殼聚糖復合磷酸鈉處理對蘋果青霉病的影響及部分機理

李伊涵，李燦嬰，蔣超男，李志強，葛永紅

（渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013）

蘋果（Malus domestica Borkh.）是薔薇科蘋果亞科蘋果屬植物，果實營養(yǎng)豐富，可為人體提供多種維生素和礦物質，是低熱量食物[1]。中國是蘋果生產和消費大國，但是每年因病害而產生的損失巨大。引起蘋果采后病害的病原物包括擴展青霉（Penicillium expansum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、互隔鏈格孢（Alternaria alternata）等[2]。其中P.expansum 引起的青霉病是最主要的病害，該菌主要通過傷口侵染，受侵染的果實不僅品質劣變，而且還會在體內產生展青霉毒素危害人體的健康[3]。青霉病的防治最有效的還是利用化學殺菌劑如苯并噻二唑類、咪酰胺類、苯二甲腈類等[4]。但由于對食品安全問題以及環(huán)保問題越來越多的關注，很多有效的化學殺菌劑使用逐漸受到限制。因此，研究開發(fā)綠色、環(huán)境友好的防腐保鮮技術勢在必行。

殼聚糖（chitosan，CTS），是乙酰氨基葡萄糖聚合物的脫乙酰產物，是一種堿性多糖[5]，具有生物相容性、生物降解性、抗菌性和易成膜的特性[6]。殼聚糖基薄膜作為一種新型的保鮮方法被廣泛應用[7]。殼聚糖可以有效阻擋病原菌的入侵，研究表明，殼聚糖復合拮抗酵母、多聚賴氨酸處理對獼猴桃和蘋果病害控制及保鮮都有一定的效果[8-10]。磷酸鈉（Na3PO4），是一種無機磷化合物，食品級磷酸鈉可用作品質改良劑、洗滌劑等[11]。磷酸鹽具有保護果蔬天然色澤的作用，可防止果蔬酶促褐變、增強抗氧化性和保水性[12]。已有研究證明，采后磷酸鈉處理能夠控制蘋果采后黑斑病的發(fā)生，并且能夠保持果實品質及抗氧化和能量水平[13-14]。此外，采后磷酸鈉處理還能夠通過調控糖代謝和細胞壁降解酶活性保持棗果實品質[15-16]。但有關CTS 復合磷酸鈉處理在蘋果病害控制中的研究鮮見報道。

本研究以“金冠”蘋果果實為試材，研究采后不同濃度CTS 復合磷酸鈉處理對果實青霉病的抑制程度，同時探討其對果實抗氧化酶活性和苯丙烷途徑關鍵酶活性及產物含量的影響，以期為果實采后病害的綠色控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘金冠’蘋果果實采自錦州市蘋果園，選取質地優(yōu)良、大小均勻、無機械損傷及病蟲害的果實用紙箱包裝，當天運回實驗室處理。供試P.expansum 為渤海大海食品科學工程學院采后保鮮實驗室保存菌種，使用前在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上25 ℃活化。殼聚糖（CTS，脫乙酰度≥99%）：合肥博美生物科技有限責任公司；磷酸鈉（Na3PO4，聚合度144-335）：山東西亞化工有限公司。

UV-2550 分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；5424R 小型冷凍離心機：德國eppendorf 公司；HS-1300-U 超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；MIR-254 型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；A 11 basic 研磨機：德國IKA 集團。

1.2 方法

1.2.1 CTS 和磷酸鈉處理

配制1.0%、1.5%、2.0%的CTS 溶液，用10 mL/L醋酸溶液溶解后加入0.5 mg/mL 磷酸鈉，用1.0 mol/L的氫氧化鈉調節(jié)pH 值至5.6。選擇好的果實分別在殼聚糖、殼聚糖和磷酸鈉復合溶液、磷酸鈉溶液和清水（對照）中浸泡10 min，取出自然晾干，貯藏于（24±1）℃，相對濕度50%～60%環(huán)境中待用，各處理用果實30 個。

1.2.2 孢子懸浮液的配制及損傷接種

參照MENG 等[17]的方法。用血球計數(shù)板將孢子懸浮液的最終濃度調為1×105個/mL。用75%乙醇對果實表面進行消毒處理，然后在果實赤道部位均勻刺孔4 個（3 mm×3 mm）。自然晾干后每個孔內接種10 μL的P.expansum 孢子懸浮液，等孔內晾干后裝箱置于常溫貯藏[溫度（24±1）℃，相對濕度50%～60%]。于接種后第7 天觀察發(fā)病率并測定病斑直徑，篩選出最佳復合處理用于后續(xù)研究。

