內質網應激參與尿酸誘導的大鼠腎小球系膜細胞表型轉化

李莎莎,李 露,吳 璞,郝亞寧

(1西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內科，西安 710077；2西安市第九醫(yī)院腎內科；3西安交通大學第一附屬醫(yī)院腎內科;*通訊作者,E-mail:haoynhaoyn@163.com)

尿酸(uric acid，UA)是人類嘌呤代謝的終產物，由于尿酸氧化酶在人類長期進化過程中發(fā)生基因突變不能將尿酸氧化為尿囊素，故人類嘌呤代謝的最終產物僅為尿酸，且主要經腎臟排泄[1]。因此研究高尿酸血癥與腎臟損害的關系具有至關重要的臨床和實際意義。近年來國內外大量研究[2]表明高尿酸與腎臟的關系不僅僅是引起腎小管-間質尿酸結晶形成、間質炎性細胞浸潤等慢性間質性腎炎的形態(tài)學變化，更重要的是尿酸可參與腎小球內“高壓力、高灌注、高濾過”，引起炎癥反應、血管病變及腎小球固有細胞損傷并由此誘發(fā)和加重腎臟損害。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)尿酸可誘導體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞增殖及表型轉化[3]。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是腎小球系膜細胞表型轉化的標志蛋白。腎小球系膜細胞發(fā)生表型轉化過程中，系膜細胞發(fā)生了形態(tài)學、細胞骨架結構和功能的改變?？偟陌ㄒ韵氯矫妫盒螒B(tài)學變化就是細胞從緊密融合的不規(guī)則形轉變?yōu)殚L梭形的典型肌成纖維細胞形態(tài)；肌纖維母細胞的典型標志α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)大量表達；分泌大量細胞因子如轉化生長因子(TGF-β1)等及細胞外基質成分如纖維連接蛋白(fibronectin)等。

內質網應激反應是細胞整合多條信號通路，調節(jié)生理或病理反應的重要途徑之一，可決定細胞增殖、分化、凋亡等命運[4]。故可能在尿酸引起系膜細胞表型轉化過程中起重要作用。內質網分子伴侶糖調節(jié)蛋白78(GRP78)作為多功能調節(jié)劑,當內質網處于穩(wěn)態(tài)時,GRP78能結合內質網上未折疊蛋白堆積的感受器蛋白的內質網內端，維持信號轉導因子的非活化狀態(tài)。蛋白質二硫鍵異構酶(protein disul-fide isomerase,PDI)是內質網中含量最豐富的蛋白質之一,它是促進蛋白質結構中二硫鍵形成的蛋白酶。當PDI減少時,錯誤折疊的蛋白質增多且細胞凋亡程序啟動,促進細胞死亡。

4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)是通過化學合成的,具伴侶活性的小分子質量脂肪酸,能穩(wěn)定蛋白構象,改善內質網折疊蛋白能力,減輕ERS反應的發(fā)生。故推測4-PBA可能對NAFLD具有潛在的保護作用。本研究動態(tài)觀察在高尿酸環(huán)境下，大鼠腎小球系膜細胞表型轉化情況和內質網應激發(fā)生情況,以期明確尿酸誘導大鼠腎小球系膜細胞發(fā)生表型轉化過程中內質網應激的作用并初步闡明其機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

大鼠腎小球系膜細胞(HBZY-1)購自中國典型物保藏中心，DMEM培養(yǎng)基，尿酸、4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)及毒胡蘿卜素(thapsigargin)購自美國Sigma公司，反轉錄試劑盒、PCR引物購自中國大連Takara寶生物工程有限公司,PCR擴增儀、凝膠成像分析儀均購自Bio-Rad公司。TECNAI G2 F30 S-Twin型透射電鏡購自荷蘭Philips-FEI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 大鼠腎小球系膜細胞(HBZY-1)貼壁培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據細胞狀態(tài)及生長速度決定換液時間，一般2-3 d更換一次培養(yǎng)基，待貼壁細胞長至80%-90%融合時，以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化傳代，選擇對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組 毒胡蘿卜素(thapsigargin)是一種內質網應激反應誘導劑，為驗證尿酸可誘導HBZY-1發(fā)生內質網應激反應，將細胞隨為：control組，thapsigargin(0.25 μmol/L)組，UA(0.2 mmol/L)組。為進一步檢測不同濃度組尿酸作用HBZY-1不同時間對內質網應激反應指標GRP78、PDI的影響，將細胞隨機分為不同濃度尿酸組(0.05，0.1，0.2，0.4 mmol/L)作用48 h；再應用尿酸(0.2 mmol/L)分別作用24，36，48 h。為檢測內質網應激反應抑制劑4-PBA的干預作用，將細胞隨機分為control組，control+4-PBA(0.25 μmol/L)組，UA(0.2 mmol/L)組，UA+4-PBA組(0.25 μmol/L 4-PBA預處理HBZY-1細胞6 h，加入0.2 mmol/L尿酸干預48 h)。

