健脾化痰方對HER-2陽性人NCI-N87胃癌移植瘤生長及凋亡作用

許瑤，許尤琪

江蘇省第二中醫(yī)院，江蘇 南京 210017

胃癌是全球常見的惡性腫瘤，我國尤其高發(fā)。大部分患者在確診時已是中晚期，對于無法手術治療的轉(zhuǎn)移性或晚期胃癌及術后復發(fā)的病例，采用細胞毒藥物進行化療的患者，其中位生存期(overall survival，OS）僅約11 個月左右。分子靶向治療的臨床運用為晚期胃癌提供了新的治療方法。有研究確立了抗人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）單克隆抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab，商品名：赫賽?。┰谥委熗砥谖赴┲械淖饔茫蛊涑蔀镠ER-2陽性患者的標準治療[1]。

劉河等[2]從基因微觀分子水平對胃癌中醫(yī)不同辨證分型進行研究，發(fā)現(xiàn)胃癌6 種中醫(yī)證型中HER-2 陽性表達率由高到低依次為痰濕凝結型、瘀毒內(nèi)阻型、氣血雙虧型、肝胃不和型、脾胃虛寒型、胃熱傷陰型?！捌⑻摗?、“痰濕”反映著胃癌患者尤其是HER-2 陽性者處在不同的病變發(fā)展階段機體內(nèi)邪正盛衰的偏勝情況。胃癌晚期患者，脾虛證廣泛存在。脾主運化，若脾氣虛弱，運化功能失常，不能布散水谷精微，津液代謝障礙，水液停滯，則聚而成痰，故有“脾為生痰之源”之說。胃癌各中醫(yī)證型病灶組織中HER-2 蛋白表達陽性率均高于慢性萎縮性胃炎患者，且胃癌中醫(yī)辨證為實證患者均具有較高的HER-2 陽性表達率[3]。因此從痰論治正是HER-2陽性胃癌的治療大法之一。

筆者課題組根據(jù)長期的臨床經(jīng)驗，并依據(jù)胃癌病機特點擬定了健脾化痰復方，由黃芪、仙鶴草、薏苡仁、玄參、白花蛇舌草、苦參等中藥組成。方中黃芪、仙鶴草健脾益氣為君藥，薏苡仁、豬苓利濕化痰，為臣藥；玄參、女貞子、雞血藤養(yǎng)血活血，白花蛇舌草、苦參抗癌解毒，共為佐藥；再輔以威靈仙通行十二經(jīng)絡，軟堅散結，為使藥。諸藥并用，共奏健脾化痰、抗癌解毒之功。前期實驗研究方面，發(fā)現(xiàn)健脾化痰方能抑制SGC-7901 荷瘤裸鼠血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF）、Ki-67的表達、人胃癌MGC-803 細胞Bcl-2、COX-2 的表達，下調(diào)前胃癌MFC 瘤組織P53、Survivin 的表達，上調(diào)Bax表達[4-8]?；谏鲜鼋∑⒒捣綄δ[瘤細胞增殖抑制作用的研究，本研究進一步觀察健脾化痰方對HER-2 陽性胃癌腫瘤細胞生長及凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物本實驗采用的研究動物為BALB/c雄性裸鼠80 只，5～7 周齡，每只體重約為18～20 克。裸鼠購自南京沐途醫(yī)療科技有限公司，動物合格證號為SYXK(蘇）2016-0010，SPF 級動物實驗室條件下飼養(yǎng)，動物實驗室許可證號為SYXK(蘇）2016-0018。HER-2陽性人NCI-N87胃癌細胞株由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 藥物及試劑健脾化痰復方制劑，處方組成：黃芪30 g，仙鶴草30 g，薏苡仁30 g，豬苓15 g，玄參15 g，女貞子20 g，雞血藤30 g，白花蛇舌草30 g，苦參15 g，威靈仙30g 等，由南京中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥材制劑中心制備成含生藥約5.31 g/ml 的中藥煎劑。注射用曲妥珠單抗(赫賽?。?40 mg(20 ml）/瓶，上海羅氏公司，生產(chǎn)批號：N7392，貯存條件：2～8 ℃。TUNEL 凋亡檢測試劑盒購自上海羅氏公司。

