基于Nrf2通路研究丹參酮ⅡA對自發(fā)性高血壓大鼠血壓及血管活性物質(zhì)的影響

李文娣，孫 娟

自發(fā)性高血壓是一種以高血壓為主要臨床表現(xiàn)且病因不明的疾病，是中風、冠心病和其他高風險疾病的主要危險因素，自發(fā)性高血壓占高血壓發(fā)病率的90%，且發(fā)病率逐年上升[1-2]。因此，有效控制血壓仍然是全球公共衛(wèi)生問題。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，正常生理狀態(tài)下，Nrf2存在于細胞質(zhì)中，氧化應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2從細胞質(zhì)進入到細胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合后，啟動下游靶基因，調(diào)節(jié)血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)、依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶Ⅰ[NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1，NQO1]等的轉(zhuǎn)錄活性[3]。丹參酮ⅡA是從丹參的根中分離出的天然二萜醌，具有促進血液循環(huán)和緩解血管瘀滯作用[4]。丹參酮ⅡA可有效治療冠心病、腦血管疾病和心血管疾病[5-6]，還具有抗氧化、抗炎和抗癌活性，丹參酮ⅡA硫酸鈉通過激活大鼠Nrf2信號通路保護心肌免受百草枯誘導(dǎo)的毒性反應(yīng)[7]。本研究分析丹參酮ⅡA是否通過Nrf2通路對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)有治療作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 丹參酮ⅡA(純度98%)購自成都普瑞法公司。苯那普利購自上海新亞藥業(yè)閔行有限公司。60只體質(zhì)量180～220 g雄性自發(fā)性高血壓大鼠和15只體質(zhì)量180～220 g健康雄性Wistar-Kyoto(WKY)大鼠，均購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒和免疫組化試劑盒購自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒、RIPA裂解液和AT1R抗體購自美國Abcam公司。Nrf2、HO-1、NQO1、β-actin抗體和山羊抗兔IgG二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與給藥 15只WKY大鼠為空白對照組；60只雄性自發(fā)性高血壓大鼠分為自發(fā)性高血壓組、丹參酮ⅡA低劑量組(25 mg/kg)、丹參酮ⅡA高劑量組(50 mg/kg)[8]和苯那普利組(10 mg/kg)[9]，每組15只。空白對照組和自發(fā)性高血壓組大鼠每天給予相同劑量的生理鹽水，用藥組大鼠每天灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，連續(xù)給藥8周。

1.2.2 血壓測量 使用尾套法在大鼠清醒時測定收縮壓，在給藥前及給藥1周、5周、8周時分別測量收縮壓測量。將大鼠置于37 ℃恒溫固定器中約10 min。用連接到尾套裝置的適當尺寸管狀尾套閉塞大鼠尾巴。通過XH200恒溫無創(chuàng)血壓計和MD3000生物信號采集與處理系統(tǒng)測量大鼠的收縮壓。每次測量3次，取平均值。

1.2.3 眼底檢查 大鼠用10%水合氯醛麻醉后，使用眼底照相術(shù)進行眼底檢查。在末次給藥結(jié)束后，眼底照相機觀察和拍攝視神經(jīng)基底。通過檢查眼底直接觀察小動脈變化。

1.2.4 取材、固定與保存 實驗結(jié)束時，將所有禁食12 h的大鼠稱重并用10%水合氯醛麻醉，然后從心尖部采血于離心管中，1 500 r/min，離心15 min后取血清，于-80 ℃保存。取血結(jié)束后，立即取出胸主動脈，用生理鹽水清洗干凈。胸主動脈分成2份，一半胸主動脈放入4%多聚甲醛中固定，另一半胸主動脈速存于-80 ℃中。

1.2.5 病理學(xué)觀察 將胸主動脈包埋于石蠟中，然后通過切片、展片烤片、HE組織學(xué)染色測定，并在光學(xué)顯微鏡下觀察其病理變化。

1.2.6 血管活性物質(zhì)檢測 采用ELISA法測定各組大鼠所采集血清中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、內(nèi)皮素(ET)、去甲腎上腺素(NE)和血栓素B2(TXB2)含量。

1.2.7 AngⅡ的受體(ATIR)陽性表達 將胸主動脈包埋于石蠟中，通過切片、展片烤片、脫水，3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加非免疫動物血清20 min，滴加一抗、PBS沖洗、滴加二抗、沖洗后加ABC復(fù)合物、DAB顯色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，按照免疫組化染色陽性細胞數(shù)在每一高倍視野中所占比例依次統(tǒng)計，用Image Pro Plus圖像分析軟件進行分析。