1.2.3 取樣

參照BI 等[18]的方法。用1%CTS（1.2.2 篩選出的最佳濃度）結合磷酸鈉和清水（對照）處理果實105 個，分別于貯藏第0 天、第2 天、第4 天、第6 天、第8 天、第10 天、第12 天取皮下5 mm～10 mm 處果肉組織，液氮速凍后錫箔紙包裝標記，放入-80 ℃冰箱保存待用。每次取樣各處理用果實15 個。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 過氧化氫（H2O2）含量

參考GE Y H 等[19]的方法并修改。取3.0 g 冷凍果肉組織，加入3.0 mL 預冷丙酮研磨后，在低溫條件下離心20 min（10 000×g）。取2.0 mL 上清液，加0.05 mL濃氨水和0.04 mL 20%的四氯化鈦，反應5 min 后同樣條件離心10 min，然后用冷丙酮洗滌3 次，最后用3.0 mL 1.0 mol/L H2SO4溶液將洗滌后的沉淀溶解，測定410 nm 處的吸光值。用μmol/g FW 表示H2O2含量。

1.2.4.2 過氧化氫酶（catalase，CAT）活性

參考REN 等[20]的方法并修改。取3.0 g 冷凍果肉組織，加入3.0mL 經4 ℃預冷的100 mmol/L pH 值為7.5的磷酸緩沖液，在冰浴條件下研成勻漿，于4 ℃、10 000×g離心25 min，上清液即為粗酶液。反應體系包括100 μL粗酶液和3.0 mL 10 mmol/L H2O2。然后測定反應體系在240 nm 的吸光值，酶活性用U 表示，1 U=△OD240/（min·mg 蛋白）。

1.2.4.3 抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性

參照REN 等[20]的方法并修改。反應體系包括200 μL粗酶液、0.8 mL 3.0 mmol/L 抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、2.0 mL 100 mmol/L 磷酸緩沖液和0.5 mL 0.5 mmol/L H2O2，加入H2O215 s 后開始測其在290 nm的吸光值，酶活性用U 表示，1 U=0.01△OD/（min·mg 蛋白）。

1.2.4.4 谷胱甘肽還原酶（glutathionereductase，GR）活性

參照REN 等[20]的方法。反應體系包含0.2 mL 粗酶液、0.1 mL 5.0 mmol/L 氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、3.0 mL 100 mmol/L 磷酸緩沖液和30 μL 3.0 mmol/L 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH），加入NADPH 15 s 后開始測其在340 nm 處的吸光值，酶活性用U 表示，1 U=0.01△OD/（min·mg 蛋白）。

1.2.4.5 過氧化物酶（peroxidase，POD）活性

參照LIU 等[21]的方法。反應體系包含200 μL 粗酶液、2.5 mL 0.025 mol/L 愈創(chuàng)木酚和0.2 mL 0.25 mol/L H2O2，測定反應混合液在470 nm 處的吸光度值，酶活性用U 表示，1 U=0.01△OD/（min·mg 蛋白）。

1.2.4.6 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）活性

參照LIU 等[21]的方法并修改。反應體系為200 μL粗酶液、0.5 mL 0.02 mol/L 苯丙氨酸和3.0 mL 蒸餾水，于290 nm 處測吸光度，然后于30 ℃水浴30 min，加入200 μL 6.0 mol/L HCl 終止反應，再次于290 nm 處測定其吸光度值。酶活性用U 表示，1 U=0.01△OD/（min·mg 蛋白）。

1.2.4.7 蛋白含量

參照曹建康等[22]的方法用考馬斯亮藍方法測定蛋白含量。

1.2.4.8 總酚、類黃酮和木質素含量

參照LIU 等[21]的方法并修改。取3.0 g 冷凍果肉組織，液氮研磨后加如1%預冷HCl-甲醇溶液5.0 mL 繼續(xù)研成勻漿，然后將勻漿移入離心管中，于10 000×g 條件下低溫離心15 min。取上清液分別于280 nm 和325 nm 處測定吸光度值。用OD280/g FW 表示總酚含量；用OD325/g FW 表示類黃酮含量。

參照Liu 等[21]方法并修改。取CTS 復合磷酸鈉處理和對照蘋果3.0 g 冷凍果肉組織，液氮研磨后加入3.0 mL 95%乙醇溶液，研成勻漿，然后轉入離心管，于10 000×g 條件下低溫離心10 min，棄上清液，沉淀物用95%乙醇沖洗3 次，再用正己烷混合溶液沖洗3次，干燥后加25%溴化乙酰冰醋酸溶液1.0 mL，于70 ℃恒溫水浴30 min，加1.0 mL 2.0 mol/L NaOH 終止反應，加2.0 mL 冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L 鹽酸羥胺，再次離心，取上清液0.5 mL 加4.0 mL 冰醋酸，于280 nm 處測定吸光度值，用OD280/g FW 表示木質素含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

3 次重復的試驗數(shù)據(jù)，用Microsoft Excel 2007 計算平均值并作圖，用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進行最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）分析。

