基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討加味四君子湯治療胃癌的作用機(jī)制研究

陳偉霞，李佳，牛垚飛，康妍，馬純政，趙愛光

1.河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院），河南 鄭州 450000，2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200062；3.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003

國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC）發(fā)布了有關(guān)全球癌癥負(fù)擔(dān)的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)，至2020 年，全世界估計有1930 萬新發(fā)癌癥病例和近1000 萬例癌癥患者死亡。其中胃癌新發(fā)病例48 萬，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率位于第5 位、死亡率第4 位[1]。在我國，早期胃癌的檢出率仍然偏低，大多數(shù)胃癌患者發(fā)現(xiàn)時已是進(jìn)展期，喪失可根治切除的機(jī)會，預(yù)后較差[2]。對于進(jìn)展期胃癌患者，傳統(tǒng)化療及放射治療療效不佳。由于胃癌高度時空異質(zhì)性導(dǎo)致精準(zhǔn)靶向治療進(jìn)展緩慢。

在我國，中醫(yī)藥治療胃癌的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在：延長晚期患者生存期、改善生存質(zhì)量；術(shù)后長期堅持口服中藥可減少復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移，提高遠(yuǎn)期效果；減輕根治術(shù)后并發(fā)癥；在化療期間起到減毒增效作用；預(yù)防和治療癌前病變等方面。眾多醫(yī)家均認(rèn)為胃癌的發(fā)生與正氣虛弱、邪毒較盛相關(guān)，其中脾胃虛弱被認(rèn)為是發(fā)病的主要病機(jī)之一?；谝鏆饨舛纠碚?，以“補益脾胃、解毒散結(jié)”為治療原則，結(jié)合科室多年臨床治療胃癌經(jīng)驗組方，形成加味四君子湯。加味四君子湯是在四君子湯的基礎(chǔ)上加入藤梨根、壁虎和半夏。該方成分包括太子參、茯苓、白術(shù)、壁虎、藤梨根、半夏。太子參、白術(shù)、茯苓為基礎(chǔ)健脾益氣；壁虎、藤梨根清熱解毒、消腫散結(jié)；姜半夏化痰、降逆止嘔。全方配伍達(dá)到補益而不滋膩礙胃，祛邪而不損傷脾胃，“祛邪不傷正”、“益氣不助邪”的目的。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在計算機(jī)虛擬計算和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索基礎(chǔ)上的研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的新模式，通過對中藥成分、作用靶點以及生物通路進(jìn)行分析，從而系統(tǒng)分析中藥對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)影響，揭示藥物治療作用的分子機(jī)制[3]。本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對加味四君子湯治療胃癌的主要物質(zhì)基礎(chǔ)和配伍機(jī)制進(jìn)行研究，以期為深入研究該方劑治療胃癌的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

1 材料與方法

1.1 中藥化學(xué)成分及作用靶點信息的獲取

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php v2.3）[4]檢索加味四君子湯中6 味中藥的化學(xué)成分及靶點。依據(jù)藥代動力學(xué)參數(shù)作為化合物分子的篩選條件：藥物成分口服生物利用度(Oral bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性(Drug-likeness，DL）≥ 0.18 的活性成分(ingredients），并利用該技術(shù)平臺獲取活性成分相關(guān)的作用靶點(related targets）。

1.2 疾病靶點的獲取

檢索人類基因-疾病相關(guān)的綜合數(shù)據(jù)庫Genecard(https：//www.genecards.org/），輸入關(guān)鍵詞“gastric cancer”，獲取與胃癌相關(guān)靶標(biāo)基因，相關(guān)性評分限制為≥5。

1.3 中藥-活性成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

利用R 軟件VennDiagram對相關(guān)藥物活性成分相關(guān)的靶點和疾病靶點進(jìn)行匹配映射，獲得加味四君子湯活性成分的潛在抗胃癌作用靶點，并繪制韋恩圖(Veen plot）。根據(jù)中藥活性成分及靶點信息與疾病靶點信息匹配映射的結(jié)果，通過Cytoscape 軟件構(gòu)建加味四君子湯活性成分及其潛在抗胃癌作用靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)。對構(gòu)建的“加味四君子湯活性成分及其潛在抗胃癌作用靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)”拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用連接度值(degree）對加味四君子湯活性成分抗胃癌的作用進(jìn)行表征，根據(jù)連接度值篩選加味四君子湯抗胃癌的主要活性成分和作用靶點。

1.4 GO富集分析和KEGG通路分析

利用String 在線分析平臺[5](https：//string-db.org/，v11.0）對33 個關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析和GO(Gene Ontology，GO）富集分析，根據(jù)P 值＜0.01 選取有意義的生物功能和信號通路。

