兒茶素類物質按聚合度分離分析方法研究進展

劉彥霞 *，秦菲

1. 生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室（北京 100191）；2. 北京聯(lián)合大學功能食品科學技術研究院（北京 100191）；3. 北京聯(lián)合大學生物化學工程學院（北京 100023）

兒茶素類物質是植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于多種植物中，如茶葉、葡萄、蘋果、柿子等。因為兒茶素類物質具有多種生理功能，多年來受到科研工作者們的關注，有大量關于兒茶素類物質提取、分離、代謝及生理功能方面的研究[1-3]。在自然界中，兒茶素類物質以兒茶素單體和聚合體混合存在，其聚合體一般又稱作原花青素（前花青素）或縮合單寧。聚合度是兒茶素類物質分子結構復雜性的一個重要表現(xiàn)，不同聚合度兒茶素的吸收、代謝及生物利用度有明顯區(qū)別[4-5]，目前大多數(shù)研究認為聚合度低的兒茶素具有更高的生物利用率。研究者對不同聚合度兒茶素進行分離分析的方法進行過大量嘗試。綜述近年來兒茶素類物質按聚合度分離分析的方法進行，以期為此類物質的進一步研究提供參考

1 兒茶素類物質常用提取、定量分析方法

因為植物成分的復雜性，按聚合度對兒茶素類物質的分離分析首先要進行提取，將其與植物其他成分分開，在按照聚合度分離之前進行兒茶素類物質總量的測定。兒茶素單體以C6-C3-C6為骨架結構，C環(huán)上C2與C3為兩個手性碳原子。根據(jù)其取代基團及位置不同，常見的兒茶素單體有8種。如果兒茶素多聚體中所有結構單元和連接鍵都隨機組合，那么由其組成的多聚體的異構體個數(shù)將會隨聚合度的增大，以指數(shù)方式增長[6]，想要分離聚合度3以上的兒茶素聚合體的純品已經(jīng)非常困難。

1.1 兒茶素類物質常用提取方法

兒茶素類物質最常用的提取方法是有機溶劑提取法。在植物原料中，兒茶素類物質通常與植物組織中其他成分如蛋白質、果膠等物質通過氫鍵結合存在。用有機溶劑提取能夠使氫鍵斷裂，常用的有機溶劑有甲醇、丙酮、乙醇，這些溶劑按一定比例與水混合作為提取溶劑。在以分析植物原料中兒茶素類物質成分為目的的研究中，常以70%丙酮作為提取溶劑[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，在提取溶劑中加入約50%的丙酮，能大大提高可溶性和不可溶性兒茶素聚合體的提取[9]。另外，儀器協(xié)助提取，如超聲協(xié)助提取[2-3]、微波協(xié)助提取[1]、超聲微波協(xié)同處理[10]、超聲波-酶法輔助處理，可以增強植物細胞壁的通透性，提高提取效率[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，微波處理能夠增加單體兒茶素及兒茶素類物質的提取總量，所得產(chǎn)物具有更高的抗氧化能力和葡萄糖苷酶抑制活性[1]。超臨界CO2萃取是利用超臨界二氧化碳的溶解能力與其密度的關系，將目標成分提取出來。這種方法提取效率與產(chǎn)品純度均較高，且能有效地防止兒茶素類物質的氧化，但是由于儀器設備一次性投入高，應用受到限制。近年來出現(xiàn)一些新的提取溶劑或提取方法，如乙醇-硫酸銨雙水相萃取[13]、分散液-液氣溶膠相萃取法[14]。乙醇-硫酸銨雙水相系統(tǒng)具有較好的分離效率且便于回收，酶的使用促進了植物細胞的破壁，與索氏提取方法相比，總酚得率提高64.91%。分散液-液氣溶膠相萃取法中氣溶膠大大增加了互不相容的兩相之間界面的表面積，加快了分配平衡的速度，與傳統(tǒng)提取方法相比，縮短了提取所需時間，且減少了試劑用量，更加環(huán)保。

1.2 兒茶素類物質常用定量分析方法

兒茶素類物質總量測定方法主要采用的是紫外分光光度法，包括福林酚（Folin-Ciocalteau）法、香草醛-鹽酸（硫酸）法、鐵鹽催化正丁醇-鹽酸（Butanol-HCl）法、鉬酸銨法、二甲基氨基肉桂醛（DMACA）測定法[15-17]。福林酚法利用鎢鉬酸氧化其他物質，本身被還原的性質，以沒食子酸作為標準進行定量，兒茶素以外具有還原性的物質也會參加反應，因此所得到的結果會偏高，但目前仍是常用的定量方法[7-8]。香草醛-鹽酸（硫酸）法與DMACA能夠與兒茶素單體反應，以兒茶素單體作為標準品，可以得到總兒茶素類物質的含量。而正丁醇-鹽酸法則測定的是兒茶素聚合體即原花青素的含量，其中不包括兒茶素單體，一般用純度較高的原花青素作為標準品。

