基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討六君安胃方減少結(jié)腸癌化療期間消化道不良反應(yīng)的作用機(jī)制研究

閆蘊(yùn)孜，孫凌云，許云，何斌，張彤，閆韶花，趙娜，楊宇飛

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院(西苑臨床醫(yī)學(xué)院），北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091

高危Ⅱ期及Ⅲ期結(jié)腸癌根治術(shù)后進(jìn)行輔助化療可降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，延長(zhǎng)無(wú)瘤生存期。然而，化療導(dǎo)致不良反應(yīng)如化療相關(guān)性惡心嘔吐(chemotherapy-induced nausea and vomiting，CINV）、化療相關(guān)性腹瀉(chemotherapy-induced diarrhea，CID）降低了患者對(duì)化療的耐受性和依從性，導(dǎo)致很多患者無(wú)法按期、按量完成化療。2017 年依托“國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃-中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究”，本研究課題組對(duì)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院腫瘤科楊宇飛主任臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗(yàn)方——“健脾補(bǔ)腎序貫方”對(duì)化療不良反應(yīng)的干預(yù)療效展開了全國(guó)多中心、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)研究。其中六君安胃方是“健脾補(bǔ)腎序貫方”中的第一要方，也屬于“兩階段三部曲法”中輔助結(jié)直腸癌化療的第一階段[1]。

六君安胃方是在傳統(tǒng)中藥方劑“六君子湯”基礎(chǔ)上化裁而成，將原方中的人參改為黨參，其余藥物為白術(shù)、茯苓、甘草、半夏、陳皮。黨參具有健脾益肺、養(yǎng)血生津的功效；苓、術(shù)相配健脾祛濕；甘草益氣和中、調(diào)和諸藥；半夏降逆止嘔，陳皮健脾理氣。六君安胃方的主要作用是健脾和胃，顧護(hù)中焦后天之本，降低消化道反應(yīng)，如惡心、嘔吐、腹瀉、便秘等[1]。由于中藥復(fù)方成份復(fù)雜，六君安胃方在防治CINV 和CID 的作用機(jī)制仍不明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)六君安胃方多成分、多靶點(diǎn)與疾病之間復(fù)雜的網(wǎng)狀關(guān)系進(jìn)行探討研究，為臨床治療及下一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究提供參考依據(jù)。

1 信息收集與方法

1.1 六君安胃方的中藥信息收集按照六君安胃方中中藥組成，通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacologydatabaseandanalysisplatform，TCMSP），篩選出黨參、白術(shù)、茯苓、陳皮、半夏中OB ≥30%且DL ≥0.18 的有效化學(xué)成分，由于甘草化學(xué)成分較多，故參考相關(guān)文獻(xiàn)[2]將甘草篩選條件設(shè)定為OB ≥50%且DL ≥0.18。

1.2 六君安胃方的化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)的構(gòu)建通過TCMSP 平臺(tái)搜集六君安胃方化學(xué)成分的潛在作用靶點(diǎn)，并利用Uniprot(http：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)將基因標(biāo)準(zhǔn)化。利用Cytoscape3.6.0 構(gòu)建六君安胃方化學(xué)成分-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 疾病靶點(diǎn)的篩選通過GeneCards(http：//www.genecards.org/）、OMIM(http：//www.omim.org/）、DisGeNET(http：//www.disgenet.org/）等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，以“chemotherapy-inducednauseaand vomiting(CINV）”、“chemotherapy-induced diarrhea(CID）”為檢索詞，獲得與化療期間消化道反應(yīng)的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 化療期間消化道反應(yīng)PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用String 平臺(tái)(https：//string-db.org/Version 11.0）構(gòu)建六君安胃方活性成分和化療期消化道反應(yīng)相關(guān)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI），檢索條件為“Homo sapiens”，并將“minimum required interaction score”設(shè)置為0.9以保證蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的可讀性。利用R version 3.6.2對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的前15個(gè)關(guān)鍵蛋白繪制條狀圖。

