二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

王文婷，彭釗，鄧祖亮，周軒，劉力

湘南學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南郴州423000

胰腺癌是臨床常見(jiàn)的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，由于其起病隱匿，癥狀和體征不典型，確診時(shí)往往已錯(cuò)過(guò)了根治性手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)［1-2］。有研究報(bào)道，僅有20%的胰腺癌患者能夠從根治性手術(shù)中獲益，但其術(shù)后5 年生存率仍不足5%［3］。因此，探索胰腺癌有效的治療策略一直是近年研究的熱點(diǎn)。吉西他濱是一種嘧啶核苷類(lèi)似物，是美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)的一線(xiàn)抗腫瘤藥物，可通過(guò)抑制核苷酸還原酶和DNA 聚合酶而發(fā)揮抗腫瘤作用。吉西他濱作為晚期胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)一線(xiàn)治療藥物在臨床上已應(yīng)用二十余年，但其化療效果并不理想［1］。二甲雙胍一直是糖尿病的一線(xiàn)治療藥物。近年研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠通過(guò)抑制有絲分裂繼而抑制細(xì)胞分裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖；還可通過(guò)降低循環(huán)胰島素水平，阻礙胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子1 軸的促腫瘤作用［4-5］。因此，二甲雙胍被認(rèn)為是目前最有前途的腫瘤治療佐劑。但二甲雙胍能否使胰腺癌吉西他濱化療獲益尚不清楚。2020 年3 月—10 月，本研究探討了二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1（以下稱(chēng)PANC-1細(xì)胞），購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。吉西他濱、二甲雙胍無(wú)菌粉末，純度均＞95%，購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。Multiskan FC 基本型酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；IX70-81FZ 型倒置相差顯微鏡，購(gòu)自日本Olympus 公司。MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、GAPDH 一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物干預(yù) 將PANC-1 細(xì)胞接種于含10% FBS 和1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合超過(guò)80%時(shí)，按1∶3 傳代。取傳2代以上、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PANC-1 細(xì)胞，接種于96 孔板，然后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合60%左右時(shí)，一部分加入適量二甲雙胍，使二甲雙胍終濃度分別為0、5、10、20、40 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；一部分加入適量吉西他濱，使吉西他濱終濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT法。不同終濃度二甲雙胍和吉西他濱干預(yù)24 h，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，然后每孔加入DMSO 150 μL，慢慢震蕩混勻，使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀于570 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞增殖活性=實(shí)驗(yàn)孔OD570值/對(duì)照孔OD570值×100%。每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。以能夠使細(xì)胞增殖活性降至50%左右時(shí)的二甲雙胍和吉西他濱濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取傳2 代以上、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PANC-1細(xì)胞，接種于96孔板，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、二甲雙胍組、吉西他濱組、聯(lián)合用藥組，然后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合60%左右時(shí)，用10 μL 移液器吸頭垂直于孔板制作“一”字劃痕，PBS 沖洗去除不貼壁細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下拍照，記錄0 h 劃痕寬度。然后二甲雙胍組、吉西他濱組、聯(lián)合用藥組加入適量二甲雙胍或（和）吉西他濱，正常對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，倒置相差顯微鏡下拍照，記錄24 h 劃痕寬度。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。取傳2 代以上、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PANC-1 細(xì)胞，接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合60%左右時(shí)，二甲雙胍組、吉西他濱組、聯(lián)合用藥組加入適量二甲雙胍或（和）吉西他濱，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，RIPA 裂解液充分裂解，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后加入上樣緩沖液，水浴變性。取變性蛋白50 μg，SDS-PAGE 分離蛋白。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。取出PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉，分別加入E-cadherin、Vimentin、GAPDH 一抗（稀釋比均為1∶1 000），孵育過(guò)夜。次日，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比為1∶3 000），室溫孵育，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒化學(xué)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH 為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni 校正法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍和吉西他濱對(duì)PANC-1 細(xì)胞增殖活性的影響 經(jīng)0、5、10、20、40 mmol/L二甲雙胍干預(yù)，PANC-1 細(xì)胞增殖活性分別為（100.0 ± 3.0）%、（90.5±10.3）%、（75.6±15.0）%、（46.3±16.9）%、（33.6±4.2）%，隨著二甲雙胍濃度升高，PANC-1細(xì)胞增殖活性逐漸降低，呈濃度依賴(lài)性（F=29.14，P＜0.01）。20 mmol/L 二甲雙胍干預(yù)時(shí)，PANC-1 細(xì)胞增殖活性降至50%左右，故以20 mmol/L 二甲雙胍進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

