蓮房原花青素的超聲波輔助提取及其穩(wěn)定性研究

黃愛妮，余萃，趙昕，李麗，杜楓，鄭樊

（武昌工學(xué)院城市建設(shè)學(xué)院，湖北武漢430065）

蓮房是蓮的干燥花托，蓮是湖北省傳統(tǒng)的水生經(jīng)濟(jì)作物，蓮子的鮮銷和加工對(duì)地方經(jīng)濟(jì)增長和農(nóng)戶增收有重要貢獻(xiàn)。近年來，蓮子產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷壯大，而蓮房作為主要的副產(chǎn)物并未得到有效的開發(fā)利用，反而因隨意丟棄和焚燒造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[1-3]。

蓮房具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可有效地抑制黑色素瘤細(xì)胞B16 的增殖，蓮房原花青素和銀杏內(nèi)酯聯(lián)用能夠改善東莨菪堿所致的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，與半胱氨酸聯(lián)用可有效地抑制氧化應(yīng)激損傷，改善記憶障礙[4-9]。蓮房中含有的原花青素是一種氧自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最好的天然抗氧化劑之一，具有廣泛的生物活性和藥理作用[10-14]。

通過查詢相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，目前提取原花青素的方法主要有乙醇浸提法、酶提取法等，超聲波輔助法在蓮房原花青素提取中的應(yīng)用比較少，相比較前面幾種方法，超聲波輔助提取法具有提取效率高、提取時(shí)間短、提取溫度低、保護(hù)有效成分等優(yōu)點(diǎn)[15-20]。為了提高蓮房的生物利用度，以蓮房為原料，采用超聲波輔助法提取蓮房中的原花青素，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以確定超聲波輔助提取蓮房原花青素的最佳工藝條件，并對(duì)提取的蓮房原花青素的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，為蓮房原花青素的開發(fā)利用提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮房：市售；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速多功能粉碎機(jī)（JY-1000A）：浙江省永康市象珠松青五金廠；電子分析天平（AR2140）：奧豪斯儀器有限公司；可見分光光度計(jì)（V-1100）：上海美普達(dá)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2）：國華電器有限公司；離心機(jī)（THZ-82B）：金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蓮房原花青素的提取方法

將蓮房去籽，用蒸餾水沖洗干凈，撕成莖部相連的條狀，在60 ℃條件下烘至質(zhì)量恒定，高速粉碎后過40 目篩，得到預(yù)處理后的蓮房粉。取一定量的蓮房粉，加入乙醇溶液，充分搖勻后進(jìn)行超聲波處理，超聲波處理結(jié)束后，在4 200 r/min 狀態(tài)下離心5 min，離心后取上清液，剩下的部分再加入10 mL 蒸餾水，充分搖勻后，同樣的條件下再離心一次。合并上清液，干燥至恒重，得到蓮房原花青素產(chǎn)品。

1.3.2 蓮房原花青素含量的測(cè)定方法

1.3.2.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法

用無水乙醇溶解并定容20 mg 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，得到1 mg/mL 的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。分別移取上述兒茶素標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇定容，搖勻后，分別制得濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取干凈試劑瓶依次加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL、3%香草醛-甲醇溶液5 mL、30%硫酸-甲醇溶液5 mL，混合后避光并在30 ℃水浴里反應(yīng)15 min，在500 nm 波長處測(cè)定吸光值，以兒茶素濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 蓮房原花青素提取率的計(jì)算

取一定量的蓮房原花青素產(chǎn)品，用無水乙醇稀釋至一定濃度作為待測(cè)液，取待測(cè)液1 mL，依次加入3%的香草醛-甲醇溶液5 mL，30%硫酸-甲醇溶液5 mL，混合后避光并在30 ℃水浴里反應(yīng)15 min，在500 nm波長處測(cè)定其吸光值。用無水乙醇作為待測(cè)液，在相同條件下，作一組空白對(duì)照試驗(yàn)。

利用兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算提取液中原花青素的質(zhì)量濃度，然后計(jì)算蓮房原花青素的提取率。

式中：n 為提取液稀釋倍數(shù)；c 為提取液中原花青素的質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為提取液體積，mL；m 為蓮房粉質(zhì)量，g。

