豆根管食通口服液對食管鱗癌細(xì)胞miR-377的影響研究

李偉明，鄭玉玲，尹怡，王俊濤，王祥麒

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，我國食管癌高發(fā)，河南、河北、山西是食管癌發(fā)生率最高的三個省，目前研究已證明吸煙和重度飲酒是其發(fā)病的重要原因[1]。由于食管癌早期癥狀不明顯，所以大多數(shù)患者發(fā)展到晚期才發(fā)現(xiàn)，食管癌的病理分型以鱗癌為主，約占70%～80%以上，中晚期的食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）主要的治療方法是以化療和放療為主，5年生存率只有10%～20%左右[2]。豆根管食通口服液是河南中醫(yī)藥大學(xué)鄭玉玲教授總結(jié)30 多年臨床經(jīng)驗(yàn)而研制出來的中藥制劑，在治療中晚期食管癌方面具有較好療效，王新杰通過臨床觀察食管癌60 例，對比替加氟片，豆根管食通口服液能明顯改善患者吞咽困難，胸骨后悶脹等癥狀，改善卡氏評分，升高血清IL6，降低血清IL10，提高IgM、IgA、IgG，治療兩個療程后總有效率為46.7%[2]。王祥麒通過豆根管食通口服液灌胃治療食管癌動物模型，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)大鼠食管癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與其提高Fas 表達(dá)、降低FasL表達(dá)有關(guān)[3]。王玲玲在體外研究發(fā)現(xiàn)豆根管食通口服液具有明顯抑制Eca-109細(xì)胞的作用，與藥物濃度呈正相關(guān)，還可下調(diào)Eca-109細(xì)胞的端粒酶活性[4]，但是其治療食管癌的作用機(jī)制還不明確。巴云濤發(fā)現(xiàn)miR-377 能夠增加食管癌細(xì)胞TE-1 的放射敏感性，其機(jī)制可能是抑制AKT1/GSK-3β 信號通路[5]。方娜等[6]發(fā)現(xiàn)circ_0072088 靶向調(diào)節(jié)miR-377，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF）基因表達(dá)，在體外促進(jìn)ESCC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。因此，本研究采用RT-PCR的方法檢測miR-377的表達(dá)，探討豆根管食通口服液對ESCC的療效及對miR-377的影響。

1 材料與儀器

1.1 試劑RPMI-1640培養(yǎng)液(杭州基諾生物醫(yī)藥公司），胎牛血清(上海臻諾生物科技有限公司、MTT 試劑盒）艾博抗生物公司，凋亡試劑盒(Applied BioProbes公司）、RT-PCR試劑盒(北京百奧萊博公司）、WB試劑盒(默沙克生物公司）。

1.2 儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Sigma公司）、超凈工作臺(蘇州蘇潔醫(yī)療）、PCR擴(kuò)增儀(賽默飛世爾公司）、電泳槽(伯樂電泳槽公司）、流式細(xì)胞儀(Abcam公司）。

1.3 豆根管食通口服液由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，由山豆根、制天南星、急性子、黃藥子、姜半夏、沉香、郁金、三七等制成，每支10 ml，含生藥1 g/ml。批號：020425。

1.4 細(xì)胞株KYSE450 細(xì)胞，由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供。

1.5 SD大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證：SCXK(京）2018-0005。

2 方法

2.1 豆根管食通口服液含藥血清的制備

SD大鼠60只雌雄各半，將豆根管食通口服液分為高中低三個劑量組，劑量分別為20 g/kg、10 g/kg、5 g/kg，每天給藥2次，連續(xù)3天，末次給藥后1 h采血。經(jīng)過滅火和滅菌處理，低溫保存。

