿對肺炎小鼠肺組織TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達的影響

圖6 山莨菪堿對肺炎小鼠肺組織TLR3 mRNA、TRIT mRNA表達的影響

圖7 山莨菪堿對肺炎小鼠肺組織IRF3蛋白表達的影響

3 討論

山莨菪堿是一種從茄科植物山莨菪中提取的生物堿，其為非亞型選擇性毒蕈堿，可作為煙堿型膽堿能受體拮抗劑[8]。山莨菪堿與阿托品和東莨菪堿有類似的藥理作用，其效力低于阿托品和東莨菪堿，且毒性較低[9-10]。夏錫儀等[11]、Zheng等[12]研究指出，山莨菪堿在急性肺損傷中可發(fā)揮保護作用。胡喬華等[13]發(fā)現(xiàn)，山莨菪堿可改善膿毒性休克大鼠急性肺損傷。杜寧等[14]在開胸術后急性肺損傷患者中發(fā)現(xiàn)，山莨菪堿可升高患者血中TNF-α、IL-6、IL-10、超敏C 反應蛋白（hs-CRP）和降鈣素原（PCT）水平，抑制體內(nèi)炎癥反應從而減輕肺損傷。以上研究結果均提示山莨菪堿對于肺損傷具有保護作用。

SOD 是生物體內(nèi)清除超氧陰離子自由基的一種重要酶，其能有效地使機體抗御氧自由基的毒性。MDA 是衡量體內(nèi)自由基代謝水平和反映機體受氧化損傷程度的敏感指標。本研究中，山莨菪堿能夠提高流感病毒性肺損傷小鼠肺組織中的SOD活性，降低MDA 含量，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。提示山莨菪堿具有一定的抗氧化能力，其肺損傷保護作用可能與抗氧化特性有關。TNF-α、IL-6、IL-8等細胞因子作為重要的炎癥介質(zhì)參與機體的炎癥反應。本研究發(fā)現(xiàn)，山莨菪堿低、中、高劑量組肺組織TNF-α、IL-6表達顯著降低（P＜0.05）。提示山莨菪堿能夠明顯抑制流感病毒誘導的肺損傷小鼠肺組織內(nèi)炎癥反應，減輕肺組織炎癥損傷程度，這與HE染色結果相一致。

TLR屬于天然免疫的蛋白質(zhì)分子，其可通過識別病原體等而發(fā)揮抗病毒的作用，其中TLR3/TRIF信號通路在機體免疫系統(tǒng)等多種相關疾病中可發(fā)揮重要作用，TLR3 可招募TRIF 而促進下游炎性因子表達，進而引起機體炎癥反應[15]。TLR3/TRIF 信號通路活化可促進IRF3的表達，進而促使炎癥因子分泌，并可參與機體抗病毒免疫應答等多種病理過程[16]。研究表明，脂多糖誘導的急性肺損傷中IRF3的表達水平升高，IRF3高表達可增加IL-6和IL-8等炎癥因子的分泌量進而加重急性肺損傷[17]。朱珊等[18]通過呼吸機誘導肺損傷模型，qPCR、ELISA 實驗發(fā)現(xiàn)，損傷肺組織中TLR3、TLR4 的表達異常升高，提示TLR3、TLR4 的表達與肺組織的損傷密切相關。此外，王麗等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在流感病毒誘導的肺損傷小鼠中，TLR3、TLR4 的表達上調(diào)，同時NFκB 和TNF-α 表達量升高。本研究發(fā) 現(xiàn)，TLR3、TRIT、IRF3的表達在流感病毒誘導的肺損傷小鼠中明顯升高，山莨菪堿能夠明顯降低小鼠肺組織中TLR3、TRIT、IRF3的表達，且呈劑量依賴性，說明山莨菪堿可能通過抑制TLR3/TRIF信號通路的激活，從而發(fā)揮病毒性肺損傷的保護作用。

綜上所述，山莨菪堿對流感病毒致肺損傷小鼠具有保護作用，可減輕肺組織損傷程度，其作用機制可能與抗氧化應激、減輕炎癥反應、抑制TLR3/TRIF信號通路有關。