2 結(jié)果

2.1 加味四君子湯活性成分篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集加味四君子湯6 味中藥含有的化學(xué)成分，以口服生物利用度(OB）≥30%且類藥性(DL）≥0.18 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到太子參、白術(shù)、茯苓、半夏、藤梨根和壁虎潛在部分活性成分見表1。數(shù)據(jù)顯示加味四君子湯中太子參125 個化學(xué)成分、白術(shù)23 個化學(xué)成分、茯苓30 個化學(xué)成分、半夏172 個化學(xué)成分、藤梨根135個化學(xué)成分及壁虎163個化學(xué)成分。

2.2 加味四君子湯抗胃癌作用靶點篩選

利用該技術(shù)平臺獲取活性成分相關(guān)的作用靶點。繪制藥物潛在活性成分作用靶點與胃癌相關(guān)靶點的韋恩圖(Venn plot），獲得加味四君子湯活性成分的潛在抗胃癌的作用靶點。其中，太子參(TZS）潛在作用靶點有68 個，白術(shù)(BZ）有9 個，茯苓(FL）有8 個，半夏(BX）有51 個，藤梨根(MHLG）有58 個，壁虎(XH）有18 個，加味四君子湯六味中藥抗胃癌作用靶點的韋恩圖(Veen plot）見圖1，六味中藥共同作用的靶點有1 個，為PTGS2。

表1 加味四君子湯潛在的活性成分Table 1 Potential active components of Modified Sijunzi Decoction

（續(xù)表1）

圖1 加味四君子湯抗胃癌作用靶點的韋恩圖Figure 1 Venn diagram on the anti-gastric cancer target of Modified Sijunzi Decoction

2.3 加味四君子湯有效化學(xué)成分-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治?/h3>

利用R 軟件對加味四君子湯活性成分相關(guān)的靶點和胃癌靶點進(jìn)行映射匹配，獲得加味四君子湯潛在活性成分與胃癌疾病靶點之間的對應(yīng)關(guān)系，通過Cytoscape 軟件構(gòu)建加味四君子湯活性成分(Molecule Name）及其潛在抗胃癌作用靶點(Preferred Name）的相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖2。

對構(gòu)建的“加味四君子湯活性成分及其潛在抗胃癌作用靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)”拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用連接度值(degree）對該方活性成分抗胃癌的作用進(jìn)行表征，根據(jù)連接度值篩選加味四君子湯抗胃癌的主要活性成分和作用靶點。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果見表2。連接度最高的5 個活性分子依次為：luteolin(木犀草素）、ursolic acid(熊果酸）、beta-sitosterol(β-谷甾醇）、baicalein(黃芩素）、acacetin(刺槐素），這5個成分可能是加味四君子湯治療胃癌的主要成分。連接度大于3 的靶基因共33 個，排名前5 的依次為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(prostaglandin G/H synthase1，PTGS1）、β2腎上腺素能受體(ADRB2）、胃蛋白酶原比值(PGR）和毒蕈堿型膽堿受體M3(CHRM3）。

圖2 加味四君子湯活性成分與胃癌作用靶點相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Network Diagram of the interaction between the active components of Modified Sijunzi Decoction and the target of gastric cancer

2.5 關(guān)鍵靶點基因生物功能及通路分析

采用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/，v6.8）對PPI 網(wǎng)絡(luò)中的33 個靶點進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 分析結(jié)果如圖3 所示，其中生物過程主要涉及類固醇激素反應(yīng)、細(xì)胞程序性死亡、對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝、半胱氨酸型內(nèi)肽酶在細(xì)胞凋亡中的調(diào)節(jié)作用、雌二醇反應(yīng)、外源性凋亡信號通路、DNA 模板轉(zhuǎn)錄與啟動、血液循環(huán)、氧化應(yīng)激、T 細(xì)胞活化、發(fā)育生長、對機(jī)械刺激的反應(yīng)、細(xì)胞表面受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)正調(diào)節(jié)等方面；細(xì)胞組成主要參與基膜、核染色質(zhì)、線粒體外膜、細(xì)胞小凹、細(xì)胞外間質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、受體復(fù)合體等方面；分子功能主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、類固醇激素受體活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等方面。

KEGG 信號通路分析如圖4所示，主要富集的通路為癌癥通路、細(xì)胞凋亡(Apoptosis）、白介素-17信號通路(IL-17 signaling pathway）、5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse）、甲狀腺激素信號通路、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路、NF-kappa B信號通路等。