1.2.8 免疫印跡法(Western Blot)檢測 取胸主動脈并(100 mg)置于加有1 mL制備好的RIPA裂解液中，充分研磨提取蛋白，使用Lowry方法定量總蛋白質(zhì)含量。用SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。含有5%脫脂牛奶的PBS封閉膜1 h，洗去多余的脫脂奶粉。加入稀釋后的Nrf2、HO-1、NQO1和β-actin一抗，4 ℃搖床上孵育過夜。TBST洗膜3次，加入對應(yīng)于一抗種屬來源稀釋后的二抗，室溫下，在搖床上孵育1 h，TBST洗膜3次。使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 丹參酮ⅡA對大鼠收縮壓的影響 給藥前，空白對照組大鼠血壓正常，自發(fā)性高血壓組大鼠血壓升高(P<0.01)，其余組大鼠血壓與自發(fā)性高血壓組大鼠比較無明顯變化；給藥1周后，用藥組大鼠血壓無明顯變化；給藥5周后，丹參酮ⅡA低劑量、丹參酮ⅡA高劑量組和苯那普利組大鼠血壓較自發(fā)性高血壓組下降(均P<0.05)；給藥8周后，與自發(fā)性高血壓組比較，丹參酮ⅡA低劑量、丹參酮ⅡA高劑量組大鼠血壓均下降(均P<0.05)，苯那普利組大鼠血壓明顯下降(P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠收縮壓比較 (±s) 單位：mmHg

2.2 丹參酮ⅡA對大鼠胸主動脈形態(tài)學(xué)的影響 肉眼形態(tài)學(xué)觀察顯示(見圖1)，與空白對照組比較，自發(fā)性高血壓組有明顯的內(nèi)皮損傷和血管彈性降低，丹參酮ⅡA低劑量、丹參酮ⅡA高劑量和苯那普利降低了血管內(nèi)皮損傷并增加了血管彈性，其中苯那普利最為明顯。

圖1 肉眼觀察胸主動脈的形態(tài)

HE染色結(jié)果顯示(見圖2)，自發(fā)性高血壓組大鼠胸主動脈壁明顯增厚，內(nèi)膜表面不光滑，內(nèi)皮連續(xù)性差，內(nèi)皮細胞排列不規(guī)則，形態(tài)不規(guī)則，平滑肌細胞紊亂。丹參酮ⅡA低劑量、丹參酮ⅡA高劑量和苯那普利組大鼠胸主動脈的內(nèi)皮相對平滑，內(nèi)皮細胞排列整齊。

圖2 HE染色觀察各組大鼠胸主動脈病理情況 (×200)

2.3 丹參酮ⅡA對大鼠視網(wǎng)膜動脈的影響 在末次給藥結(jié)束后，空白對照組大鼠視網(wǎng)膜動脈直徑正常，自發(fā)性高血壓組大鼠視網(wǎng)膜動脈直徑略窄，丹參酮ⅡA低劑量、丹參酮ⅡA高劑量和苯那普利均逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，大鼠視網(wǎng)膜動脈直徑變寬，其中苯那普利組效果最明顯。詳見圖3。

圖3 通過眼底照相觀察各組大鼠視網(wǎng)膜動脈的直徑

2.4 丹參酮ⅡA對血管活性物質(zhì)的影響 與空白對照組比較，自發(fā)性高血壓組大鼠血清中AngⅡ、ET、NE和TXB2含量均明顯增加(均P<0.01)；與自發(fā)性高血壓組相比，丹參酮ⅡA低劑量、丹參酮ⅡA高劑量和苯那普利能降低AngⅡ、ET、NE和TXB2的含量(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠血管活性物質(zhì)的表達水平比較 (±s)

2.5 丹參酮ⅡA對AT1R表達的影響 AT1R的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示陽性染色為褐色，主要分布在胸主動脈血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的膜或細胞質(zhì)中。AT1R在空白對照組中呈弱陽性，在丹參酮ⅡA低劑量、丹參酮ⅡA高劑量和苯那普利組中陽性表達降低，其中苯那普利組最明顯。詳見圖4、表3。

圖4 免疫組化觀察大鼠胸主動脈中ATIR的陽性表達(×200)

表3 各組大鼠胸主動脈中AT1R的陽性表達率比較(±s) 單位：%

2.6 丹參酮ⅡA對Nrf2通路相關(guān)蛋白的影響 與空白對照組比較，自發(fā)性高血壓組大鼠胸主動脈中Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表達量降低(均P<0.01)；與自發(fā)性高血壓組相比，丹參酮ⅡA低劑量、丹參酮ⅡA高劑量和苯那普利組大鼠胸主動脈中Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表達量明顯增加(P<0.05或P<0.01)。詳見圖5、表4。