2 方法及分組

2.1 細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)NCI-N87細胞，每1～2 d更換1次培養(yǎng)液；約3～4 d 貼壁率＞90%，2～3 d 傳代1 次，連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定數(shù)目時，將對數(shù)生長期NCI-N87細胞用于實驗。

2.2 人胃癌移植瘤模型的建立及分組取對數(shù)生長期的人NCI-N87 胃癌細胞，制成單細胞懸液，每只動物取0.2 ml 接種于右側(cè)腋部皮下，1 周后觀察成瘤情況，當皮下移植瘤長至直徑約4 mm 時，則認為移植瘤模型成功。將實驗動物隨機分為空白組、健脾化痰方低劑量組(低劑量組）、健脾化痰方中劑量組(中劑量組）、健脾化痰方高劑量組(高劑量組）、赫賽汀組及健脾化痰方低、中、高劑量聯(lián)合赫賽汀組，各組10 只。于分組當天開始給藥，健脾化痰方低劑量組20 g/kg，中劑量組40 g/kg，高劑量組80 g/kg，灌胃給藥，持續(xù)3 周；赫賽汀組腹腔注射首劑按40 mg/kg 給藥，1 周1次，隨后按20 mg/kg 給藥[9]；赫賽汀聯(lián)合健脾化痰方組，則按健脾化痰方低、中、高劑量聯(lián)合赫賽汀劑量給藥，持續(xù)3周；空白組予中藥同等體積的生理鹽水灌胃3周。

2.3 觀察指標接種后1周起，每隔3天用電子游標卡尺測量移植瘤最大直徑(a）及橫徑(b），4周后用頸椎脫臼法處死裸鼠，剝離瘤組織，測離體瘤徑；計算抑瘤率、繪制腫瘤生長曲線。

Steel 公式[10]：(1）腫瘤體積V=a × b2/2；(2）抑瘤率(%）=[(對照組平均瘤V1-治療組平均瘤V2）/對照組平均瘤V1]×100%

2.4 采用TUNEL 法檢測細胞凋亡用4%多聚甲醛處理移植瘤組織，在顯微鏡下觀察并采集染色后圖像。計算陽性率來反應凋亡程度，高倍鏡下連續(xù)計數(shù)5 個隨機視野各100 個細胞，5 個視野中陽性細胞總數(shù)所占百分比作為凋亡指數(shù)(Apoptosis index，AI），AI=凋亡陽性細胞總數(shù)/總的細胞數(shù)×100%。

2.5 統(tǒng)計學方法應用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，定量資料以均數(shù)±標準差(）描述，定性資料以百分數(shù)描述。多組間比較，若符合正態(tài)分布且方差齊則使用單因素方差分析；兩組間比較采用t檢驗；定性資料的比較使用卡方檢驗。給出檢驗統(tǒng)計量及其對應P值，以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義，P＞0.05無統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 健脾化痰方對移植瘤生長的影響

記錄每天給藥后胃癌腫瘤體積的變化，描繪腫瘤生長曲線，結果如圖1所示，各組胃癌腫瘤體積變化呈不同的變化趨勢。對照組裸鼠移植瘤體積一直呈增長趨勢；實驗進行第27 天，各治療組與對照組比較，裸鼠移植瘤體積均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05），且中藥聯(lián)合組對腫瘤生長抑制作用更明顯，給藥開始時腫瘤體積生長緩慢，至實驗進行第15 天腫瘤體積呈明顯縮小趨勢。

圖1 人胃癌裸鼠移植瘤生長曲線Figure 1 Growth curve of human gastric cancer xenograft tumor in nude mice