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是在正氣虧虛的基礎(chǔ)上，通過各種因素激化形成癌毒。結(jié)合臨床分析胃癌貫穿始終的核心病機(jī)為脾胃虛弱，癌毒內(nèi)阻。加味四君子湯方劑組成體現(xiàn)健脾益氣結(jié)合解毒散結(jié)的功效。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法得出加味四君子湯中有效活性成分抗胃癌的作用靶點有212 個。根據(jù)分析加味四君子湯活性成分-抗胃癌作用靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)連接度值篩選得出加味四君子湯中抗胃癌的主要活性成分為木犀草素、熊果酸、β-谷甾醇、黃芩素、刺槐素，這5 個成分可能是加味四君子湯治療胃癌的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。據(jù)研究指出木犀草素可通過抑制MAPK 和PI3K 信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]；抑制Notch 信號通路逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，從而有效抑制胃癌生長[7]。熊果酸可通過誘導(dǎo)BGC-823 胃癌細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G1 期，其機(jī)制可能與miR-133a表達(dá)上調(diào)有關(guān)[8]。黃芩素在體外內(nèi)具有抗胃癌細(xì)胞侵襲遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用，其機(jī)制與NF-κB/Snail信號通路相關(guān)[9]。β-谷甾醇在體內(nèi)外具有抗胃癌作用，其機(jī)制可能與下調(diào)P13K/AKT/mTOR 信號通路蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)SGC-7901 細(xì)胞發(fā)生自噬有關(guān)[10]；刺槐素可以通過激活ROS、上調(diào)細(xì)胞色素c促使Caspase 的級聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的凋亡[11]。

表2 加味四君子湯潛在活性成分與胃癌疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果Table 2 Topological structure analysis of the interaction network between the potential active components of Modified Sijunzi Decoction and the disease target of gastric cancer

圖3A 加味四君子湯靶標(biāo)的GO富集分析圖（生物過程）Figure 3 A Go enrichment map of the target of Modified Sijunzi Decoction（Biological Processes）

圖3B 加味四君子湯靶標(biāo)的GO富集分析圖（細(xì)胞組成）Figure 3 B Go enrichment map of the target of Modified Sijunzi Decoction（Cellular Component）

圖3C 加味四君子湯靶標(biāo)的GO富集分析圖（分子功能）Figure 3 C Go enrichment map of the target of Modified Sijunzi Decoction（Molecular Function）

圖4 加味四君子湯治療胃癌相關(guān)靶蛋白KEGG富集分析通路圖Figure 4 The pathway map of KEGG enrichment and analysis in the treatment of gastric cancer with Modified Sijunzi Decoction

靶點PTGS2、PTGS1、ADRB2、PGR和CHRM3在網(wǎng)絡(luò)中連接度最高，可能為加味四君子湯治療胃癌的主要潛在靶點。其中，PTGS2為本方劑6味中藥的共同靶點。前列腺素內(nèi)源性過氧化氫合酶(PTGS），又稱為環(huán)氧化物酶(cyclooxygenase，COX），是人體內(nèi)前列腺素合成關(guān)鍵的限速酶。PTGS2在各種細(xì)胞中可被促炎細(xì)胞因子、腫瘤誘導(dǎo)劑、有絲分裂原和生長因子等高度誘導(dǎo)，其主要代謝產(chǎn)物是前列腺素E2，從而參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理過程[12]。PTGS2在多種實體瘤中存在高表達(dá)，并參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的眾多環(huán)節(jié)。β2腎上腺素能受體(ADRB2）屬于β 腎上腺素能受體中的一種，是重要的G蛋白偶聯(lián)受體。已有研究顯示，其在眾多腫瘤細(xì)胞中均存在高度表達(dá)，β2AR高表達(dá)組的皮膚惡性黑色素瘤患者的死亡和復(fù)發(fā)率顯著高于β2AR低表達(dá)組，是預(yù)測皮膚惡性黑色素瘤患者預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)志物[13]；毒蕈堿型膽堿能受體是G 蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，CHRM3 在消化道腫瘤組織均有高表達(dá)[14，15]，有研究顯示CHRM3活化能夠通過PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。

KEGG信號通路分析中富集腫瘤相關(guān)的通路為白介素-17信號通路、VEGF信號通路、NF-kappa B信號通路等。白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17）家族細(xì)胞因子是一類重要炎癥因子，可通過多條信號通路參與腫瘤的發(fā)展過程[16]。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF）是最強(qiáng)的血管調(diào)控生長因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物活性，在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮重要的作用。NF-κB 是一種多功能的核轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞因子的分泌水平及細(xì)胞周期依賴性激酶的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。NF-κB 信號通路可調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的信號級聯(lián)放大反應(yīng)通路，其持續(xù)活化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[17，18]，其機(jī)制可能由于炎癥因子的表達(dá)增加相關(guān)[19]。

本研究中還存在方法上的局限性，藥物活性成分收集不足及網(wǎng)絡(luò)靶點預(yù)測等不可控因素，其結(jié)果需要進(jìn)一步實驗基礎(chǔ)研究驗證。綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)闡明加味四君子湯中抗胃癌的主要活性成分為木犀草素、熊果酸、β-谷甾醇、黃芩素、刺槐素，其主要作用靶點為PTGS2、PTGS1、ADRB2、PGR 和CHRM3，主要通過IL-17、VEGF 和NF-κB 信號通路發(fā)揮抗胃癌作用，說明加味四君子湯是通過多成分、多靶點、多通路協(xié)同發(fā)揮抗胃癌藥理作用的。本研究從系統(tǒng)生物學(xué)的角度揭示了加味四君子湯治療胃癌的作用機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)的科學(xué)內(nèi)涵。