1.3.3 蓮房原花青素提取工藝的優(yōu)化研究

選擇乙醇溶液作為蓮房原花青素的提取劑，采用超聲波輔助進(jìn)行提取，以蓮房原花青素的提取率為考察指標(biāo)，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]、超聲時(shí)間（10、15、20、25、30 min）、超聲功率（100、150、200、250、300 W）、超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃）等因素對(duì)蓮房原花青素提取效果的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間4 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

1.3.4 蓮房原花青素穩(wěn)定性的研究

蓮房原花青素的穩(wěn)定性一方面體現(xiàn)在它的含量變化，可以用保存率進(jìn)行判斷；另一方面體現(xiàn)在生物活性如抗氧化性。因此采用保存率和對(duì)DPPH 自由基的清除率來判斷原花青素的穩(wěn)定性。將提取得到的蓮房原花青素分別在不同溫度、不同光照條件進(jìn)行保存，計(jì)算原花青素的保存率和對(duì)DPPH 自由基的清除率，考察外界環(huán)境對(duì)原花青素穩(wěn)定性的影響。

1.3.4.1 蓮房原花青素保存率的測(cè)定方法

按照樣品與試劑比為1∶5（mL/mL）的比例，在樣品中加入對(duì)應(yīng)的1∶1（mL/mL）混合的1%濃度的香草醛和鹽酸溶液避光反應(yīng)20 min 后取出靜置于室溫25 ℃，在500 nm 波長處測(cè)定其吸光度，將吸光度以y 帶入兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程中即可計(jì)算得出原花青素質(zhì)量濃度x。原花青素保存率計(jì)算表達(dá)公式如下。

式中：μ 為蓮房原花青素保存率，%；x1為處理后蓮房原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；x0為處理前蓮房原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.4.2 蓮房原花青素對(duì)DPPH 自由基的清除率測(cè)定方法

將配制好的DPPH 甲醇溶液與待測(cè)液按照39∶1（mL/mL）快速充分混勻后，在紫外分光光度計(jì)設(shè)置波長為515 nm 下測(cè)定30 min 時(shí)的試驗(yàn)組吸光值A(chǔ)1，對(duì)照試驗(yàn)用蒸餾水代替樣品，測(cè)出對(duì)照組吸光值為A2，用無水乙醇作為空白組，測(cè)空白組吸光值為A0。原花青素對(duì)DPPH 自由基的清除率計(jì)算公式如下。

式中：C 為DPPH 自由基清除率，%；A1為試驗(yàn)組吸光值；A2為對(duì)照組吸光值；A0為空白組吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用1.3.2.1 的方法，繪制出兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。

圖1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of catechins

測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.396 4x+0.005 5，式中：x 為兒茶素的質(zhì)量濃度，mg/mL；y 為500 nm 處吸光值。R2=0.998 3。

2.2 蓮房原花青素提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蓮房原花青素提取率的影響

取預(yù)處理后的蓮房粉，加入一定量的乙醇溶液，采用超聲波進(jìn)行輔助提取，保持其它條件不變，分別改變乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%和80%，計(jì)算蓮房原花青素的提取率，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of procyanidins

從圖2 可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%到50%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，原花青素的提取率也隨之增大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%到80%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，原花青素提取率在逐漸減小。這可能是由于原花青素易溶于水，但植物中的原花青素通常與蛋白質(zhì)多糖等形成氫鍵，有機(jī)溶劑具有斷裂氫鍵的作用，因此乙醇-水的復(fù)合溶劑體系有利于原花青素的提取。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，破壞氫鍵能力增大，然而水穿透植物細(xì)胞的能力減弱，因此乙醇體積分?jǐn)?shù)增大會(huì)導(dǎo)致原花青素的提取率減小。由此可見，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%最為適宜。

2.2.2 料液比對(duì)蓮房原花青素提取率的影響

取預(yù)處理后的蓮房粉，加入一定量的乙醇溶液，采用超聲波進(jìn)行輔助提取，保持其它條件不變，分別改變料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），計(jì)算蓮房原花青素的提取率，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