反相高效液相色譜（HPLC）法，可以高效分離單體及低聚體兒茶素，在有標準品的情況下，能夠同時檢測多種兒茶素物質的含量[18-20]。然而對聚合度3以上的兒茶素聚合體，由于異構體數(shù)目呈幾何倍數(shù)的增加，反相HPLC很難進行分離，這些聚合度較高的兒茶素在色譜圖中形成大的色譜峰包。正是利用反相HPLC對兒茶素的高分辨效果，研究者將兒茶素聚合體在酸性條件下水解產(chǎn)生花氰定，然后利用HPLC對產(chǎn)生的花氰定進行檢測，也能夠對兒茶素的總量進行定量[21]。保健食品中前花青素的測定的國家標準GB/T22244—2008即采用該方法。

2 兒茶素類物質聚合度的測定方法

兒茶素單體和部分商業(yè)化標準品的低聚體可以通過標準物質進行定性，但這只是兒茶素類物質中很小的一部分，絕大多數(shù)兒茶素類物質聚合體是沒有商業(yè)化的標準物質的。質譜與核磁共振技術（NMR）是兒茶素類物質聚合體定性分析的有效方法，電噴霧離子化質譜（ESI MS）和基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）在兒茶素類物質分析中占有重要位置。通過MALDI-TOF MS分析，結果發(fā)現(xiàn)草莓果皮中有兒茶素13聚體[8]，黃皮樹葉片中最大聚合度達到20[22]，通過與MALDI-TOF MS與NMR聯(lián)合分析，結果發(fā)現(xiàn)蔓越莓汁中存在A型原花青素3-6聚體[23]。

平均聚合度（mDP）是另一個用于了解樣品中兒茶素類物質聚合情況的概念，mDP是由兒茶素混合物中總組成單元的分子個數(shù)除以總的兒茶素類物質分子個數(shù)而得來的，可以粗略地反映出兒茶素混合物的聚合程度[24-25]。目前測定平均聚合度的方法主要有3種。

2.1 裂解分析法測定mDP

在親核試劑如芐硫醇存在時，兒茶素聚合體發(fā)生部分硫解反應，硫解后主要形成其單體結構及相應的芐硫醚衍生物，聚合體的底端單元反應后形成兒茶素單體形式，而兒茶素聚合體的延伸結構單元以芐硫醚衍生物形式存在[26-28]。因此，該方法還可以檢測出聚合體的組成單元。芐硫醇因為有特殊氣味，常用間苯三酚取代。利用HPLC對產(chǎn)物進行分析，兒茶素單體物質可以通過標樣定性定量得到實際的摩爾數(shù)，其芐硫醚（或間苯三酚）衍生物可以通過自制的標準品，或者用兒茶素單體標準品相對定量，計算其摩爾數(shù)。通過這種方式，mDP=（底端單元摩爾數(shù)+延伸單元摩爾數(shù)）/底端單元摩爾數(shù)[29]。也有直接用所得產(chǎn)物的峰面積作為分子個數(shù)代表進行計算平均聚合度的研究[30]。

2.2 香草醛-鹽酸法測定mDP

香草醛鹽酸法以甲醇為溶劑，香草醛能夠跟多聚體中每個組成單元發(fā)生酚醛縮合反應，能夠得到兒茶素聚合體的質量濃度。而以乙酸為溶劑時，香草醛只與末端兒茶素單元發(fā)生縮合反應，這樣可以得到兒茶素聚合體的摩爾濃度。這種方法在20世紀80年代提出[31]，至今已在多種植物原花青素的研究中應用，并對鹽酸濃度、反應溫度、反應時間等影響反應的因素進行了優(yōu)化[25,32]。

2.3 黏度法測定mDP

黏度法是測定高聚物分子量的方法，可用于測定溶液中大分子的聚合度，曾用于聚乙二醇、氧化聚乙烯蠟、殼寡糖等物質分子質量的測定。所用設備相對簡單、操作比較方便。趙平等[32]、劉亞靜[33]利用黏度法測定原花青素聚合度，使用烏氏黏度計測定不同原花青素樣品的流出時間，從而得到各樣品的特性黏度。再結合Mark-Houwink方程，確定比例系數(shù)K和擴張因子α，得到各樣品聚合度。研究證實用黏度法檢測得到的原花青素樣品聚合度于香草醛-鹽酸分析方法相當。

