膠質(zhì)瘤組織lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表達(dá)變化及其臨床意義

王寧，于海，宋千，廉民學(xué)，鮑剛，何百祥

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安710061

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的腫瘤之一，以WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類Ⅲ、Ⅳ級(jí)多見［1］。手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放化療或免疫治療是膠質(zhì)瘤最常見的治療手段，但其治療后短期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，患者預(yù)后較差，中位生存期一般不超過15個(gè)月［2-3］。膠質(zhì)瘤的發(fā)病部位較為特殊，臨床表現(xiàn)無特異性，CT、MRI 等影像學(xué)檢查亦缺乏特征性，故其術(shù)前診斷困難。因此，尋找靈敏度高、特異度強(qiáng)的膠質(zhì)瘤分子標(biāo)志物對(duì)其早期診斷和靶向治療具有重要意義。HOXA 反義轉(zhuǎn)錄物髓系異構(gòu)體1（HOTAIRM1）是人類7 號(hào)染色體上的一種長鏈非編碼RNA（lncRNA），雖然不編碼蛋白質(zhì)，但可通過調(diào)控基因的表達(dá)參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，如通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78 表達(dá)，幫助蛋白正確折疊，從而促進(jìn)細(xì)胞生存并抑制其凋亡［4］。有研究報(bào)道，lncRNA HOTAIRM1 表達(dá)失調(diào)可介導(dǎo)胃癌的發(fā)生、發(fā)展［5］。微小RNA（miRNA）是一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)活性的內(nèi)源性小分子RNA，能夠與靶基因mRNA 的3′端非編碼區(qū)特異性結(jié)合，從而降解靶基因mRNA 或抑制其翻譯，進(jìn)而在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［6］。miR-129-5p 是miRNA 家族成員之一。有研究報(bào)道，子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌組織miR-129-5p 表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)變化與患者臨床病理特征密切相關(guān)［7-8］。但目前關(guān)于lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)變化的報(bào)道較少。2014年5月—2017年5月，本研究觀察了膠質(zhì)瘤組織lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 表達(dá)變化，并探討其臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的膠質(zhì)瘤患者83例（觀察組），均經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查證實(shí)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合膠質(zhì)瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次確診；③接受外科手術(shù)治療，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；④預(yù)計(jì)生存期超過6個(gè)月；⑤病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤者；②伴有顱內(nèi)其他疾病者；③合并心、肝、腎等重要臟器功能不全者；④妊娠期或哺乳期婦女。其中，男51 例、女32 例，年齡26～77（55.62 ± 8.23）歲，BMI 19～26（22.08 ± 2.12）kg/m2，合并高血壓21 例、糖尿病18 例、高脂血癥15例；腫瘤位置：顳部45例，額部38例；腫瘤直徑：＜4 cm 39例，≥4 cm 44例；病理類型：星形細(xì)胞瘤49 例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤34 例；WHO 分級(jí)：Ⅰ、Ⅱ級(jí)53例，Ⅲ、Ⅳ級(jí)30例。

同期選擇因顱腦損傷在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受外科手術(shù)治療者55例（對(duì)照組），手術(shù)切除組織經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)為正常腦組織。其中，男34 例、女21 例，年齡25～78（53.49 ± 8.70）歲，BMI 19～25（22.34 ± 2.05）kg/m2，合并高血壓13例、糖尿病11例、高脂血癥8例。