1.2.3 細胞一般形態(tài)觀察 分別在倒置顯微鏡及透射電鏡下分別觀察control組、control+4-PBA(0.25 μmol/L)組、UA(0.2 mmol/L)組和4-PBA+UA組細胞形態(tài)學及超微結構變化，并拍照采集圖片。

1.2.4 RT-PCR檢測GRP78、PDI 嚴格按RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒說明提取細胞總RNA并行定量及純度鑒定。逆轉錄為cDNA，PCR擴增反應體系25 μl，上下游引物均由大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)設計合成(見表1)，反應條件如下：預變性：94 ℃，30 s；變性：95 ℃，30 s；退火：55-65 ℃，30 s；延伸：72 ℃，30 s，共30個循環(huán)，每組重復6次，擴增結束后即可置于微量離心機上3 000 r/min，離心30 s，可用于瓊脂糖凝膠電泳。在Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)中拍照，并用自帶軟件對結果進行灰度分析，計算各項指標灰度值與內參β-actin的灰度值之比代表其相對強度。

1.2.5 Western Blot法檢測GRP78、PDI、α-SMA、TGF-β1及Fn 按試劑盒說明書提取細胞總蛋白并測定濃度。進行聚丙烯酰胺凝聚電泳，半干轉移法降蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉配制一抗，本實驗中α-SMA、TGF-β1、Fironectin、GRP78、PDI及β-actin一抗的稀釋度依次為1 ∶400，1 ∶250，1 ∶1 000，1 ∶400，1 ∶400，1 ∶400。4 ℃孵化1 h，TBST液洗滌3次，用5%脫脂奶粉配制二抗，按1 ∶15 000稀釋，加入二抗室溫孵化1 h后，通過Western blot曝光觀察，測定各蛋白表達量。

表1 RT-PCR各引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 尿酸可誘導大鼠腎小球系膜細胞發(fā)生內質網應激反應

Western blot印跡顯示，0.25 μmol/L毒胡蘿卜素及0.2 mmol/L尿酸作用于HBZY-1細胞48 h，均可誘導內質網應激反應標志性指標GRP78,PDI蛋白表達增加，且與control組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1)。

與control組相比，*P<0.05圖1 0.25 μmol/L毒胡蘿卜素與0.2 mmol/L尿酸對HBZY-1細胞GRP78、PDI蛋白表達的影響Figure 1 Effect of 0.25 μmol/L thapsigargin and 0.2 mmol/L UA on expression of GRP78 and PDI proteins in HBZY-1

RT-PCR結果顯示，除0.05 mmol/L及0.1 mmol/L組外，0.2 mmol/L及0.4 mmol/L組GRP78及PDI mRNA的表達與0 mmol/L比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖2)。

與0 mmol/L相比，*P<0.05圖2 不同濃度尿酸對HBZY-1細胞GRP78,PDI mRNA表達的影響Figure 2 Effect of uric acid on mRNA of GRP78 and PDI in HBZY-1 by RT-PCR

RT-PCR結果顯示，0.2 mmol/L尿酸作用于HBZY-1細胞24，36，48 h，各時間組GRP78及PDI mRNA的表達與0 h比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3)。

Western印跡結果顯示，0.2 mmol/L尿酸作用于HBZY-1細胞24，36，48 h，各時間點GRP78及PDI蛋白的表達與0 h比較均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖4)。

