不同升溫方式下大紅袍做青中PPO和β-G活性變化對比

陳倩蓮，王芳，莫楚紅，邵宇航

（武夷學院茶與食品學院，福建武夷山354300）

武夷山大紅袍有“茶中之王”的美譽，屬烏龍茶類，其滋味濃厚甘醇、香氣優(yōu)雅純正，具有獨特的花果香，深受國內(nèi)外消費者的喜愛。大紅袍的初制工藝為：鮮葉→萎凋→做青→殺青→揉捻→干燥，在這些過程中茶葉受到包括機械損傷在內(nèi)的多種應力的影響，發(fā)生了復雜的酶促和非酶促作用[1]。其中做青是形成武夷巖茶品質(zhì)風格的關鍵工序。在茶葉加工中，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-G）對成茶的滋味和香氣起著重要作用，其中PPO 主要影響茶黃素的酶促合成[2]，β-G 主要影響萜烯類和芳香醇類配糖體的水解[3-4]。因此研究做青過程中PPO 和β-G 的活性變化具有重要意義。

諸多研究顯示做青間的溫濕度等環(huán)境因子和做青程度對PPO、β-G 的活性有不同的影響。魏新林等[5]采用嶺頭單叢品種鮮葉為原料研究不同做青溫濕度對茶葉香氣成分的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)中溫（25℃）和中濕（80%）的做青環(huán)境下青葉芳香物質(zhì)種類最多且含量高；過高、過低的濕度均抑制PPO 的活性，從而影響到一系列香氣形成的酶促反應，中濕有利于香氣形成。禹利君等[6]以毛蟹的三、四葉梢為原料，采用烏龍茶新工藝加工法研究做青期間PPO 活性的變化，結(jié)果表明適宜溫度的曬青和萎凋會提高PPO 的活性，做青時PPO 活性與含水量、pH 值呈正相關。王麗霞等[7]研究黃旦、肉桂在人工條件下萎凋（溫度20 ℃、相對濕度90%～95%）和室溫自然條件下萎凋（溫度25 ℃、相對濕度50%～60%）PPO 活性的變化對比，結(jié)果表明在人工條件下萎凋的兩個品種鮮葉酶活性均高于自然條件且肉桂高于黃旦。XU 等[8]以安溪鐵觀音鮮葉為原料研究在萎凋、做青過程中新梢不同部位的PPO 和β-G活性與發(fā)酵程度的關系，結(jié)果表明隨著新梢嫩度的降低PPO 和β-G 活性呈下降的趨勢，新梢的第一部分（芽和第一片葉）發(fā)酵程度遠高于其他部分（二到五莖葉）。張秀云等[9]以福鼎大白茶和櫧葉群體種鮮葉為原料，研究烏龍茶不同萎凋做青工藝對β-G 活性的影響，結(jié)果表明采用重做青時，兩個品種的β-G 活性變化趨勢基本一致，但櫧葉種中酶活性顯著高于福鼎大白茶，且在做青的過程中，酶活性的變化幅度隨著做青強度的增強而增大。張正竹等[10]以櫧葉品種的茶鮮葉為原料研究鮮葉在攤放過程中β-G 活性變化，結(jié)果表明隨著攤放時間的延長，葉組織逐步失水，細胞呼吸速率逐漸減弱，β-G 活性顯著升高。駱耀平等[11]采用紅芽佛手、毛蟹、水仙等7 個品種鮮葉為原料研究不同品種、葉位和葉齡間β-G 活性的變化，結(jié)果表明不同品種之間β-G 活性差異顯著，紅芽佛手酶活性最低；各品種酶活性在季節(jié)上的差異皆表現(xiàn)為秋季＞夏季＞春季；各品種酶活性會隨著新梢嫩度的降低而降低。