經(jīng)0、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L 吉西他濱干預(yù)，PANC-1 細(xì)胞增殖活性分別為（100.0 ± 7.5）%、（86.7 ± 9.1）%、（68.2 ± 8.6）%、（55.1 ± 7.0）%、（35.2±5.4）%，隨著吉西他濱濃度升高，PANC-1細(xì)胞增殖活性逐漸降低，呈濃度依賴(lài)性（F=66.88，P＜0.01）。0.4 μmol/L 吉西他濱干預(yù)時(shí)，PANC-1 細(xì)胞增殖活性降至50%左右，故以0.4 μmol/L 吉西他濱進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組細(xì)胞遷移能力比較 正常對(duì)照組、二甲雙胍組、吉西他濱組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移率分別為（99.93 ± 1.09）%、（77.36 ± 6.32）%、（71.00 ±5.29）%、（37.82±2.55）%。二甲雙胍組、吉西他濱組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移率均低于正常對(duì)照組，聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移率均低于二甲雙胍組、吉西他濱組（P均＜0.05）。而二甲雙胍組與吉西他濱組細(xì)胞遷移率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組E-cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 各組E-cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與二甲雙胍組比較，#P＜0.05；與吉西他濱組比較，△P＜0.05。

Vimentin 組別E-cadherin 1.000±0.027 0.857±0.059*0.840±0.057*0.548±0.053*#△正常對(duì)照組二甲雙胍組吉西他濱組聯(lián)合用藥組1.100±0.111 1.311±0.091*1.345±0.049*2.121±0.052*#△

3 討論

胰腺癌是一種惡性程度非常高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外均呈明顯上升趨勢(shì)。胰腺癌起病隱匿，癥狀和體征不典型，確診時(shí)往往已錯(cuò)過(guò)了根治性手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)［1-2］。臨床研究證實(shí)，胰腺癌患者即使能夠接受根治性手術(shù)，術(shù)后也必須接受輔助化療，才能進(jìn)一步提高生存期［6］。

吉西他濱是一種嘧啶核苷類(lèi)似物，是目前治療胰腺癌最常用的化療藥物［7］，不僅能緩解胰腺癌癥狀，提高患者生活質(zhì)量，還能延長(zhǎng)患者生存期。但吉西他濱作為治療晚期胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)一線(xiàn)藥物臨床應(yīng)用已有二十余年，在化療過(guò)程中易產(chǎn)生獲得性耐藥，導(dǎo)致其化療效果并不理想［1，8］。因此，提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性是提高其化療效果的重要措施。

二甲雙胍是2 型糖尿病的一線(xiàn)治療藥物。近年研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠顯著抑制乳腺癌、肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤進(jìn)展，具有顯著地抗腫瘤作用。在人類(lèi)各種腫瘤中，通常存在磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路表達(dá)不平衡，該信號(hào)通路異常激活可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分化異常，從而引起腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［9-10］。有研究報(bào)道，吉西他濱的耐藥機(jī)制與PI3K 信號(hào)通路異常調(diào)節(jié)有關(guān)。YOSHIDA 等［11］研究報(bào)道，二甲雙胍能夠通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，提高耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。越來(lái)越多證據(jù)表明，二甲雙胍對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用，并且聯(lián)合其他化療藥物能夠明顯提高化療效果，被認(rèn)為是目前最有前途的腫瘤治療佐劑［12-15］。由此推測(cè)，二甲雙胍有可能提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性，但目前相關(guān)報(bào)道較少。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著二甲雙胍和吉西他濱濃度升高，PANC-1 細(xì)胞增殖活性逐漸降低，呈濃度依賴(lài)性，提示二甲雙胍和吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖均具有一定抑制作用。本研究選擇能夠使胰腺癌細(xì)胞增殖活性降至50%左右時(shí)的二甲雙胍和吉西他濱濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍組、吉西他濱組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移率均低于正常對(duì)照組，聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移率均低于二甲雙胍組、吉西他濱組，而二甲雙胍組與吉西他濱組細(xì)胞遷移率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示二甲雙胍能夠提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性。

腫瘤局部浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和化療耐藥是胰腺癌患者預(yù)后較差的主要原因，而這些原因均與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要特征是上皮標(biāo)志物（如E-cadherin）丟失和間充質(zhì)標(biāo)志物（如Vimentin）增加。有研究報(bào)道，二甲雙胍能夠通過(guò)靶向癌相關(guān)成纖維細(xì)胞抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移［16-17］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍組、吉西他濱組、聯(lián)合用藥組E-cadherin、Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于正常對(duì)照組，聯(lián)合用藥組E-cadherin、Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于二甲雙胍組、吉西他濱組；而二甲雙胍組與吉西他濱組E-cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱能夠上調(diào)胰腺癌細(xì)胞E-cadherin 蛋白表達(dá)、下調(diào)Vimentin 蛋白表達(dá)，即二者聯(lián)合可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，在含有吉西他濱的化療方案中加入一定劑量的二甲雙胍可能是一種比較有前途的胰腺癌化療策略。

綜上所述，二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱能夠抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性。但二者聯(lián)合的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探索。