圖5 Western Blot測量各組大鼠胸主動脈中Nrf2通路相關(guān)蛋白的表達情況

表4 各組大鼠胸主動脈中Nrf2通路相關(guān)蛋白的表達情況(±s)

3 討 論

自發(fā)性高血壓是一種原因不明的心血管疾病，與許多因素有關(guān)。它主要由血壓升高引起，嚴重威脅人類健康[10]。中醫(yī)學(xué)認為高血壓病主要是由素體稟賦不足、內(nèi)傷虛損、飲食失調(diào)等多種因素引起，致使陰陽消長失調(diào)，進而出現(xiàn)損陰、傷陽、絡(luò)脈失養(yǎng)等變化。而氣血逆亂、絡(luò)脈損傷會導(dǎo)致一系列腦、心、腎合并癥的發(fā)生。因此，中醫(yī)藥及其配方在治療高血壓方面受到了廣泛關(guān)注，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景和研究價值。

Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子，負責調(diào)節(jié)哺乳動物的細胞氧化還原平衡、保護性抗氧化劑和Ⅱ期解毒反應(yīng)[11]。Nrf2激活后進入細胞核能與ARE結(jié)合，進而上調(diào)下游抗氧化基因HO-1、NQO1的表達[12]。HO-1能保護細胞免受氧化損傷，調(diào)節(jié)細胞凋亡，調(diào)節(jié)炎癥以及促進血管生成而發(fā)揮有益作用。另一方面，HO-1水平的紊亂與一些年齡依賴性疾病的發(fā)病機制有關(guān)，包括神經(jīng)變性、癌癥或黃斑變性[13]。NQO1的表達與Nrf2的激活有關(guān)，其在抗氧化過程中起著至關(guān)重要作用[14]。研究表明，蘆丁對大鼠體內(nèi)Kim-1/NF-κB/Nrf2信號通路調(diào)控氟化鈉誘導(dǎo)的高血壓有改善作用[15]。

丹參味苦、微寒、無毒，屬于唇形科植物，其根部提取物丹參酮ⅡA有疏通血管、改善微循環(huán)、抗炎、增強免疫力等作用，在臨床上作為一種保護心臟、保肝，甚至作為抗致癌物質(zhì)[16]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA在高血壓發(fā)病過程中通過失活PDK1預(yù)防大鼠基底動脈平滑肌細胞增殖[17]。

本實驗中，丹參酮ⅡA低劑量、高劑量均能降低大鼠血壓，提示丹參酮ⅡA對自發(fā)性高血壓有一定的治療作用。通過肉眼觀察各組大鼠胸主動脈，發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA低劑量、高劑量均能降低血管內(nèi)皮損傷，并增加血管彈性，說明丹參酮ⅡA對主動脈有保護作用。HE染色結(jié)果也表明，丹參酮ⅡA低劑量、高劑量均能使大鼠胸主動脈的內(nèi)皮相對平滑，內(nèi)皮細胞排列整齊。視網(wǎng)膜血管直徑是評估微血管重塑的重要指標，丹參酮ⅡA低劑量、高劑量均可改善因高血壓引起的大鼠視網(wǎng)膜動脈直徑變窄現(xiàn)象，這表明丹參酮ⅡA改善了高血壓引起的微血管功能障礙。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在高血壓的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，是調(diào)節(jié)血壓的關(guān)鍵機制。RAAS的過度激活是高血壓的主要原因之一[18]。AngⅡ是RAAS中的重要物質(zhì)且在AT1R中起著重要作用，可引起血管收縮，刺激醛固酮分泌，增加水鈉潴留，刺激交感神經(jīng)活動，并提高血壓。丹參酮ⅡA低劑量、高劑量降低AngⅡ、ET、NE和TXB2的含量，說明丹參酮ⅡA能抑制RAAS的激活，進一步控制血壓。AT1R是Ang Ⅱ的主要受體，其介導(dǎo)血管阻塞，促進血管平滑肌細胞在高血壓發(fā)展中的增殖作用，起著重要作用[19]。丹參酮ⅡA低劑量、高劑量能降低AT1R的陽性表達，提示丹參酮ⅡA能抑制AngⅡ的活性，降低血壓。丹參酮ⅡA低劑量、高劑量能明顯提高大鼠胸主動脈中Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表達量，說明丹參酮ⅡA能激活Nrf2通路，調(diào)控大鼠血壓變化。

丹參酮ⅡA對自發(fā)性高血壓大鼠具有明顯的降壓作用，其機制可能與抑制血管活性物質(zhì)的表達，激活Nrf2通路有關(guān)。丹參酮ⅡA作為丹參根部的提取物，屬于天然藥物，因此，開發(fā)丹參酮ⅡA為先導(dǎo)化合物新型藥物，為今后預(yù)防以及治療高血壓疾病奠定了基礎(chǔ)。