兩組性別、年齡、BMI、合并癥等臨床資料具有可比性。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 表達(dá) 檢測(cè)采用RT-qPCR 法。取手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織，液氮下研磨成粉末狀，按TRIzol 說明提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，總RNA 的濃度和純度合格。 按PrimeScipt RT Reagent Kit 說明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。lncRNA HOTAIRM1上游引物：5"-CCCACCGTTCAATGAAAG-3"，下游引物5"-GTTTCAAACACCCACATTTC-3′；miR-129-5p上游引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG?GT-3"，下游引物5"-ATTCGCACTGGATACGACG?CAAGC-3"；U6 上游引物5"-GCACCGTCAAGGCT?GAGAAC-3"，下游引物5"-TGGTGAAGACGCCAGT?GGA-3"。PCR 擴(kuò)增體系共20 μL：SYBR Premix Ex Tap Ⅱ9 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.8 μL，無酶蒸餾水7.4 μL；反應(yīng)條件：95 ℃變性60 s，95 ℃變性20 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s 共36 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT 法計(jì)算lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 隨訪 膠質(zhì)瘤患者術(shù)后采用門診復(fù)查或電話形式定期隨訪。術(shù)后第1年每隔3個(gè)月隨訪1次，術(shù)后第2年每隔6個(gè)月隨訪1次，術(shù)后第3年隨訪1次，共隨訪3 年。終點(diǎn)事件為患者死亡或隨訪結(jié)束，統(tǒng)計(jì)患者生存時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS9.4統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 積矩相關(guān)分析法。生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 表達(dá)比較 觀察組與對(duì)照組lncRNA HOTAIRM1 相對(duì)表達(dá)量分別為2.36 ± 0.19、1.12 ± 0.25，miR-129-5p 相對(duì)表達(dá)量分別為0.37±0.12、0.83±0.11。觀察組lncRNA HOTAIRM1 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，miR-129-5p 相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（t分別為33.046、22.785，P均＜0.05）。

2.2 膠質(zhì)瘤組織lncRNA HOTAIRM1 表達(dá)與miR-129-5p表達(dá)的關(guān)系 Pearson積矩相關(guān)分析顯示，膠質(zhì)瘤組織lncRNA HOTAIRM1相對(duì)表達(dá)量與miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.726，P＜0.05）。

2.3 膠質(zhì)瘤組織lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 分別以膠質(zhì)瘤組織lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)（1.93、0.45）為臨界值，將患者分為lncRNA HOTAIRM1 低表達(dá)者40 例與lncRNA HOTAIRM1 高表達(dá)者43例、miR-129-5p低表達(dá)者46例與miR-129-5p高表達(dá)者37例。不同lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系見表1。

2.4 膠質(zhì)瘤組織lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系 lncRNA HOTAIRM1高表達(dá)者累積生存時(shí)間為16.22（95%CI：14.06～18.38）個(gè)月，lncRNA HOTAIRM1 低表達(dá)者為20.91（95%CI：18.93～22.89）個(gè)月，lncRNA HOTAIRM1高表達(dá)者累積生存時(shí)間低于lncRNA HOTAIRM1 低表達(dá)者（χ2=10.836，P＜0.05）。miR-129-5p高表達(dá)者累積生存時(shí)間為23.07（95%CI：21.52～24.62）個(gè)月，miR-129-5p 低表達(dá)者為18.10（95%CI：15.36～19.85）個(gè)月，miR-129-5p高表達(dá)者累積生存時(shí)間高于miR-129-5p低表達(dá)者（χ2=12.015，P＜0.05）。見圖1、2。

3 討論

膠質(zhì)瘤是臨床常見的一種顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，其發(fā)病率不斷上升。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，膠質(zhì)瘤的治療手段不斷優(yōu)化和改進(jìn)，但患者預(yù)后仍不理想，5 年生存率較低。膠質(zhì)瘤的發(fā)病部位較為特殊，臨床表現(xiàn)無特異性，CT、MRI 等影像學(xué)檢查亦缺乏特征性，故其術(shù)前診斷困難。因此，尋找靈敏度高、特異度強(qiáng)的膠質(zhì)瘤分子標(biāo)志物對(duì)其早期診斷和靶向治療具有重要意義。

