卡馬西平對(duì)癲癇模型大鼠海馬損傷作用及對(duì)Fascin-1、突觸素表達(dá)的影響

朱百科，王新新

癲癇主要是由于大腦神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致發(fā)病，引起腦功能短暫失調(diào)，影響運(yùn)動(dòng)感覺、行為意識(shí)和精神狀態(tài)。癲癇反復(fù)發(fā)作對(duì)病人的身心健康產(chǎn)生嚴(yán)重傷害，其中20%～30%的癲癇病人會(huì)引發(fā)認(rèn)知功能、精神行為障礙，進(jìn)而向難治性癲癇發(fā)展[1]?？R西平是臨床常用的抗癲癇藥物，其治療窗較窄，長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致病人發(fā)生低鈉血癥、致畸、造血功能障礙，對(duì)生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響[2]。目前臨床應(yīng)用時(shí)為了避免其副作用，提高治療效果，采用卡馬西平聯(lián)合中藥進(jìn)行治療[3]。肌成束蛋白(Fascin-1)與F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合形成細(xì)胞骨架蛋白，參與細(xì)胞形態(tài)學(xué)、功能發(fā)展過程。Fascin-1通過實(shí)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白捆綁，促進(jìn)樹突棘形成以及囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，在突觸重塑過程中發(fā)揮著重要作用[4]。突觸素(synaptophysin，SYP)屬于一種鈣結(jié)合糖蛋白，與突觸結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)，主要在神經(jīng)元突觸小泡分泌細(xì)胞中存在，是突觸前終末的特異性標(biāo)記物，參與突觸囊的導(dǎo)入、轉(zhuǎn)運(yùn)過程，在神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸囊泡再循環(huán)以及突觸發(fā)生具有重要作用[5]。本研究觀察卡馬西平對(duì)癲癇模型大鼠海馬損傷的作用及對(duì)Fascin-1、突觸素表達(dá)的影響，為治療癲癇提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇54只無(wú)特定病原體動(dòng)物(SPF)級(jí)SD健康大鼠，由基爾頓生物科技(上海)有限公司提供。鼠齡4～10(6.8±0.5)周，體質(zhì)量210～260(230.4±21.5)g，飼養(yǎng)溫度為22～25 ℃，室內(nèi)濕度35%～40%，飼養(yǎng)室定時(shí)進(jìn)行紫外線照射消毒。統(tǒng)一喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，允許自由活動(dòng)，飼養(yǎng)時(shí)間為1周。本研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得山東省立第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型建立 選取40只大鼠，參考文獻(xiàn)[6]方法造模，大鼠麻醉后固定于立體定向儀上，充分暴露前囟，在前囟后0.8 mm，中線旁開1.3 mm，硬膜下3.7 mm，使用5 mL規(guī)格注射器，向側(cè)腦室內(nèi)注射1 μg/μL海人酸溶液，在10 min內(nèi)注射完，留針5 min后，拔除針頭，對(duì)頭皮進(jìn)行縫合。隨后觀察大鼠前肢、后肢陣攣、站立、跌倒、咀嚼點(diǎn)頭、面部抽動(dòng)癥狀表現(xiàn)，根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判斷大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)處于幾級(jí)表現(xiàn)，當(dāng)大鼠癥狀表現(xiàn)為Ⅳ～Ⅴ級(jí)，則說明癲癇大鼠模型建立成功。本研究因過度抽搐導(dǎo)致死亡4只。

1.2.2 用藥干預(yù) 40只模型大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，各10只，另10只正常組，低劑量組、中劑量組、高劑量組給予卡馬西平(質(zhì)量濃度2 g/L)進(jìn)行治療，劑量分別為15 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg，每天1次。模型組和正常組給予等體積的無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。

1.2.3 腦電圖相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 所有大鼠用藥干預(yù)1個(gè)月后，采用腦電圖機(jī)(美國(guó)韋迪公司EB Neuro系統(tǒng))對(duì)腦電數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。將大鼠固定在固定器中，帶上自制眼罩，放置電極。采用單導(dǎo)針刺電極記錄大鼠腦電圖，電極放于C4區(qū)，在同側(cè)耳部，接地電極在大鼠尾部。電壓設(shè)置為10 μV/mm，時(shí)間設(shè)置為0.3 s，紙速為12 mm/s，高頻率波為35 Hz。數(shù)據(jù)記錄時(shí)間為20 min，主要觀察各組大鼠潛伏期、持續(xù)時(shí)間、波幅指標(biāo)。