目前，更多研究綜合利用MALDI-TOF MS、ESI MS、NMR、裂解分析、HPLC等技術，對樣品中的兒茶素類物質進行分析[7,22,34-35]。

3 兒茶素按照聚合度進行分級分離的方法

按照聚合度對兒茶素進行分離純化的方法主要有兩類：一是根據(jù)聚合度不同的兒茶素的極性不同，溶解性不同，采用不同極性的有機溶劑進行梯度沉淀或洗脫，將聚合度不同的兒茶素分離開；二是利用色譜技術，通過分子篩、吸附色譜、液液萃取技術等將不同聚合度的兒茶素類物質分開。

3.1 利用兒茶素在不同溶劑中具有不同溶解度的性質

Labarbe等[36]利用氯仿/甲醇（75：25，V/V）將大部分單寧沉淀后，將兒茶素類物質沉淀置于一個惰性玻璃粉（200～400 μm）柱子頂部，然后逐漸增加洗脫液中甲醇的比例，將其分成不同部分。對各個部分進行定量且經(jīng)間苯三酚酸性裂解后進行定性分析。對總的提取物及各部分的檢測數(shù)據(jù)表明：這種方法可以達到定量的分離，同時也能夠監(jiān)測聚合度分布及其他的成分組成（原翠雀定的比例、?；剩?。分離后葡萄籽兒茶素類物質各部分的平均聚合度在4.7～17.4之間（總提取物為8.1），葡萄皮中其平均聚合度在9.3～73.8之間（總提取物為34.9）。該方法能夠在不經(jīng)前處理的情況下對較高聚合度的兒茶素類物質進行定量和定性的分析。

Saucier等[37]利用兒茶素類物質在不同溶劑（水、乙酸乙酯、甲醇和氯仿）中的溶解度不同，先用乙酸乙酯將葡萄籽提取液水相中的低聚體萃取出來，剩余水相旋轉蒸發(fā)，冷凍干燥后溶于甲醇，逐次加入氯仿，使氯仿占整個溶液體積的50%，60%，70%和75%，分次收集每次得到的沉淀，溶于甲醇。經(jīng)HPLC及凝膠色譜分離得到的不同組分，分析其平均聚合度及分子量。

Perret等[38]采用苯乙烯-二乙烯基苯柱，經(jīng)甲醇-氯仿的梯度溶液洗脫，增加洗脫液中甲醇的比例可以使更高聚合度的兒茶素溶解。從葡萄漿果中提取出的多聚兒茶素按照聚合度進行了分離。將收集到的各組分在親核試劑的作用下酸性裂解，結果發(fā)現(xiàn)所得各部分的mDP值從1.84至19.34呈線性增加。用MALDI-TOF MS進行半定性分析，其波譜顯示為兒茶素類物質的混合物。

3.2 利用色譜法對不同聚合度兒茶素進行分離

3.2.1 凝膠色譜柱分離

Sephadex LH-20和Toyopearl HW凝膠色譜多年來常用于兒茶素類物質的純化分離，通過不同比例甲醇和丙酮的梯度洗脫分離兒茶素聚合體，其作用原理有分子篩效應，但以吸附作用為主[7-8]。Taylor等[39]從啤酒花中提取原花青素，測得其mDP為7.8，MALDITOF/MS中可見的最大低聚體的聚合度為7。用sephadex LH-20柱，經(jīng)甲醇、水和丙酮梯度洗脫，將粗提物按照聚合度進行分離，在聚合度最高的組分中利用質譜檢測到了聚合度為20的聚合物，證明了預先分離在改進MS檢測中的有效性。Li等[8]利用sephadex LH-20柱對草莓果皮中的兒茶素類物質進行分離，首先用50%甲醇洗去酚酸、糖苷、兒茶素單體后，以90%甲醇（V/V）開始，逐漸減小甲醇的比例，提高丙酮的比例，以70%丙酮（V/V）結束，將兒茶素聚合物分成五部分。經(jīng)裂解分析這五部分平均聚合度依次為2.06，3.32，5.75，7.72和10.6。然而聚合度較高的兒茶素聚合體的MALDI-TOF-MS的信號明顯低于低聚體，有可能質譜的信息不能完全反映真實的聚合體分布情況。Li等[40]采用TSK HW-50F對柿子皮中的兒茶素類物質進行分離，依次用1：4，2：3，6：4的丙酮/甲醇（V/V）洗脫，三部分的平均聚合度分別為19，37和47。