1.5 基因本體(gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析為了進(jìn)一步說(shuō)明六君安胃方治療化療期間消化道反應(yīng)的作用情況，通過R ClusterProfiler 對(duì)藥物-疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.6 分子對(duì)接利用AutoDock vina 軟件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前5的靶蛋白與六君安胃方中排名第一的有效化學(xué)成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。從Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)和RCSB PDB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲取六君安胃方中的有效化學(xué)成分結(jié)構(gòu)和靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)，利用AutoDock Tools對(duì)上述蛋白受體和配體進(jìn)行常規(guī)處理，再用Autogrid得到對(duì)接的活性位點(diǎn)，然后進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1為分子與靶點(diǎn)結(jié)合性較好。

2 結(jié)果

2.1 六君安胃方化學(xué)成分及靶點(diǎn)收集

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索六君安胃方中中藥的有效化學(xué)成分和潛在作用靶點(diǎn)，收集到六君安胃方所含的中藥有效化學(xué)成分共103個(gè)，其中來(lái)自白術(shù)的有7 個(gè)、半夏13 個(gè)、陳皮5 個(gè)、黨參21 個(gè)、茯苓15 個(gè)、甘草42 個(gè)；共收集到4 351 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，其中白術(shù)774 個(gè)、半夏1 302 個(gè)、陳皮479個(gè)、黨參896個(gè)、茯苓121個(gè)、甘草778個(gè)，將收集到的靶點(diǎn)通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化并去重后共得到406 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)；通過GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索疾病相關(guān)關(guān)鍵詞共收集到與“CIVN”、“CID”相關(guān)的靶點(diǎn)去重后共851個(gè)。為了進(jìn)一步說(shuō)明六君安胃方對(duì)化療期間消化道不良反應(yīng)的作用，將406個(gè)六君安胃方化學(xué)成分相關(guān)作用靶點(diǎn)與851個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集并建立韋恩圖，共獲得105 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)(圖1）。另將六君安胃方有效成分-疾病相關(guān)靶點(diǎn)可視化，利用Cytoscape 中的NetworkAnalyzer 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，可視化圖中共獲得321個(gè)節(jié)點(diǎn)，通過Degree排名找到前十的化學(xué)成分(表1）。

2.2 六君安胃方相關(guān)疾病靶點(diǎn)篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

通過String 平臺(tái)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，將“minimum required interaction score”設(shè)置為0.9，PPI 網(wǎng)絡(luò)包含105 個(gè)節(jié)點(diǎn)，396 條邊，平均節(jié)點(diǎn)值7.54；利用Cytoscape 將PPI 網(wǎng)絡(luò)圖可視化，每個(gè)圓形代表一個(gè)蛋白，圓形越大表示蛋白相關(guān)節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多(圖2），根據(jù)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)Degree繪制出繪制前15個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)條形圖(圖3）；Degree排名前五的是AKT1、MAPK3、MAPK1、MAPK8、JUN。

表1 六君安胃方化學(xué)成分degree排名前十列表Table 1 The top ten list of the degree of Liujunanwei decoction Chemical composition

2.3 GO功能富集分析

利用R 軟件ClusterProfiler 對(duì)獲得的藥物活性成分-疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行過程富集分析，涉及生物過程(Biological Process）、細(xì)胞組成(Cellular Component）和分子功能(Molecular Function）三個(gè)部分。根據(jù)P＜0.05 將排名前20 的條目繪制成條形圖。在生物過程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路調(diào)節(jié)、脂多糖的反應(yīng)、細(xì)菌起源分子反應(yīng)、活性氧的反應(yīng)等生物過程排名靠前(圖4）；細(xì)胞組成中，膜筏、膜微區(qū)域、膜區(qū)域、囊泡腔等排名靠前(圖5）；分子功能過程中，泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激活酶活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等分子功能排名靠前(圖6）。