以上研究主要集中在廣東單叢、閩南烏龍等品種，未涉及到大紅袍品種的研究，不同品種的做青要求有差異，且各地烏龍茶的做青方式有所不同，不同的茶樹品種生化成分含量不同，最適宜的做青環(huán)境不同，因此本試驗研究炭火升溫和暖氣機組升溫條件下大紅袍做青中PPO 活性和β-G 活性變化對比，為改善大紅袍做青環(huán)境和提升品質(zhì)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

茶鮮葉：武夷山大紅袍駐芽三四葉，產(chǎn)地為武夷山下梅；檸檬酸、檸檬酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、石英砂、鄰苯二酚、脯氨酸、偏磷酸、碳酸鈉、對硝基苯酚（以上試劑均為分析純）：國藥集團化學試劑公司。

1.1.2 儀器與設備

YG-80 燃油熱水鍋爐暖氣機組：青州隆百特新能源有限公司；110 型綜合做青機：福建省安溪藝萌機械有限公司；Tes-1370 溫濕度二氧化碳測試儀：臺灣泰仕電子工業(yè)股份有限公司；XFE-6s 茶葉烘焙機：泉州新芳春制茶設備有限公司；YD5-10B 液氮罐：四川亞西低溫設備有限公司；YWS-26 恒溫水浴鍋：青島聚創(chuàng)環(huán)保設備有限公司；721S 可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；WP-UP-UV-20 純水超濾設備：河南凈邦環(huán)保工程有限公司；IMS-20 全自動雪花制冰機：常熟市學科電器有限公司；Neofuge23R 臺式高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司；DFY-200C高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；UV-1800 型紫外線可見分光光度計：上海美譜達儀器有限責任公司；DE-40L262 超低溫冰箱：天津偉恩實驗儀器科技有限公司；DHG-9030A 鼓風電熱恒溫干燥箱：上海姚氏儀器設備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 武夷巖茶加工工藝

武夷巖茶初制加工工藝流程為：鮮葉→萎凋→做青→殺青→揉捻→干燥。試驗設置兩種不同升溫方式的做青間，分別為傳統(tǒng)炭火升溫和暖氣機組升溫。

將曬青后的青葉放入兩個做青間的綜合做青機，上桶后吹冷風5 min→慢轉(zhuǎn)3 min→吹冷風3 min→萎凋30 min，開始做青，做青工藝具體參數(shù)設置見表1。

表1 大紅袍做青工藝參數(shù)Table 1 Parameters of fine-manipulation technology of Dahongpao

1.2.2 試驗樣品制備

用液氮固樣法取樣品（曬青葉、萎凋葉、搖青過程中的一搖葉至五搖葉、一靜葉至五靜葉的第二葉），然后將樣品用錫箔紙包裝后在液氮中固定，儲存于-80 ℃低溫冰箱中備用[12]。

1.2.3 做青間環(huán)境參數(shù)測定方法

使用Tes-1370 溫濕度二氧化碳測試儀分別測定兩種做青間的溫濕度及二氧化碳濃度，選取5 個測試點，分別為綜合做青機的中間位置（A）以及兩端的上部和下部（分別為B、C、D、E），每隔30 min 測一次。

1.2.4 酶活性的測定

1）多酚氧化酶活性測定采用鄰苯二酚法[13]。

2）β－葡萄糖苷酶活性測定參照吳喬的試驗方法[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 對數(shù)據(jù)進行歸類、分析和計算；采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同升溫方式做青間的環(huán)境參數(shù)

根據(jù)“A、B、C、D、E”5 個測定點與青葉的距離，A測定點離青葉最近，故按X=A×40%+（B+C+D+E）×15%公式對所測5 個點的溫度、濕度和CO2濃度進行計算。炭火升溫與暖氣機組升溫對做青間溫度、濕度和CO2濃度的變化對比分別見圖1、圖2、圖3。

圖1 做青間溫度變化對比Fig.1 Comparison of the temperature changes between two finemanipulation rooms

圖2 做青間濕度變化對比Fig.2 Comparison of the humidity changes between two finemanipulation rooms

圖3 做青間CO2 濃度變化對比Fig.3 Comparison of CO2 concentration changes between two fine-manipulation rooms

