過(guò)量氟對(duì)體外培養(yǎng)LS8細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響

寇明清,馬志軍,李玨丹,阮建平

(1陜西省人民醫(yī)院CT室,西安 710068;2西安市第九醫(yī)院口腔科;3陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;4西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院綜合科;5西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院預(yù)防科;*通訊作者,E-mail:1009372603@qq.com)

氟牙癥是釉質(zhì)發(fā)育期機(jī)體攝入過(guò)量氟引起的釉質(zhì)發(fā)育不全,主要發(fā)生于高氟區(qū),表現(xiàn)為牙釉質(zhì)顏色改變甚至缺損,影響患者的顏面美觀和咀嚼功能,給患者造成嚴(yán)重的心理和生理障礙[1,2],然而,氟牙癥目前尚無(wú)理想治療方法。因此,深入探究氟牙癥發(fā)病機(jī)制,為開(kāi)發(fā)篩選有效的氟中毒治療藥物進(jìn)而解決我國(guó)重要的公共衛(wèi)生與臨床治療問(wèn)題提供新靶點(diǎn)。

本課題組[3,4]及Suziki等[5,6]的研究表明過(guò)量氟主要通過(guò)對(duì)成釉細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用使釉質(zhì)礦化受到影響,導(dǎo)致氟牙癥發(fā)生。過(guò)量氟可從多個(gè)方面對(duì)成釉細(xì)胞產(chǎn)生影響,包括蛋白合成、增殖、凋亡、分泌、內(nèi)吞作用、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)及自噬[3,5-12],然而對(duì)炎癥反應(yīng)的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究用過(guò)量氟干預(yù)體外培養(yǎng)LS8細(xì)胞,觀察其對(duì)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)影響,為解決我國(guó)重要的公共衛(wèi)生與臨床治療問(wèn)題提供線索和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

實(shí)時(shí)定量PCR儀(Agilent Technologies公司,美國(guó)),微量核酸蛋白定量?jī)xNano Drop2000(Thermo Fisher Scientific公司,美國(guó)),PCR儀(BIO-RAD公司,美國(guó)),蛋白電泳、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LS8細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液,在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)LS8細(xì)胞,隔天換新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至培養(yǎng)瓶的70%-80%時(shí),用胰蛋白酶消化細(xì)胞,按1 ∶4傳代培養(yǎng)。

1.2.2 氟化物處理LS8細(xì)胞 將LS8細(xì)胞接種到6孔板中孵育24 h,后加入含有濃度為2 mmol/L NaF的培養(yǎng)液,37 ℃,5% CO2分別培養(yǎng)0,12,24,48 h,收集細(xì)胞用于檢測(cè)IL-1β,IL-6,TNF-α及NF-κB mRNA水平。

將LS8細(xì)胞接種到6孔板中孵育24 h,后加入含有2.0 mmol/L NaF的培養(yǎng)液,37 ℃,5% CO2分別培養(yǎng)0,8,15,30,60,120 min,收集細(xì)胞用于檢測(cè)P38蛋白磷酸化水平。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞mRNA改變 Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,酶標(biāo)儀測(cè)定OD260/280并檢測(cè)RNA濃度和純度。根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明,對(duì)2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,PCR反應(yīng)體系:5 μl SYBR Green PCR反應(yīng)液、0.4 μl cDNA模板、1 μl PCR引物,加雙蒸水至10 μl。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。β-actin為內(nèi)參對(duì)照,采用2-ΔΔCt法對(duì)樣本進(jìn)行相對(duì)定量。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞P38蛋白磷酸化水平改變 收集細(xì)胞,加入70 μl RIPA裂解液冰上裂解30 min,4 ℃下離心5 min,收集上清。BCA法檢測(cè)蛋白濃度,取細(xì)胞總蛋白15 μg,上樣量10 μl,5 μl Marker,進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳。在200 mA恒流條件下,轉(zhuǎn)膜1 h至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉PVDF膜2 h。后分別加入抗兔p-P38抗體(1 ∶1 000)、抗兔P38抗體(1 ∶1 000)、抗兔β-actin抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次后用山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1.5 h。用TBST洗膜3次后,將PVDF膜置于凝膠成像分析系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)盒中,ECL發(fā)光液均勻放置于PVDF膜上,調(diào)整參數(shù)曝光后圖像分析儀處理。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)量氟對(duì)LS8細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)影響

2 mmol/L NaF分別干預(yù)LS8細(xì)胞12,24,48 h后,qRT-PCR結(jié)果顯示:IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增加,24 h和48 h時(shí)與0 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖1);IL-6 mRNA表達(dá)在48 h時(shí)也顯著增加(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

與0 h比較,*P<0.05圖1 過(guò)量氟對(duì)LS8細(xì)胞IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA的表達(dá)影響Figure 1 Effect of high fluoride on IL-1β,IL-6 and TNF-α mRNA levels in LS8 cells

2.2 過(guò)量氟對(duì)LS8細(xì)胞NF-κB mRNA表達(dá)影響

2 mmol/L NaF干預(yù)LS8細(xì)胞12,24 h,qRT-PCR結(jié)果顯示:NF-κB mRNA表達(dá)均顯著增加(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