與0 h相比，*P<0.05圖3 0.2 mmol/L尿酸作用不同時間對HBZY-1細胞GRP78及PDI mRNA表達的影響Figure 3 Effect of 0.2 mmol/L uric acid for different time on mRNA of GRP78 and PDI in HBZY-1

與0 h相比，*P<0.05圖4 0.2 mmol/L尿酸作用不同時間對HBZY-1細胞GRP78及PDI蛋白表達的影響Figure 4 Effect of 0.2 mmol/L uric acid for different time on expression of GRP78 and PDI proteins in HBZY-1

2.2 尿酸對大鼠腎小球系膜細胞的形態(tài)學影響及4-PBA的干預作用

control組及4-PBA組HBZY-1細胞呈緊密的單層融合的三角形、不規(guī)則型貼壁生長,而UA組HBZY-1細胞體積增大,兩端突起呈長梭形,類似纖維細胞樣形態(tài)(見圖5)，而UA+4-PBA組HBZY-1細胞形態(tài)亦呈緊密的單層融合的三角形、不規(guī)則型貼壁生長。透射電鏡下control組及4-PBA組HBZY-1細胞微毛密長,而0.2 mmol/L UA組細胞表面微毛短縮,融合,數(shù)量減少,內質網明顯擴張，而UA+4-PBA組HBZY-1細胞微絨毛密長，內質網輕度擴張(見圖6)。

圖5 4-PBA對HBZY-1細胞形態(tài)的影響 (倒置顯微鏡，×100)Figure 5 Effect of 4-PBA on phenotypic change in HBZY-1 cells (inverted microscope, ×100)

圖6 4-PBA對HBZY-1細胞超微結構的影響 (透射電鏡,×20 000)Figure 6 4-PBA on ultrastructure changes in HBZY-1 (transmission electron microscope, ×20 000)

2.3 內質網應激反應相關指標GRP78、PDI在尿酸誘導的大鼠腎小球系膜細胞表型轉化中的變化及4-PBA的干預作用

Western印跡結果顯示，與control組比較，4-PBA組GRP78及PDI蛋白表達無明顯變化，而UA組GRP78及PDI蛋白的表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與UA組比較，UA+4-PBA組GRP78及PDI蛋白的表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖7)。

與control組相比，*P<0.05；與UA組相比，#P<0.05圖7 4-PBA對HBZY-1細胞內質網應激蛋白GRP78及PDI表達的影響Figure 7 Effects of 4-PBA on the expression of GRP78 and PDI proteins in HBZY-1

2.4 α-SMA、TGF-β1、Fn在尿酸誘導的大鼠腎小球系膜細胞表型轉化中的變化及4-PBA的干預作用

Western blot印跡結果顯示，與control組比較，4-PBA組α-SMA、TGF-β1、Fn蛋白表達無明顯變化，而UA組GRP78及PDI蛋白的表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與UA組比較，UA+4-PBA組α-SMA、TGF-β1、Fn蛋白的表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖8)。

3 討論

腎小球硬化是多種慢性腎臟疾病終末期的最后歸途，最終導致腎功能衰竭，對機體造成極大危害。大量研究表明，各種腎臟固有細胞包括系膜細胞、足細胞、近端腎小管上皮細胞在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中均可發(fā)生表型轉化，并由病變初期的受損靶細胞轉化而主動參與病變進程[5]。其中，腎小球系膜細胞表型轉化在腎小球病變從早期的炎癥反應向晚期的硬化發(fā)展過程中起重要作用。腎小球系膜細胞是腎臟的主要固有細胞之一，正常情況下，腎小球系膜細胞僅履行吞噬、維持細胞外基質正常代謝，通過收縮調節(jié)腎小球濾過率等功能[6]。但由于系膜細胞和毛細血管袢之間不存在基底膜，系膜細胞直接與毛細血管袢相鄰接，任何來自血流異常信號如高血糖[7]、高血脂[8]、缺血損傷、血流動力學改變、晚期糖基化終末產物(AGEs)堆積、系膜區(qū)免疫復合物沉積等多種病理因素損害情況下均可直接刺激系膜細胞，使之增殖、肥大，分泌大量細胞外基質并出現(xiàn)形態(tài)、結構、功能的改變，由靜止/成熟表型轉化為增殖/分泌表型，即轉分化具有肌成纖維細胞樣特性，重新表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，導致各種細胞因子如轉化生長因子β(TGF-β)、血小板衍化生長因子(PDGF)、結締組織生長因子(CTGF)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原等釋放，促進腎小球硬化[9]。