1.2.4 發(fā)作次數(shù)、發(fā)作總時(shí)間統(tǒng)計(jì) 大鼠開始用藥后，使用攝像機(jī)每天記錄大鼠癲癇發(fā)作情況。0級(jí)：無(wú)抽搐發(fā)作；1級(jí)：大鼠僅面部抽搐，有咀嚼動(dòng)作，并伴隨濕狗樣抖動(dòng)；2級(jí)：大鼠頭頸部肌肉痙攣，出現(xiàn)點(diǎn)頭、甩頭動(dòng)作；3級(jí)：?jiǎn)蝹?cè)前肢陣攣；4級(jí)：大鼠后肢站立，雙側(cè)前肢陣攣；5級(jí)：大鼠后肢失去平衡，常跌倒，雙側(cè)前肢陣攣加重，并且全身出現(xiàn)強(qiáng)直陣攣。觀察1周并統(tǒng)計(jì)所有大鼠發(fā)作次數(shù)、發(fā)作總時(shí)間。

1.2.5 海馬區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)觀察 所有大鼠腹腔注射3.0% 80 mg/kg戊巴比妥麻醉后，取大鼠腦組織，并迅速分離出海馬組織，使用液氮進(jìn)行快速冷凍后，在溫度為-70 ℃的環(huán)境下保存，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋后，連續(xù)石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法(HE)染色處理后觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元狀況。半定量法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)，細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)紫色、深藍(lán)褐色顆粒表示為陽(yáng)性染色。每張切片選擇3個(gè)不同視野取平均數(shù)，統(tǒng)計(jì)大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)。采用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)法對(duì)切片進(jìn)行染色，細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)紫、深藍(lán)褐色顆粒表示為陽(yáng)性染色即為神經(jīng)元凋亡細(xì)胞。

1.2.6 Fascin-1、突觸素、Bcl-2、Bax表達(dá)水平檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)，將采集到的標(biāo)本離心處理10 min，取出上清液，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白定量，將50 μg蛋白加入2×SDS凝膠加樣緩沖液中，100 ℃加熱處理5 min促使蛋白變性。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后取下硝酸纖維素膜，在5%脫脂牛奶中4 ℃下封閉1 h，封閉結(jié)束后，加一抗使用0.05%～0.1% TBST給予稀釋(Fascin-1、突觸素、Bcl-2、Bax一抗為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次為5 min，加二抗使用0.05%～0.1% TBST給予稀釋(1∶10 000)，室溫?fù)u動(dòng)孵育 1 h，最后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次5 min。采用DAB染色試劑盒顯色，光密度掃描后進(jìn)行定量分析。以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 卡馬西平對(duì)癲癇模型大鼠腦電圖相關(guān)指標(biāo)的影響 模型組潛伏期低于正常組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，持續(xù)時(shí)間、波幅高于正常組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卡馬西平各劑量組潛伏期高于模型組，持續(xù)時(shí)間、波幅低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組潛伏期高于低劑量組和高劑量組，持續(xù)時(shí)間、波幅低于低劑量組和高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量組和高劑量組潛伏期、持續(xù)時(shí)間、波幅比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠腦電圖相關(guān)指標(biāo)水平比較(±s)

2.2 卡馬西平對(duì)癲癇模型大鼠發(fā)作次數(shù)、發(fā)作總時(shí)間的影響 模型組發(fā)作次數(shù)、發(fā)作總時(shí)間高于低劑量組、中劑量組、高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組發(fā)作次數(shù)、發(fā)作總時(shí)間低于低劑量組和高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量組和高劑量組發(fā)作次數(shù)、發(fā)作總時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作總時(shí)間比較(±s)

2.3 卡馬西平對(duì)癲癇模型大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況的影響 模型組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)高于正常組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)低于低劑量組和高劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量組和高劑量組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s)

各組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡HE染色顯示，模型組神經(jīng)元細(xì)胞減少，排列無(wú)規(guī)律，皺縮、核裂解，核仁模糊不清，中劑量組明顯改善了海馬區(qū)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)元損傷狀況。詳見圖1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況(HE染色，×200)

2.4 卡馬西平對(duì)癲癇模型大鼠Fascin-1、突觸素、Bcl-2、Bax表達(dá)水平的影響 模型組Fascin-1、Bcl-2表達(dá)水平低于正常組、低劑量組、中劑量、高劑量組，突觸素、Bax表達(dá)水平高于正常組、低劑量組、中劑量、高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組Fascin-1、Bcl-2表達(dá)水平高于低劑量組和高劑量組，突觸素、Bax表達(dá)水平低于低劑量組和高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量組和高劑量組Fascin-1、突觸素、Bcl-2、Bax表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。Western Blot檢測(cè)各組癲癇大鼠Fascin-1、突觸素、Bcl-2、Bax表達(dá)結(jié)果見圖2。