與0 h比較,*P<0.05圖2 過(guò)量氟對(duì)LS8細(xì)胞NF-κB mRNA的表達(dá)影響Figure 2 Effect of high fluoride on NF-κB mRNA levels in LS8 cells

2.3 過(guò)量氟對(duì)LS8細(xì)胞P38磷酸化影響

2 mmol/L NaF短時(shí)間(0-120 min)作用LS8細(xì)胞時(shí),Western blotting結(jié)果顯示:P38磷酸化呈時(shí)間依賴性增加,即8 min和15 min時(shí)輕微增加,30 min時(shí)顯著增加,最大量的磷酸化在120 min時(shí)發(fā)生(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

3 討論

氟牙癥發(fā)生主要有兩方面原因。一方面,由于地理環(huán)境中氟豐度過(guò)高,引起地區(qū)性氟牙癥流行,我國(guó)各省、市、自治區(qū)均有不同程度流行,以山東、陜西等省區(qū)病情較重;另一方面,人為攝入過(guò)量氟化物。當(dāng)前飲水氟化、食鹽氟化等全身用氟防齲措施在全球多個(gè)國(guó)家被廣泛實(shí)施,含氟牙膏、含氟漱口水等局部用氟產(chǎn)品也已大量市場(chǎng)化,然而氟化物攝入又缺乏嚴(yán)格有效的指導(dǎo)和監(jiān)督,從而導(dǎo)致氟牙癥發(fā)病率增加,呈散發(fā)態(tài)勢(shì)。然而,氟牙癥目前無(wú)理想治療方法。因此,深入探究氟牙癥發(fā)病機(jī)制,對(duì)解決我國(guó)重要的公共衛(wèi)生與臨床治療問(wèn)題具有重要意義。近年來(lái),學(xué)者們針對(duì)成釉細(xì)胞的氟毒性作用進(jìn)行了大量研究,發(fā)現(xiàn)過(guò)量氟可從多個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)成釉細(xì)胞造成損傷進(jìn)而影響釉質(zhì)礦化,然而對(duì)炎癥的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究著重觀察過(guò)量氟對(duì)體外培養(yǎng)LS8細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)影響。

與0 min比較,*P<0.05圖3 過(guò)量氟作用LS8細(xì)胞不同時(shí)間P38磷酸化情況Figure 3 Effect of high fluoride on the phosphorylation of P38 in LS8 cells

IL-1β、TNF-α和IL-6都是典型的前炎性細(xì)胞因子,可與特定受體結(jié)合進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),在炎癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用[13,14]。湯婷婷等[15]報(bào)道NaF可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化,并釋放TNF-α和IL-1β,而TNF-α和IL-1β的過(guò)量增多破壞血腦屏障,導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,然而在氟牙癥發(fā)生中,過(guò)量氟對(duì)成釉細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)影響尚未見(jiàn)報(bào)道,本研究顯示過(guò)量氟可使LS8細(xì)胞中IL-1、TNF-α和IL-6表達(dá)均顯著增加,我們推測(cè)炎癥反應(yīng)很可能參與了過(guò)量氟導(dǎo)致的LS8細(xì)胞損傷過(guò)程。

NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中起核心調(diào)控作用,可被應(yīng)激、前炎癥因子等激活。研究發(fā)現(xiàn)IL-1β、TNF-α等可激活NF-κB,而活化的NF-κB進(jìn)一步引起TNF-α、IL-6、IL-1β等的大量釋放,形成正反饋,進(jìn)而引發(fā)持久的炎癥反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15,16]。本研究中,過(guò)量氟作用于LS8細(xì)胞12,24 h后,結(jié)果顯示過(guò)量氟可增加NF-κB mRNA表達(dá),提示NF-κB信號(hào)通路很可能參與了過(guò)量氟介導(dǎo)的LS8細(xì)胞炎性反應(yīng)過(guò)程。

p38信號(hào)通路屬于MAPK家族成員之一,被認(rèn)為是與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切的通路。磷酸化的P38可介導(dǎo)成骨細(xì)胞IL-1、TNF-α、IL-6等因子的產(chǎn)生,還可引起中性粒細(xì)胞活化[17]。本研究結(jié)果顯示過(guò)量氟可呈時(shí)間依賴性增加LS8細(xì)胞P38磷酸化表達(dá),提示p38信號(hào)通路很可能參與了過(guò)量氟介導(dǎo)的LS8細(xì)胞炎性反應(yīng)過(guò)程。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)觀察了過(guò)量氟對(duì)LS8細(xì)胞炎性因子的表達(dá)影響,發(fā)現(xiàn)過(guò)量氟可增加IL-1β、TNF-α、IL-6、NF-κB mRNA以及p38蛋白磷酸化表達(dá),提示過(guò)量氟可導(dǎo)致LS8細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生,NF-κB及p38信號(hào)通路很可能參與其中。然而,NF-κB及p38信號(hào)通路在過(guò)量氟誘發(fā)LS8細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程中的作用機(jī)制,尚需深入探究。