由圖1 可知，從做青開始到7.5 h，炭火做青間溫度平均值均高于暖氣機組做青間（高出0.1 ℃～2.6 ℃）；由圖2 可知，兩種做青間的濕度差別不大；由圖3 可知，從做青開始到6.0 h，炭火做青間的CO2濃度平均值高于暖氣機組做青間（高出0.024 kg/m3～1.346 kg/m3），這是由于炭火做青間采用炭火加溫方式，木炭在燃燒的過程中產(chǎn)生大量的CO2，因此炭火做青間的CO2濃度高于暖氣機組做青間。

2.2 不同升溫方式下大紅袍做青過程酶活性的變化

2.2.1 多酚氧化酶活性的變化對比

多酚氧化酶（PPO）是茶葉中一種重要的酶，能夠催化多酚類物質(zhì)氧化生成茶黃素、茶紅素等有色物質(zhì)，從而影響茶葉品質(zhì)。炭火做青間與暖氣機組做青間大紅袍做青過程PPO 活性鄰間變化率見表2。

由表2 可知，在炭火做青間中，相鄰工序鮮葉PPO活性變化幅度較大的有：曬青葉到萎凋葉（69.12%）、二靜葉到三搖葉（-31.50%）、三搖葉到三靜葉（70.34%）、三靜葉到四搖葉（-38.06%）、五搖葉到五靜葉（-30.88%）；在暖氣機組做青間中，一靜葉到二搖葉（33.84%）、二搖葉到二靜葉（-44.90%）、三搖葉到三靜葉（58.63%）酶活性變化幅度較大。炭火做青間與暖氣機組做青間大紅袍做青過程PPO 活性變化對比見圖4。

由圖4 可知，兩個做青間大紅袍的PPO 活性總體的變化趨勢基本一致，皆呈波動變化，均在第3 次靜置后酶活性達到最高，這是由于搖青導致葉緣摩擦、葉片受損，青葉細胞液泡破損，酶促前體物質(zhì)釋放，增大底物濃度，從而多酚氧化酶活性增高[15]。但到做青后期，兩個做青間大紅袍的PPO 活性皆呈下降趨勢，與曬青葉相比，炭火做青間和暖氣機組做青間做青葉PPO 活性皆顯著降低，分別減少了22.11%、28.82%，這可能是由于做青后期茶多酚氧化，鄰醌增多，鄰醌等物質(zhì)會抑制多酚氧化酶活性，使酶活性下降[16-17]。從總體上看，炭火做青間多酚氧化酶活性高于暖氣機組做青間，這可能是由于炭火做青間的平均溫度高于暖氣機組做青間，劉琨、陳盛虎等[18-19]研究發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶的最適反應溫度為30 ℃，與炭火做青間溫度更接近。對比曬青葉，大紅袍萎凋葉的PPO 活性增強，炭火做青間高于暖氣機組做青間41.45%，結(jié)合兩個做青間溫度分析，可能是因為炭火做青間溫度更高。但在第2 次靜置后酶活性差別較大，炭火做青間高于暖氣機組做青間86.85%。做青結(jié)束時，兩個做青間做青葉酶活性達到最低，兩者之間差異顯著（P＜0.05）。

表2 PPO 活性鄰間變化率Table 2 Change rate of PPO activity in the neighborhood%

圖4 PPO 活性的變化對比Fig.4 Comparison of PPO activity changes

2.2.2 β-葡萄糖苷酶活性的變化對比

β-葡萄糖苷酶（β-G）是烏龍茶香氣前體釋放過程中的一種重要水解酶，其活性的高低對茶葉香氣品質(zhì)影響較大。炭火做青間與暖氣機組做青間大紅袍做青過程β-G 活性鄰間變化率見表3。