2.2 豆根管食通口服液含藥血清不同濃度、不同時間點(diǎn)對KYSE450細(xì)胞增殖的影響

KYSE450 細(xì)胞貼壁生長于RPMI-1640 培養(yǎng)液中，在37.0 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，每周換液2～3 次，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期的時候開始實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞混勻并依次接種到96 孔板中，分別加入豆根管食通口服液含藥血清高中低劑量組(20%、10%、5%），并放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。測試前每孔加入MTT 試劑10 uL，檢測每孔的光密度值(optical density，OD），重復(fù)3次測量取平均值。根據(jù)細(xì)胞抑制率確定豆根管食通口服液含藥血清中劑量組(10%）為最佳濃度，然后將KYSE450 細(xì)胞分為空白組、豆根管食通口服液含藥血清中劑量組(10%）、氟尿嘧啶組，再次進(jìn)行細(xì)胞增殖MTT檢測。

2.3 豆根管食通口服液含藥血清中劑量組對KYSE450細(xì)胞凋亡的影響

將各組KYSE450 細(xì)胞(0.5-1.0×106）用PBS 洗2次，加入100ulBindingBuffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V，常溫避光30 min，加入PI 5ul，避光反應(yīng)5 min，然后加入Binding Buffer 400ul，用FACScan快速進(jìn)行流式細(xì)胞定量檢測，同時設(shè)置一管為陰性對照(未加AnnexinV-FITC及PI）。

2.4 豆根管食通口服液含藥血清中劑量組對KYSE450細(xì)胞miR-377的影響

使用Trizol試劑提取總RNA，通過分光光度計(jì)進(jìn)行定量，并通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定?？偣彩褂?μgRNA 合成第1 鏈cDNA，并稀釋至100μl。隨后，將2.5μl稀釋的cDNA 混合物用于最終25μl 反應(yīng)體積中的PCR 擴(kuò)增。miR-377 的PCR引物序列下：3’-UGUUUUCAACGGAAACACACU A-5’(F）；5’-CUACCUCCUUCCAGUUGGU-3’(R）。PCR 擴(kuò)增進(jìn)行35 個循環(huán)，產(chǎn)物長度為122 bp。

2.5 豆根管食通口服液含藥血清中劑量組對KYSE450細(xì)胞CD133和VEGF的影響

收集各組細(xì)胞，加入一定的RIPA 重懸細(xì)胞，裂解離心后收集含有蛋白的上清液，測量蛋白濃度，加入適量的4 × Loading buffer，混勻后煮沸5 min。上樣后電泳，轉(zhuǎn)膜，抗原封閉，一抗4 ℃過夜。用含有5%脫脂奶粉稀釋羊抗鼠IgG，室溫孵育1h，滴加顯影液，置于暗室內(nèi)孵育2 min 后，用X光片進(jìn)行曝光。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(）表示，使用多個樣本均數(shù)比較的單因素方差分析。以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度豆根管食通口服液含藥血清在不同時間點(diǎn)對KYSE450細(xì)胞增殖的影響

顯微鏡下觀察不同劑量的豆根管食通口服液含藥血清對KYSE450 細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且在3個時間點(diǎn)存在明顯的時間依賴性和濃度依賴性。各劑量組OD值均低于空白對照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）(見表1、圖1）。因此選擇豆根管食通口服液含藥血清中劑量組(10%）作用48 h 進(jìn)行下一步的研究。然后將KYSE450 細(xì)胞分為空白組、豆根管食通口服液含藥血清中劑量組(10%）、氟尿嘧啶組(終濃度為100 ug/ml），作用48 h，觀察形態(tài)學(xué)變化，通過MTT 檢測增殖情況(見圖2-3）。

表1 豆根管食通口服液含藥血清作用KYSE450細(xì)胞48 h的影響Table1 Effect of Dou Genguan Shitong Oral Liquid with Serum on KYSE450 Cells for 48 h

圖1 豆根管食通口服液含藥血清分別作用KYSE450細(xì)胞24 h、48 h、72 h的OD值Figure1 OD values of Dou Genguan Shitong Oral Liquid with Serum on KYSE450 Cells for 24 h、48 h、72 h

圖2 不同組別對KYSE450細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化Figure 2 Morphological changes of KYSE450 cells in different groups