3.2 健脾化痰方對移植瘤瘤重的影響

各治療組瘤重與對照組比較均減輕且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）；聯(lián)合組瘤重減輕更多(P＜0.05）；健脾化痰方聯(lián)合組與赫賽汀組比較，瘤重更輕且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。見表1。

表1 移植瘤平均瘤重及抑瘤率(）Table 1 Average tumor weight and tumor inhibition rate of transplanted tumor

表1 移植瘤平均瘤重及抑瘤率(）Table 1 Average tumor weight and tumor inhibition rate of transplanted tumor

注：在抑瘤率方面比較：①表示健脾化痰方組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05）；②表示聯(lián)合組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05）；③表示聯(lián)合組與赫賽汀組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05）。

3.3 健脾化痰方對移植瘤細胞凋亡的影響

通過采用TUNEL 法檢測發(fā)現(xiàn)治療組均存在細胞凋亡現(xiàn)象，治療組AI 均高于對照組，并隨著健脾化痰方劑量的增加，凋亡效應逐漸增強，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。移植瘤細胞凋亡程度情況具體見表2。

表2 TUNEL法檢測移植瘤凋亡陽性細胞表達率(%，）Table 2 Expression rate of apoptotic positive cells in transplanted tumor detected by TUNEL method

表2 TUNEL法檢測移植瘤凋亡陽性細胞表達率(%，）Table 2 Expression rate of apoptotic positive cells in transplanted tumor detected by TUNEL method

注：在細胞凋亡方面比較：①表示健脾化痰方組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05）；②表示聯(lián)合組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05）；③表示聯(lián)合組與赫賽汀組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05）。

4 討論

本研究通過建立人胃癌NCI-N87 細胞裸鼠移植瘤模型，在裸鼠體內(nèi)觀察不同劑量健脾化痰方對胃癌腫瘤組織生長的影響，觀察到健脾化痰方可抑制胃癌組織的生長；通過TUNEL 法檢測凋亡指數(shù)，發(fā)現(xiàn)健脾化痰方可誘導胃癌細胞的凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)各治療組對胃癌腫瘤的生長均有抑制作用，特別是中藥聯(lián)合組顯示出更強的抑制作用，這可能與在赫賽汀治療過程中加入健脾化痰方有關，由于腫瘤作用機制的復雜性，藥物的作用機理也隨之發(fā)生改變。赫賽汀的主要作用機制可能是：①特異結合于HER-2 受體胞外段從而阻斷HER-2 同源二聚體的組成性激活，并干擾HER-2與其他ErbB 家族成員形成異源二聚體；②介導HER-2 受體的內(nèi)吞和在溶酶體中的降解以及抑制HER-2 受體胞外段的裂解[11]；③通過活化PTEN(phosphatase and tensin homolog）阻斷HER-2介導的PI3K/AKT 信號通路，該通路是細胞將胞外生長因子信號傳遞至胞內(nèi)的關鍵通路，負責調(diào)節(jié)細胞的代謝、增殖和凋亡；④通過調(diào)整血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF）水平從而起到抑制腫瘤血管生成的作用；⑤通過誘導抗體依賴細胞介導的細胞毒作用進而殺傷腫瘤細胞[12]。健脾化痰方的抑瘤作用可能是通過誘導胃癌裸鼠移植瘤細胞凋亡。赫賽汀聯(lián)合組比健脾化痰方組抑瘤作用強，聯(lián)合使用起到協(xié)同抑制作用，具體的作用機制是否與PI3K/AKT 信號通路需進一步研究。

綜上所述，健脾化痰方對HER-2 陽性NCIN87胃癌裸鼠移植瘤具有抑制作用，可以誘導胃癌細胞的凋亡，聯(lián)合赫賽汀使用能增強其誘導凋亡作用。本研究為中藥治療HER-2 陽性胃癌提供實驗研究依據(jù)。