與control組相比，*P<0.05；與UA組相比，#P<0.05圖8 UA對HBZY-1細胞表型轉化蛋白α-SMA、TGF-β1及Fn表達的影響及4-PBA的干預作用Figure 8 Effects of UA and 4-PBA on the protein of α-SMA, TGF-β1 and Fn in HBZY-1

我們課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L以上的尿酸可誘導體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞形態(tài)從三角形、不規(guī)則形轉化為長梭形類似纖維細胞樣形態(tài)，且表型轉化特異性指標α-SMA mRNA及蛋白水平表達增強，致纖維化因子TGF-β1的mRNA和蛋白表達亦明顯上調，同時細胞外基質成分fibronectin的mRNA和蛋白表達也同時上調，均提示尿酸可誘導體外培養(yǎng)的系膜細胞從靜止/成熟型轉化為增殖/分泌型，與腎小球硬化硬化有關[10]。

內質網是細胞內膽固醇、類固醇等其他脂質生物合成的重要部位，同時也能合成多種分泌蛋白及結構蛋白，并且為蛋白質的正確折疊提供穩(wěn)定的內環(huán)境，同時也是鈣離子的儲存場所。正常情況下，內環(huán)境的穩(wěn)定是內質網發(fā)揮正常功能的基本條件。其主要由未折疊蛋白反應這一適應性的程序調控。研究發(fā)現(xiàn)內質網應激反應涉及到多種病理損傷機制，如脂質過度負荷、缺血、神經變性及功能紊亂、感染、藥物、毒素等均可擾亂內質網的穩(wěn)態(tài)，導致大量錯誤或未折疊蛋白在內質網聚集，通過激活下游包括PERK、ATF6、IRE1等信號通路，引起一系列的細胞反應[11]。內質網應激及其誘導的細胞凋亡參與了許多疾病的病理生理過程。近年來，國內外多項研究[12]表明內質網應激反應與腎臟疾病密切相關。

在本實驗中，與對照組比較，在一定時間及濃度范圍內，尿酸可誘導內質網應激反應內質網分子伴侶GRP78及PDImRNA及蛋白高表達，證實尿酸可誘導大鼠腎小球系膜細胞發(fā)生內質網應激反應。

尿酸可誘導大鼠腎小球系膜細胞從單層融合的三角形、不規(guī)則形態(tài)轉化為兩端突起呈長梭形,類似纖維細胞樣形態(tài)，超微結構可見尿素組系膜細胞微絨毛短小，內質網明顯擴張。尿酸也可誘導系膜細胞表型轉化特異性指標α-SMA、TGF-β1、FN mRNA及蛋白的表達，為了驗證高尿酸誘導腎小球系膜細胞表型轉化與內質網應激相關性，本研究應用內質網應激反應抑制劑進行干預。4-苯基丁酸(4-PBA)是一種具有分子伴侶作用的短鏈芳香族脂肪酸,它可以逆轉蛋白質分子的錯誤移位和錯誤聚集并幫助其建立正常的空間結構,從而具有抗內質網應激和誘導分化的作用[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)，應用4-PBA干預大鼠腎小球系膜細胞，不僅可明顯減輕尿酸誘導的GRP78和PDI的表達，即減輕內質網應激，而且顯著抑制大鼠腎小球系膜細胞表型轉化特異性指標α-SMA、TGF-β1、FN mRNA及蛋白的表達，提示高尿酸條件下內質網應激反應參與體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞表型轉化。

綜上，本研究表明內質網應激反應參與尿酸誘導的大鼠腎小球系膜細胞表型轉化，其抑制劑4-PBA可抑制該過程，同時為高尿酸腎病發(fā)病機制提供新的理論依據。但尿酸性腎病發(fā)病機制十分復雜，內質網應激反應相關下游信號通路是否參與其中，還需進一步探索及補充。