3.2.2 C18固相萃取柱

Sun等[41]首次采用C18Sep-Pak柱按照聚合度將葡萄和葡萄酒中兒茶素類物質進行分離。首先用中性磷酸緩沖液除去酚酸，然后用乙酸乙酯洗脫得單體與寡聚體，柱子上吸附的多聚體用甲醇洗脫收集，之后再分離單體與寡聚體。利用這種方法[42]，研究者對不同葡萄品種釀制的葡萄酒、扁豆皮中的兒茶素類物質按照聚合度分成單體、寡聚體和多聚體三部分。

3.2.3 大孔樹脂

AB-8樹脂[30]對葡萄籽原花青素具有吸附量大、解吸率高、選擇性好等特點，適于分離并得到純度較高的葡萄籽原花青素。對其分級分離特性的研究表明，采用AB-8樹脂吸附分離原花青素，通過逐步提高乙醇體積分數(shù)（10%～50%），可以將原花青素按聚合度由低到高的順序依次洗脫下來，從低體積分數(shù)乙醇洗脫液中可以得到低聚體含量相對較高的原花青素組分。

3.2.4 薄層色譜法

Glavnik等[43]利用溶劑乙腈和甲苯：丙酮：甲酸（3：6：1，V/V），在日本虎杖根莖中初步鑒定了單體、單體沒食子酸鹽、二聚體、三聚體直至十聚體。乙酸乙酯可從單體分離到六聚物沒食子酸酯，而乙酸乙酯-甲酸乙酯（9：0.1，V/V）可從單體分離到六聚物。

3.2.5 利用NP-HPLC進行分離

用正相色譜高效液相色譜（NP-HPLC）可成功地將兒茶素類物質按照聚合度從小到大依次分離開。Gu等[44]采用硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇-甲酸-水混合為流動相梯度溶液，將聚合度為1～10的原花色素按照聚合度從小到大依次被洗脫出來，而聚合度大于10的原花色素以一個大峰最后出現(xiàn)。利用二醇固定相柱，酸化乙腈和甲醇-水作為流動相進行梯度洗脫，熒光檢測器，也可將可可豆中的原花青素按照聚合度分離，并進一步將方法擴展到制備水平[45]，該方法被用于樣品材料包括黑巧克力和牛奶巧克力、可可制品中原花青素的分析[46]。Pedan等[47]建立了一種NP-HPLC-online-DPPH分析方法，用于分離同源系列的原花青素，同時評價其抗氧化能力與聚合度的關系。

3.2.6 高速逆流色譜

以上色譜分離技術利用不同凝膠作為固定相，難以避免固相載體對兒茶素類物質的吸附效應。而高效逆流色譜（High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC）無需固態(tài)載體，是將樣品分配于兩相互不相溶的溶劑中，通過多層螺旋管的同步行星式離心運動，實現(xiàn)目標物的分離。其優(yōu)點是沒有載體吸附問題，進樣量可以達到毫克甚至克量級、回收率高[48]。Zhang等[49]通過優(yōu)化HSCCC條件，將葡萄籽提取物中的兒茶素類物質按平均聚合度由1.44～6.95依次分離為7個不同的餾分，而且產(chǎn)率較高，同時還獲得17種商業(yè)難以獲得的純度較高的原花青素純品。

4 兒茶素按照聚合度分級分離方法研究的困難與展望

雖然目前已經(jīng)有以上多種按照聚合度對兒茶素類物質進行分級分離的方法，但因為此類物質大量異構體的存在，對其組成成分的分析異常復雜，每一種方法都只能提供某一方面的信息。目前，對于這類物質的分析，一般是先經(jīng)過提取得到粗提物，然后利用溶解度分級沉淀或用不同溶劑分步驟洗脫柱色譜進行初步的分離純化，得到聚合度不同各部分。進一步通過質譜（ESIMS或MALDI-TOF/MS）進行分析，以了解兒茶素聚合體所達到的聚合度，及聚合度的大概分布。同時對聚合度不同的各部分進行裂解分析可以得到其平均聚合度及其構成單元，包括底端單元和延伸單元、棓?；潭鹊刃畔?。然而即使是通過這一系列復雜的分析步驟，在現(xiàn)有技術下要清晰了解某一體系中兒茶素類物質的組成成分仍然是難以實現(xiàn)的。

即便如此，研究人員已經(jīng)利用現(xiàn)有技術方法對大量植物中兒茶素的組成進行了研究分析，認識到不同聚合度兒茶素、組成單元不同的兒茶素本身具有不同的生物利用度，而且利用這些材料制成的食品口感也因為聚合度和組成單元不同而有差異。對兒茶素類物質結構、組成、生理功能與結構的關系等研究需要我們在兒茶素類物質結構分析技術方面取得進一步的突破。