2.4 KEGG富集分析

利用R 軟件ClusterProfiler 對(duì)六君安胃方中篩選出的105 個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG 富集分析。根據(jù)P＜0.05 繪制出排名前20 個(gè)信號(hào)通路氣泡圖(圖7）。結(jié)果顯示六君安胃方可能作用的信號(hào)通路包括PI3K-AKt 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、MAPK 信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、鉑耐藥、TNF信號(hào)通路等信號(hào)通路。

圖1 六君安胃方有效成分作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)關(guān)系的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of relationship between target of the effective ingredients of Liujunanwei decoction and the target of the disease

圖2 六君安胃方PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 PPI network diagram of Liujunanwei decoction

圖3 六君安胃方Degree條形圖Figure 3 Liujunanwei decoction degree bar chart

圖4 GO富集分析-生物過程Figure 4 Gene Ontology-Biological Process

圖5 GO富集分析-細(xì)胞組成Figure 5 Gene Ontology-Cellular Component

圖6 GO富集分析-分子功能Figure 6 Gene Ontology-Molecular Function

2.5 分子對(duì)接

將六君安胃方的有效化學(xué)成分與PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前5 的蛋白分別對(duì)接(表2）。若結(jié)合能＜-5.0 kJ·mol-1則認(rèn)為其結(jié)合性好[3]。結(jié)果表明，六君安胃方中君藥黨參中的木犀草素與AKT1結(jié)合性最好(圖8），其次是JUN、MAPK3、MAPK8、MAPK1。

圖7 KEGG富集通路圖Figure 7 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes signal pathway

表2 六君安胃方中有效化學(xué)成分分子對(duì)接Table 2 Molecular docking of effective chemical components in Liujunanwei decoction

圖8 木犀草素與AKT1分子對(duì)接Figure 8 Molecular docking of luteolin and AKT1

3 討論

CINV 和CID 均屬于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)概念，傳統(tǒng)中醫(yī)并無(wú)明確記載，但可根據(jù)臨床癥狀歸屬為痞滿、嘔吐、泄瀉等范疇?；颊哂捎谒伢w脾胃虛弱，加之化療藥物刺激脾胃，導(dǎo)致正氣虛損，脾失健運(yùn)，胃失和降，進(jìn)一步導(dǎo)致干嘔、嘔吐或者泄瀉。既往研究發(fā)現(xiàn)六君子湯對(duì)5-HT3 受體有拮抗作用，方中提取成分川陳皮素以劑量依賴性方式抑制5-HT 誘導(dǎo)的胃排空延遲[4]。而本研究同樣發(fā)現(xiàn)六君安胃方中黨參有效成分，即黃酮類化合物木犀草素和芹菜素，作為自由基清除劑和抗氧化劑，均具有抗突變、抗炎和抗病毒等作用。其中木犀草素具有很強(qiáng)的抗氧化和抗炎的作用，這也是它用于治療結(jié)腸癌及其并發(fā)癥的一個(gè)重要原因。木犀草素可能通過對(duì)iNOS和COX-2表達(dá)的抑制作用來(lái)防治CINV和CID[5]。芹菜素有細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、抗炎和抗氧化作用，與其他黃酮類化合物相比，具有較強(qiáng)的抗炎作用，能夠促進(jìn)P38/MAPK 和PI3K-AKT 等多種抗炎途徑，并能抑制核因子-κB、IκB降解和核移位，降低COX-2活性[6]。另外芹菜素可以通過腸道菌群代謝產(chǎn)物介導(dǎo)對(duì)CINV 和CID 起到抗炎活性和保護(hù)作用[7]。TAKEDA H 等[8]發(fā)現(xiàn)川陳皮素對(duì)5-HT2B 受體有很強(qiáng)的拮抗活性，Ki 值為0.21～0.59 mol/L。陳皮中的柚皮苷可顯著降低結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，并促進(jìn)結(jié)腸黏膜中促炎癥介質(zhì)的下調(diào)。有研究表明柚皮苷能夠通過抑制巨噬細(xì)胞NF-KBP56 的活化減少結(jié)腸黏膜中炎性因子(TNF-α 和IL-6）、炎性介質(zhì)(iNOS、Cox2、ICAM-1 和MCP-1）的產(chǎn)生[9]。柚皮苷抑制細(xì)胞因子發(fā)揮其抗炎作用，這與芹菜素等發(fā)揮作用的機(jī)制不同，后者是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)細(xì)胞因子而發(fā)揮抗炎作用[10]。這也體現(xiàn)了中藥復(fù)方治療特定疾病過程中的多途徑、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制。