首戰(zhàn)告捷的晚上,盧一平還能坐在電腦前寫作。當(dāng)林小敏接連把中獎(jiǎng)的消息告訴給他了,盧一平就再也寫不下去了。他站起身,著了魔一樣,在書房里來回走動(dòng)。他驚嘆自己怎么就看得這么準(zhǔn)呢,他驚嘆林小敏怎么下手就這么狠呢！又準(zhǔn)又狠,殺招凌厲,締造了兩人的黃金搭檔,成就了他們的強(qiáng)強(qiáng)組合！

圖3 料液比對(duì)原花青素提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of procyanidins

從圖3 可以看出，當(dāng)料液比在1∶10（g/mL）到1∶25（g/mL）時(shí)，隨著溶劑的增大，原花青素提取率也隨之增大，可能是由于溶劑量的增加有利于增大原花青素與溶劑的接觸面和溶液的傳質(zhì)推動(dòng)力，從而提高了原花青素的提取率；而當(dāng)料液比在1∶25（g/mL）到1∶30（g/mL）時(shí)，原花青素提取率開始下降，可能是因?yàn)殡S著溶劑量的增加超聲波破碎細(xì)胞的阻力增加，使細(xì)胞破碎程度下降，從而降低了原花青素的提取率。由此可見，選擇料液比為1∶25（g/mL）最為適宜。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)蓮房原花青素提取率的影響

取預(yù)處理后的蓮房粉，加入一定量的乙醇溶液，采用超聲波進(jìn)行輔助提取，保持其它條件不變，分別改變超聲時(shí)間為10、15、20、25、30 min，計(jì)算蓮房原花青素的提取率，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of procyanidins

從圖4 可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間在10 min 到25 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的增大，原花青素的提取率也不斷增大。超聲時(shí)間超過25 min 后，原花青素提取率增長曲線趨于平緩，這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間為25 min 時(shí)蓮房粉中原花青素已被基本提取，所以繼續(xù)延長超聲時(shí)間，對(duì)蓮房中的原花青素的提取效果影響較小，因此，選擇超聲時(shí)間為25 min 最為適宜。

2.2.4 超聲功率對(duì)蓮房原花青素提取率的影響

取預(yù)處理后的蓮房粉，加入一定量的乙醇溶液，采用超聲波進(jìn)行輔助提取，保持其它條件不變，分別改變超聲功率為100、150、200、250、300 W，計(jì)算蓮房原花青素的提取率，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 超聲功率對(duì)原花青素提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of procyanidins

從圖5 可以看出，當(dāng)超聲功率在100 W 到250 W時(shí)，隨著超聲功率的增大，原花青素提取率也隨之不斷增大；當(dāng)超聲功率在250 W 到300 W 時(shí)，隨著超聲功率的不斷增大，原花青素提取率反而呈下降趨勢(shì)。在超聲功率為250 W 時(shí)，提取率最大。因此，選擇超聲功率為250 W 最為適宜。

2.2.5 超聲溫度對(duì)蓮房原花青素提取率的影響

圖6 超聲溫度對(duì)原花青素提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of procyanidins

從圖6 可以看出，當(dāng)超聲溫度在20 ℃到40 ℃時(shí)，隨著超聲溫度的增加，原花青素提取率也隨之不斷增加；在超聲溫度為40 ℃時(shí)，提取率最高。這可能是因?yàn)殡S著溫度升高，增大了蓮房表皮細(xì)胞組織的滲透性，使表皮組織更容易分解，從而促進(jìn)原花青素的釋放，使原花青素提取率增大，但過高的溫度會(huì)導(dǎo)致原花青素分解，使原花青素提取率減小。由此可見，選擇超聲溫度為40 ℃最為適宜。

2.3 蓮房原花青素提取工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間4 個(gè)因素，以蓮房原花青素的提取率作為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。因素水平表見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

由正交試驗(yàn)的結(jié)果分析可得到超聲波輔助提取蓮房原花青素的最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1 ∶25（g/mL）、超聲功率250 W、超聲時(shí)間30 min。