圖3 MTT法測定不同組別對KYSE450細(xì)胞的影響Figure 3 The effects of different groups on KYSE450 cells were determined by MTT assay

3.2 豆根管食通口服液含藥血清中劑量組對KYSE450細(xì)胞凋亡的影響

將KYSE450 細(xì)胞分為空白組、豆根管食通口服液含藥血清中劑量組(10%）、氟尿嘧啶組(100 ug/ml），作用48 h，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，空白組的細(xì)胞凋亡率為(5.4±0.63）%，豆根管食通口服液含藥血清中劑量組的細(xì)胞凋亡率為(18.8±2.66）%，氟尿嘧啶組的細(xì)胞凋亡率為(26.1 ±2.95）%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，給藥組與空白組相比，兩組的細(xì)胞凋亡率均高于空白組(P＜0.01），見表2和圖4-5。

3.3 豆根管食通口服液含藥血清中劑量組對KYSE450細(xì)胞miR-377的影響

將KYSE450 細(xì)胞分為空白組、豆根管食通口服液含藥血清中劑量組(10%）、氟尿嘧啶組(100 ug/ml），作用48h，RT-PCR 結(jié)果顯示，豆根管食通口服液含藥血清中劑量組和氟尿嘧啶組miR-377表達(dá)增高，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05(P=0.025，P=0.017），見圖6、圖7。

表2 豆根管食通口服液含藥血清作用KYSE450細(xì)胞對凋亡的影響Table 2 Effect of Dou Genguan Shitong Oral Liquid with Serum on apoptosis of KYSE450 Cells

圖4 各組KYSE450細(xì)胞的凋亡率Figure 4 Apoptosis rate of KYSE450 cells of different groups

圖5 不同組別KYSE450細(xì)胞的凋亡率Figure 5 Apoptosis rate of KYSE450 cells of different groups

3.4 豆根管食通口服液含藥血清中劑量組對KYSE450細(xì)胞CD133和VEGF蛋白表達(dá)的影響

圖6 不同組別細(xì)胞的miR-377表達(dá)Figure 6 Expression of miR-377 in different groups

圖7 不同組別細(xì)胞miR-377表達(dá)量半定量分析Figure 7 Semi-quantitative analysis of expression of miR-377 in different groups

將KYSE450 細(xì)胞分為空白組、豆根管食通口服液含藥血清中劑量組(10%）、氟尿嘧啶組(100 ug/ml），作用48 h，WB結(jié)果顯示，豆根管食通口服液含藥血清中劑量組和氟尿嘧啶組CD133表達(dá)下調(diào)，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05(P=0.028，P=0.027），VEGF表達(dá)下調(diào)，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05(P=0.030，P=0.025），見圖8-10。

4 討論

食管癌屬于中醫(yī)“噎膈”范疇，古代醫(yī)家多認(rèn)為本病的病因病機(jī)是情志不暢，肝氣郁結(jié)；或者憂思過度，思慮傷脾；或飲食不節(jié)，肥甘厚膩辛辣刺激均可損傷脾胃，造成氣滯水聚，痰濕凝結(jié)，積聚成塊；或年老體衰，正氣虧虛，癌毒瘤邪乘虛而入[7]?！毒霸廊珪ひ酢匪裕骸耙跻蛔C，必以憂愁思慮，積勞積郁，或酒色過度，損傷而成”，是對噎膈的病因認(rèn)識[8]。目前食管癌仍然是世界上最危險的癌癥之一，生存能力差，治療手段有限。

圖8 不同組別細(xì)胞VEGF和CD133蛋白的表達(dá)Figure 8 Expression of VEGF and CD133 proteins in different groups

圖9 不同組別細(xì)胞CD133蛋白表達(dá)的半定量分析Figure 9 Semi-quantitative analysis of expression of CD133protein in different groups

圖10 不同組別細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的半定量分析Figure 10 Semi-quantitative analysis of expression of VEGF protein in different groups