2 結果與分析

2.1 CTS 復合磷酸鈉處理對損傷接種P.expansum 果實病斑直徑的影響

CTS 復合磷酸鈉處理對損傷接種P.expansum 果實病斑直徑的影響見圖1。

殼聚糖、磷酸鈉單獨處理和復合處理均顯著降低了蘋果果實的病斑直徑，而且CTS 復合磷酸鈉處理的病斑直徑均顯著小于CTS 和磷酸鈉單獨處理，其中以1.0%CTS 復合磷酸鈉處理的病斑直徑最?。▓D1）。因此，選擇1.0%CTS 復合磷酸鈉處理進行下一步研究。

2.2 CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實H2O2 含量和CAT 活性的影響

CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實H2O2含量和CAT 活性的影響見圖2。

圖1 不同濃度CTS 復合磷酸鈉處理對損傷接種P.expansum 蘋果果實病斑直徑的影響Fig.1 Effects of different concentrations of chitosan combined with trisodium phosphate treatment on lesion diameter of apple fruit inoculated with P.expansum

圖2 采后CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實H2O2 含量和CAT活性的影響Fig.2 Effects of postharvest chitosan combined with trisodium phosphate on the H2O2 content and CAT activity in apple fruit

H2O2含量的升高有利于細胞壁蛋白氧化交聯(lián)使細胞壁加厚，還可作為信號分子誘導植物體內防御反應。CTS 復合磷酸鈉處理果實H2O2含量在整個貯藏期間均高于對照果實，并且在貯藏第4 天到第12 天顯著高于對照（圖2）。在復合處理果實中H2O2含量分別在貯藏第4 天和第10 天出現(xiàn)兩個高峰，分別是對照果實的1.19 倍和1.51 倍，而對照果實僅在貯藏第4 天出現(xiàn)峰值。然而，H2O2的過量積累會損傷細胞，而CAT 可以清除果實體內過多的H2O2，使其轉化成水和氧氣。CTS復合磷酸鈉處理和對照果實CAT 活性均呈先上升后下降的趨勢，但二者的出峰時間不同，復合處理的高峰出現(xiàn)在貯藏第4 天，而對照果實高峰在貯藏第8 天（圖2）。CTS 復合磷酸鈉處理果實中CAT 活性在貯藏第4 天和第6 天顯著高于對照果實，分別是對照的1.22 倍和1.10 倍。

2.3 CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實APX 和GR 活性的影響

CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實APX 和GR 活性的影響見圖3。

圖3 采后CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實APX 和GR 活性的影響Fig.3 Effects of postharvest chitosan combined with trisodium phosphate on the APX and GR activities in apple fruit

APX 和GR 是抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)的兩個關鍵酶，可以直接清除果實體內H2O2，維持果實體內抗氧化劑AsA 和GSH 的平衡。在貯藏第2 天到第12 天，CTS 復合磷酸鈉處理果實APX 活性均顯著高于對照組，在第8 天差異最大，是對照果實的1.61 倍。CTS 復合磷酸鈉處理果實的GR 活性在整個貯藏期間均高于對照果實（圖3），在貯藏第6 天到第12 天均顯著高于對照，且在第6 天出現(xiàn)峰值，處理果實GR 活性是對照的1.27 倍。

2.4 CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實PAL 和POD 活性的影響

CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實PAL 和POD 活性的影響見圖4。

圖4 采后CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實PAL 和POD活性的影響Fig.4 Effects of postharvest chitosan combined with trisodium phosphate on the PAL and POD activities in apple fruit

PAL 是控制苯丙烷代謝途徑速度的酶，通過調節(jié)下游產物的積累，提高植物對病原物侵染的抵抗力。在貯藏第0 天到第12 天，CTS 復合磷酸鈉處理的PAL活性均高于對照果實，兩個處理都在第6 天升到高峰，處理果實PAL 活性是對照的1.20 倍（圖4）。果實體內POD 參與酚的氧化反應并生成對病原菌毒性較高的醌類物質，并參與木質素的合成。在貯藏第0 天到第12 天，處理和對照果實POD 活性整體都呈先上升后下降趨勢，CTS 復合磷酸鈉處理果實POD 活性在貯藏第4 天到第10 天顯著高于對照組，其中在第8 天活性最高，是對照果實的1.34 倍（圖4）。

2.5 CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實總酚和類黃酮含量的影響

CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實總酚和類黃酮含量的影響見圖5。

酚類和類黃酮是苯丙烷代謝的主要產物，本身具有直接的抑菌作用。在貯藏第0 天到第12 天，CTS 復合磷酸鈉處理果實總酚含量均高于對照組，且在第4天到第8 天處理果實總酚含量顯著高于對照，分別是對照果實的1.16 倍、1.23 倍和1.19 倍（圖5）。CTS 復合磷酸鈉處理果實類黃酮含量在整個貯藏期間均高于對照組，整體呈先上升后下降趨勢，其中在第8 天和第10 天顯著高于對照，分別是對照的1.23 倍和1.14倍（圖5）。