根據(jù)KEGG的分析結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)六君安胃方中參與治療CINV 和CID 的主要炎癥通路為PI3K-AKt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路和TNF 信號(hào)通路。PI3K-AKT信號(hào)通路被激活后主要影響胰島素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)關(guān)鍵的代謝過程，并且在腸道炎癥過程中發(fā)揮著重要作用[7，11]。參與促炎細(xì)胞因子應(yīng)答的信號(hào)通路中最重要的是MAPK 和NF-κB 信號(hào)通路，其中MAPKs 中的JNK和P38 MAPKS 信號(hào)通路與細(xì)胞反應(yīng)水平的組織損傷有關(guān)。NF-κB 信號(hào)通路有助于促進(jìn)腸功能穩(wěn)定，維護(hù)腸屏障的功能，促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)和組織再生，激活這些通路有助于腸黏膜修復(fù)和避免腸道損傷[12]。

化療所致消化道不良反應(yīng)如CINV 和CID，是大多數(shù)癌癥患者在治療過程中所面臨的重要阻礙，并且是導(dǎo)致化療延遲、減量，甚至終止的常見原因。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，CINV 主要的發(fā)生機(jī)制是細(xì)胞毒性藥物刺激腸道黏膜后引起黏膜損傷，導(dǎo)致腸嗜鉻細(xì)胞局部釋放5-羥色胺(5-HT），5-HT進(jìn)一步與腸壁迷走神經(jīng)傳入終末的5-羥色胺3(5-HT3）受體相互作用，產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)，由迷走傳入神經(jīng)傳入嘔吐中樞導(dǎo)致嘔吐。此外，神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺、P物質(zhì)也在化療所致嘔吐過程中起著重要作用[13，14]。CID 的主要作用機(jī)制尚不完全明確，有證據(jù)表明CID是一個(gè)多因素影響的過程，化療藥物導(dǎo)致急性腸黏膜損傷(包括腸上皮細(xì)胞凋亡、腸壁淺層壞死和炎癥）進(jìn)而導(dǎo)致腸吸收和分泌失衡引起腹瀉[15]。由此可見，化療藥物可直接殺傷腸黏膜細(xì)胞，導(dǎo)致腸道黏膜損傷，炎癥介質(zhì)釋放，造成腸黏膜免疫功能紊亂進(jìn)而導(dǎo)致消化道反應(yīng)的發(fā)生[16]。通過上述研究，我們發(fā)現(xiàn)六君安胃方中的有效化學(xué)成分可能通過某些重要蛋白靶點(diǎn)調(diào)控上述通路，起到保護(hù)、改善腸道黏膜，避免腸黏膜損傷，從而實(shí)現(xiàn)防治CINV和CID的作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了六君安胃方的有效化學(xué)成分、關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)、生物功能及通路之間的相互作用關(guān)系，并利用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行模擬對(duì)接，為六君安胃方的作用機(jī)制作了基本預(yù)測(cè)，為更好地理解中藥復(fù)方干預(yù)化療所致消化道不良反應(yīng)及下一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究提供了參考依據(jù)。