鄭玉玲根據(jù)自己的臨床經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合食管癌的病因病機(jī)，提出了“豁痰化瘀解毒”的治療方法，依據(jù)中藥藥性藥效及現(xiàn)代藥理研究，精心組方遣藥，在臨床上反復(fù)驗(yàn)證最終形成了豆根管食通口服液，該方以山豆根為君，制南星、姜半夏、急性子、黃藥子、郁金、沉香為臣，三七為佐使[9]，山豆根解毒散結(jié)消腫，制南星溫散化痰、姜半夏降氣化痰散結(jié)、急性子軟堅(jiān)破血消積、黃藥子涼血解毒化痰散結(jié)、郁金活血行氣解毒散結(jié)、沉香行氣降逆，三七散瘀消腫止痛。全方共奏解毒散結(jié)、豁痰化瘀之功效，適用于中醫(yī)辨證為痰氣交阻、津虧熱結(jié)、瘀血內(nèi)結(jié)型的食管癌患者[10]。中晚期食管癌大多屬于本虛標(biāo)實(shí)，治療方法以扶正祛邪為主，豆根管食通口服液攻補(bǔ)兼施，臨床也證實(shí)對中晚期食管癌有確切療效，鄭玉玲觀察60 例中晚期食管癌患者，辨證屬于痰氣交阻、瘀血內(nèi)結(jié)或痰瘀互結(jié)者，對肝腎功無明顯影響，鋇餐檢查提示食管癌的分級減輕，尤其是治療前3、4 級的患者，治療兩個周期后，有效率達(dá)到50%[11]。

microRNAs 的發(fā)現(xiàn)是腫瘤研究的里程碑，miR-377位于14q32染色體區(qū)域，是miRNA家族中重要一員。2017年3月香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系李冰潔團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)miR-377 在食管鱗癌患者的腫瘤組織和血清中的表達(dá)明顯下調(diào)[12]，過表達(dá)miR-377 抑制ESCC 腫瘤的發(fā)生、生長、血管生成以及ESCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移定植，而沉默miR-377則具有相反的作用。而且腫瘤組織和血清中miR-377表達(dá)水平與患者生存率呈正相關(guān)，較高的血清miR-377表達(dá)與腫瘤病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、殘留腫瘤狀態(tài)以及放化療耐藥性呈負(fù)相關(guān)[13]。驗(yàn)證了miR-377 在抑制食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用與CD133和VEGF有關(guān)，可能是一種有前景的無創(chuàng)診斷、預(yù)后生物標(biāo)志物和ESCC 患者的治療策略[14]，但是miR-377 在食管鱗癌中的生物學(xué)功能、臨床意義及治療意義還需要進(jìn)一步的研究。

在本研究中，本實(shí)驗(yàn)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)豆根管食通口服液能夠抑制KYSE450 細(xì)胞增殖，MTT 結(jié)果顯示對細(xì)胞增殖的抑制效果與藥物濃度和作用時間呈正相關(guān)，其中豆根管食通口服液含藥血清中劑量組能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率高于空白對照組，能夠促進(jìn)miR-377基因表達(dá)。EL B等[14]研究在ESCC組織和細(xì)胞中顯著過表達(dá)機(jī)制上，miR-377 通過直接結(jié)合到3′非翻譯區(qū)來調(diào)節(jié)CD133 和VEGF。因此本實(shí)驗(yàn)通過檢測CD133 和VEGF 蛋白表達(dá)，豆根管食通口服液含藥血清中劑量組CD133表達(dá)下調(diào)、VEGF表達(dá)下調(diào)。因此，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)豆根管食通口服液對食管鱗癌KYSE450 細(xì)胞株有抗增殖、促凋亡的作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)miR-377的表達(dá)，進(jìn)而抑制CD133和VEGF表達(dá)。

本研究揭示了豆根管食通口服液抗食管鱗癌的部分作用機(jī)理，為該藥的臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供了理論依據(jù)，但還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。