圖5 采后CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實總酚和類黃酮含量的影響Fig.5 Effects of postharvest chitosan combined with trisodium phosphate on the total phenolic compounds and flavonoids contents in apple fruit

2.6 CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實木質素含量的影響

CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實木質素含量的影響見圖6。

圖6 采后CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實木質素含量的影響Fig.6 Effects of postharvest chitosan combined with trisodium phosphate on the lignin content in apple fruit

木質素是重要的次生代謝產物，其合成能使細胞壁增厚以抵御病原菌的侵入和擴展。在貯藏第6 天到第10 天顯著高于對照，二者均在第8 天出現(xiàn)峰值，CTS 復合磷酸鈉處理果實木質素含量是對照的1.22倍（圖6）。

3 討論

CTS 和磷酸鈉都有抗氧化和抑菌能力，并且都可以應用于食品保鮮和加工中[23]。已有研究證明，采后殼聚糖復合拮抗酵母、1-甲基環(huán)丙烯、水楊酸等可以有效控制水果采后病害[24-26]。本研究表明，CTS 和磷酸鈉單獨處理對病斑直徑均有抑制作用，并且CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果青霉病的抑制具有協(xié)同作用，其中以1.0%CTS 復合0.5 mg/mL 磷酸鈉處理對蘋果果實損傷接種擴展青霉的病斑抑制效果最佳。

活性氧爆發(fā)是植物的抗病初期的重要反應之一，其中H2O2性質相對穩(wěn)定是研究活性氧代謝的首選[27]。H2O2的積累不僅有利于細胞壁蛋白氧化交聯(lián)使細胞壁加厚，還能作為信號分子激活植物體內防衛(wèi)反應[28]。但過高濃度的H2O2會破壞細胞的結構進而影響其功能，具有毒性作用[29]。CAT 是果實體內清除H2O2的關鍵酶，使其轉化為H2O 和O2。本試驗發(fā)現(xiàn)，CTS 復合磷酸鈉處理在貯藏前期提高了H2O2含量，有利于啟動果實體內的防御反應，而后期隨著CAT 活性的誘導分解過多的H2O2，從而降低對果實的傷害。芒果果實上的研究證明，采后殼聚糖處理促進了果實的H2O2積累，并且誘導了CAT 活性的升高[30]。此外，采后磷酸鈉處理也能夠誘導蘋果果實H2O2的積累，提高其對黑斑病的抗性[13]。APX 是AsA-GSH 循環(huán)中的關鍵酶，以抗壞血酸為底物，可以將H2O2轉變成H2O[31]。GR 以氧化型谷胱甘肽為底物將H2O2轉變成H2O[32]，還能再生重要的抗氧化劑AsA[33]。楊梅上的研究證明殼聚糖處理提高了APX 和GR 的含量，進而增強果實活性氧的清除能力[34]，通過增強APX 和GR 的活性來清除過量的H2O2，并促進AsA 生成，來維持果實體內抗氧化劑AsA 和GSH 的平衡，在果實細胞活性氧的清除抗氧化方面發(fā)揮著重要作用。

果實采后通過激活一系列的代謝可以提高傷口的愈傷能力，減少病原菌的入侵[35]，其中苯丙烷代謝在愈傷過程中發(fā)揮重要作用[36-37]。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷類代謝中的催化苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶[38]，并且可以對一些抗菌物質的合成和木質化反應進行調控[39]。木質素是構成植物細胞壁的主要成分之一。CTS 和磷酸鈉復合處理后，果實木質素含量升高，有助于細胞形成交織網來強化細胞壁，增強植物的抗病能力和硬度，抵御病原菌的侵入和擴展，進而抑制青霉病的發(fā)生。這與處理后山藥和草莓的木質素含量升高，增強果實的抗病能力的結論一致[40-41]。酚類物質是典型的活性氧自由基清除劑，已有殼聚糖和寡聚糖處理櫻桃和草莓提高了總酚、類黃酮的含量，使果實增強抗氧化、抗衰老能力的結論與本試驗CTS 顯著提高了采后果實中總酚含量，有效防治果實采后青霉病的發(fā)生的結論一致[42]。

4 結論

采后CTS 復合磷酸鈉處理對蘋果果實青霉有顯著抑制效果，復合處理提高了果實在貯藏過程中PAL和POD 的活性并增加了總酚、類黃酮和木質素的含量，此外復合處理還提高了果實H2O2含量、CAT、APX和GR 活性。由此表明，CTS 復合磷酸鈉處理對青霉病的控制與提高蘋果果實的抗氧化能力并且激活體內苯丙烷代謝相關。