表3 β-G 活性鄰間變化率Table 3 Change rate of β-G activity in the neighborhood%

由表3 可知，在炭火做青間中，相鄰工序鮮葉β-G活性變化幅度較大的有：曬青葉到萎凋葉（-37.19%）、萎凋葉到一搖葉（86.77%）、三靜葉到四搖葉（99.94%）；在暖氣機組做青間中，曬青葉到萎凋葉（31.08%）、三靜葉到四搖葉（43.22%）、五搖葉到五靜葉（33.89%）β-G活性變化幅度較大。炭火做青間與暖氣機組做青間大紅袍做青過程β-G 活性變化對比見圖5。

圖5 β-G 活性的變化對比Fig.5 Comparison of β-G activity changes

由圖5 可知，兩個做青間的β-G 活性在做青過程中的變化趨勢基本一致，皆呈“降→升→降”趨勢，均在第4 次搖青結(jié)束時酶活性達到峰值，炭火做青間與暖氣機組做青間的四搖葉酶活性分別為28.15、24.19 U/g，與曬青葉相比分別增加了67.26%、43.73%，皆具有顯著差異。從總體上看，做青前、中期炭火做青間大紅袍酶活性高于暖氣機組做青間，結(jié)合做青環(huán)境參數(shù)分析這可能是由于炭火做青間平均溫度高于暖氣機組做青間，在一定的溫度范圍內(nèi)，高溫能夠促進酶的活性；但到做青后期，暖氣機組做青間大紅袍五搖葉、五靜葉酶活性高于炭火做青間，這可能是由升溫方式的不同影響青葉的呼吸作用和酶促反應導致的，炭火做青間由于溫度和二氧化碳濃度較高，做青前期細胞酶促反應較活躍，使細胞過度失水導致酶蛋白變性，同時細胞膜透性增加，細胞質(zhì)中生化環(huán)境發(fā)生改變，對水解酶活性產(chǎn)生抑制作用，所以炭火做青間β-G 活性下降[12]。對比曬青葉，兩個做青間大紅袍萎凋葉、做青葉酶活性變化趨勢皆為炭火做青間降低、暖氣機組做青間升高。暖氣機組做青間萎凋葉酶活性高于炭火做青間108.70%，兩者之間差異顯著（P＜0.05），結(jié)合表2 分析這可能是由于炭火做青間萎凋葉PPO 活性增強抑制β-G 活性[14]；做青結(jié)束時，炭火做青間酶活性顯著降低，減少37.20%，暖氣機組做青間明顯升高，增加37.79%，暖氣機組做青間做青葉酶活性高于炭火做青間119.39%，兩者之間差異顯著（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

炭火做青間的溫度和CO2濃度皆比暖氣機組做青間高；對比曬青葉，兩個做青間的PPO 活性皆顯著降低，而β-G 活性的變化不同，炭火做青間顯著降低，暖氣機組做青間明顯升高。在做青過程中，PPO 活性的變化趨勢是先升高后下降，β-G 活性在搖青階段一般都高于靜置階段，這與禹利君等[6]、黃福平等[20]、楊銳[21]的研究結(jié)果相一致；暖氣機組做青間β-G 活性變化波動幅度小于炭火做青間，這與夏濤等[22]的研究結(jié)果相似，在紅茶萎凋期間，無論是低溫（26℃）萎凋還是高溫（35℃）萎凋，β-葡萄糖苷酶活性都有所增加，低溫萎凋酶活性比高溫萎凋酶活性增加的幅度小。做青結(jié)束時，炭火做青間酶活性顯著降低，減少了37.20%，暖氣機組做青間明顯升高，增加了37.79%，暖氣機組做青間做青葉酶活性高于炭火做青間119.39%，兩者之間差異顯著（P＜0.05）。這說明暖氣機組升溫能改善做青環(huán)境，延長做青過程中青葉的活力，促進香氣物質(zhì)的轉(zhuǎn)化生成。今后可在現(xiàn)有理論基礎上，與清潔化、智能化做青控制系統(tǒng)相結(jié)合，進一步探索有利于調(diào)控PPO 和β-G 活性的做青環(huán)境和工藝參數(shù)，從而早日解決烏龍茶做青工藝不易掌握、品質(zhì)不穩(wěn)定等難題。