表4 各組大鼠Fascin-1、突觸素、Bcl-2、Bax表達(dá)水平比較(±s)

圖2 Western Blot檢測(cè)各組大鼠Fascin-1、突觸素、Bcl-2、Bax表達(dá)比較

3 討 論

癲癇屬于一種腦神經(jīng)疾病，臨床主要采用藥物進(jìn)行治療?？R西平能降低血腦屏障透過率，降低腦組織中有效濃度，主要是通過肝和腸道代謝，與其他藥物聯(lián)用，能抑制CYP3A4代謝酶，升高卡馬西平血藥濃度[7-8]?？R西平在臨床應(yīng)用中需要對(duì)病人的血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，最大限度地降低其在治療癲癇過程中的毒副作用[9]。

本研究結(jié)果顯示，卡馬西平干預(yù)后大鼠潛伏期提高，持續(xù)時(shí)間、波幅降低，說明卡馬西平能改善大鼠腦電圖相關(guān)指標(biāo)，中劑量組潛伏期升高，持續(xù)時(shí)間、波幅低，說明中劑量卡馬西平作用效果最明顯。薛韜等[10]研究指出，定癇顆粒聯(lián)合卡馬西平可改善大鼠腦電圖相關(guān)指標(biāo)潛伏期、持續(xù)時(shí)間、波幅，從而改善大鼠臨床癥狀?？R西平干預(yù)后大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作總時(shí)間降低，中劑量組發(fā)作次數(shù)、發(fā)作總時(shí)間最低，說明中劑量卡馬西平改善大鼠臨床癥狀效果更佳，促進(jìn)恢復(fù)。

癲癇發(fā)病后導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，因此，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡能間接反映癲癇的發(fā)作程度[11]。本研究顯示，中劑量組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)最低，說明中劑量卡馬西平能降低大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡狀況，改善神經(jīng)元凋亡狀況。Fascin-1不足或者是調(diào)節(jié)功能異常，會(huì)影響大腦發(fā)育和可塑性失常。在大鼠失神發(fā)作模型中，F(xiàn)ascin-1蛋白水平表達(dá)降低，在神經(jīng)活動(dòng)中下調(diào)Fascin-1水平，會(huì)引起突觸結(jié)構(gòu)改變[12]。神經(jīng)元培養(yǎng)模型研究中，F(xiàn)ascin-1發(fā)生分解降低，伴隨著樹突棘短暫回縮，主要是受肌動(dòng)蛋白束的分解影響，促進(jìn)突觸重塑[13]。目前Fascin-1在癲癇中的表達(dá)相關(guān)研究較少。突觸素密度和分布情況能間接反映機(jī)體突觸的數(shù)量和分布狀況，也是突觸重建和神經(jīng)可塑性的關(guān)鍵[14]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)突觸素在癲癇病人以及癲癇動(dòng)物模型中研究越來越廣，在評(píng)估突觸重建可塑性變化方面發(fā)揮著重要作用[15]。相關(guān)研究顯示，癲癇發(fā)作過程中海馬內(nèi)突觸素表達(dá)增強(qiáng)，在慢性期伴隨軸突增生和突觸重建發(fā)生，突觸素異位表達(dá)以及表達(dá)增強(qiáng)與癲癇慢性自發(fā)發(fā)作有關(guān)[16]。Bcl-2、Bax均屬于Bcl-2基因家族成員，其中Bcl-2是一種凋亡抑制基因，Bax基因是一種凋亡誘導(dǎo)基因，與細(xì)胞的凋亡、增殖具有一定的相關(guān)性[17-18]。Bcl-2參與細(xì)胞凋亡，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜的胞質(zhì)面及線粒體外膜中，主要是通過與膜結(jié)合發(fā)揮作用。Bcl-2蛋白是線粒體PT孔道的主要組成成分，pH較高會(huì)形成離子通道，Bax在pH范圍內(nèi)促進(jìn)孔道形成，有助于離子以及小分子物質(zhì)穿過線粒體膜，進(jìn)入到胞質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2作用與Bax作用正相反，能封閉孔道活性，降低分子通透性，從而抑制大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡[19-20]。本研究指出，中劑量卡馬西平Fascin-1、Bcl-2表達(dá)水平最高，突觸素、Bax表達(dá)水平降低，說明中劑量卡馬西平作用效果最顯著，通過調(diào)控Fascin-1、Bcl-2、突觸素、Bax表達(dá)水平，降低海馬區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)，改善神經(jīng)元細(xì)胞凋亡狀況。

綜上所述，卡馬西平能降低癲癇模型大鼠海馬損傷程度，起到一定的抗癲癇作用，可能與調(diào)控Fascin-1、突觸素、Bcl-2、Bax表達(dá)水平有關(guān)。