有研究報(bào)道，膠質(zhì)瘤發(fā)病與體內(nèi)促癌基因激活和抑癌基因失活密切相關(guān)［9］。lncRNA 是一類內(nèi)源性非編碼RNA，可從多個(gè)層面參與細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)控。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 還可作為促癌基因或抑癌基因參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。ZONG等［10］研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞lncRNA H19 表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)能夠激活p53，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。ZHANG 等［11］研究報(bào)道，HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA 在結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌中異常表達(dá)，可通過招募Polycomb 抑制復(fù)合物2 至抑癌基因位置，從而抑制抑癌基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。HOTAIRM1是lncRNA家族成員之一，可介導(dǎo)多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。江梅等［12］研究報(bào)道，HOTAIRM1 在非實(shí)體瘤中發(fā)揮抑癌作用，可通過介導(dǎo)腫瘤增殖相關(guān)信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖、分化，進(jìn)而誘發(fā)急性髓系白血病。程磊等［13］研究報(bào)道，HOTAIRM1 表達(dá)失調(diào)可參與膠質(zhì)瘤的發(fā)病過程，但該研究未探討其表達(dá)與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，觀察組lncRNA HOTAIRM1 表達(dá)上調(diào)，提示lncRNA HOTAIRM1 能夠參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展，其作用機(jī)制可能是lncRNA HOTAIRM1 與Polycomb 特異性結(jié)合后抑制多梳抑制復(fù)合物2 和組蛋白去甲基化酶UTX/MLL 活性，通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)構(gòu)象進(jìn)而影響HOXA1 基因簇的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展［14］。LI 等［15］研究表明，lncRNA HOTAIRM1特異性結(jié)合G9a、Zeste 基因增強(qiáng)子同源物2，通過影響H3K27、H3K9的去甲基化，降低DNA甲基化水平，最終促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，腫瘤直徑≥4 cm和WHO 分級(jí)Ⅲ、Ⅳ級(jí)的膠質(zhì)瘤組織lncRNA HOTAIRM1 高表達(dá)的比例明顯增加，且lncRNA HOTAIRM1 高表達(dá)者累積生存時(shí)間明顯低于lncRNA HOTAIRM1 低表達(dá)者，提示lncRNA HOTAIRM1可作為評(píng)估膠質(zhì)瘤患者病情進(jìn)展和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。

表1 不同lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系［例（%）］

圖1 膠質(zhì)瘤組織不同lncRNA HOTAIRM1表達(dá)者生存曲線

圖2 膠質(zhì)瘤組織不同miR-129-5p表達(dá)者生存曲線

miR-129-5p 是miRNA 家族成員之一。有研究報(bào)道，miR-129-5p表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)原發(fā)性肝癌、前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［16-19］。本研究觀察組miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，即miR-129-5p 可能作為一種抑癌基因參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生。有研究認(rèn)為，miR-129-5p 的直接調(diào)控靶基因之一為TGIF2，miR-129-5p表達(dá)下調(diào)減弱了mRNA轉(zhuǎn)錄后和蛋白翻譯水平上對(duì)TGIF2 表達(dá)的抑制效應(yīng)，而TGIF2 表達(dá)上調(diào)又能強(qiáng)化Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展［20］。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，腫瘤直徑≥4 cm和WHO分級(jí)Ⅲ、Ⅳ級(jí)的膠質(zhì)瘤組織miR-129-5p低表達(dá)的比例明顯增加，并且miR-129-5p 低表達(dá)者累積生存時(shí)間明顯低于miR-129-5p 高表達(dá)者，提示miR-129-5p可作為評(píng)估膠質(zhì)瘤患者病情進(jìn)展和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織lncRNA HOTAIRM1相對(duì)表達(dá)量與miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測(cè)lncRNA HOTAIRM1表達(dá)上調(diào)可能通過負(fù)調(diào)控miR-129-5p 導(dǎo)致其活性降低，進(jìn)而使TGIF2表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展［16］。

綜上所述，膠質(zhì)瘤組織lncRNA HOTAIRM1 表達(dá)上調(diào)、miR-129-5p表達(dá)下調(diào)，二者表達(dá)變化與腫瘤直徑、WHO 分級(jí)和患者預(yù)后密切相關(guān)。lncRNA HOTAIRM1、miR-129-5p 有可能作為評(píng)估膠質(zhì)瘤病情程度和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。