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)得到的最佳工藝參數(shù)，在最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定蓮房原花青素平均提取率為6.45%，高于正交表中的最佳提取率，說明采用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取蓮房原花青素的工藝是可靠的。

2.4 蓮房原花青素穩(wěn)定性的分析結(jié)果

2.4.1 保存溫度對(duì)蓮房原花青素穩(wěn)定性的影響結(jié)果與分析

保持其它條件不變，將蓮房原花青素分別在10、30、50、70、90 ℃的溫度下進(jìn)行保存，考察溫度對(duì)蓮房原花青素穩(wěn)定性的影響，計(jì)算不同溫度保存后的蓮房原花青素的保存率和對(duì)DPPH 自由基的清除率，試驗(yàn)結(jié)果如圖7 所示。

圖7 保存溫度對(duì)蓮房原花青素保存率和DPPH 自由基清除率的影響Fig.7 Effect of storage temperature on the preservation rate and DPPH clearance rate of procyanidins

由圖7 可以看出，當(dāng)保存溫度越來越高時(shí)，蓮房原花青素保存率和DPPH 自由基清除率都呈現(xiàn)不同程度的明顯下降趨勢(shì)，其中突出表現(xiàn)在10 ℃到30 ℃的過程中原花青素保存率從94.1%下降到63.1%，下降程度較大；對(duì)DPPH 自由基的清除率也有一定程度的降低。表明隨著溫度的上升，蓮房原花青素降解程度會(huì)變大，穩(wěn)定性下降。因此，蓮房原花青素在運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及加工應(yīng)用中應(yīng)該盡量在較低的溫度下進(jìn)行。

2.4.2 光照對(duì)蓮房原花青素穩(wěn)定性的影響結(jié)果與分析

保持其它條件不變，將蓮房原花青素分別進(jìn)行避光處理、室內(nèi)自然光處理和室外太陽光處理，考察光照對(duì)蓮房原花青素穩(wěn)定性的影響，計(jì)算5 d 中不同光照條件下的蓮房原花青素保存率和DPPH 自由基清除率，試驗(yàn)結(jié)果如圖8 和圖9 所示。

圖8 光照對(duì)蓮房原花青素保存率的影響Fig.8 Effect of light on the preservation rate of procyanidins in lotus

圖9 光照對(duì)蓮房原花青素DPPH 自由基清除率的影響Fig.9 Effect of light on DPPH radical scavenging rate of procyanidins in lotus

由圖8 可以看出進(jìn)行光照處理后，隨著保存時(shí)間越來越長，蓮房原花青素保存率都呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。在避光處理的情況下，保存率下降的幅度最小，僅從96.1%降到85.1%，其次是室內(nèi)自然光，下降幅度最大的是室外太陽光，從88.2%降到了73.2%，因此避光保存可以減少蓮房原花青素質(zhì)量濃度的改變，即可以減少其降解程度，使其穩(wěn)定性更好。

由圖9 可以看出，隨著光照時(shí)間的增長，避光處理的蓮房原花青素DPPH 自由基清除率變化波動(dòng)很小，只從56.3%降到54.5%，室內(nèi)自然光次之，室外太陽光對(duì)DPPH 自由基清除率影響相對(duì)較大，從41.2%下降到了28.4%。因此，由上述分析可以得出，光照對(duì)蓮房原花青素保存率的影響偏大，對(duì)DPPH 自由基清除率的影響總體較小，避光處理更適合蓮房原花青素的保存。

3 結(jié)論

將蓮房進(jìn)行預(yù)處理后，以乙醇為提取劑進(jìn)行超聲波輔助提取，采用兒茶素作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照計(jì)算蓮房原花青素的提取率，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，蓮房原花青素的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1 ∶25（g/mL）、超聲功率250 W、超聲時(shí)間30 min，在此條件下，蓮房原花青素提取率為6.45%。對(duì)提取的蓮房原花青素的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，隨著溫度的上升，蓮房原花青素的穩(wěn)定性會(huì)降低；室外太陽光對(duì)蓮房原花青素的穩(wěn)定性影響較大。因此，蓮房原花青素在運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及加工應(yīng)用中應(yīng)該盡量在較低的溫度和避光的條件下進(jìn)行。