多糖的結(jié)構(gòu)解析方法研究進(jìn)展

李雪琴,李 科,3*,秦雪梅,李震宇,范信暉,崔連杰

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2山西大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3中國科學(xué)院過程工程研究所;*通訊作者,E-mail:like@sxu.edu.cn)

中醫(yī)藥是我國的國粹,是中國人民幾千年來與疾病作斗爭的經(jīng)驗(yàn)總結(jié),新冠肺炎疫情發(fā)生以來,中西醫(yī)結(jié)合的救治方案在全程中均發(fā)揮不可替代的作用。中藥成分復(fù)雜,多糖是中藥的活性成分之一,研究表明,多糖是柴胡生物活性的基礎(chǔ)[1],黃芪多糖在抗腫瘤[2]、抗衰老[3]、抗氧化[4]等方面發(fā)揮著重要作用,大棗多糖具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤等多種藥理活性,是大棗中重要的活性成分[5]。與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相比,糖組學(xué)的研究進(jìn)展較為緩慢,其主要發(fā)展瓶頸在于糖的樹形結(jié)構(gòu)增加了糖結(jié)構(gòu)解析的難度[6],尤其是多糖的分支結(jié)構(gòu)尚未有效的方法準(zhǔn)確測定,因此多糖的構(gòu)效關(guān)系并不明確。研究具有活性的中藥多糖結(jié)構(gòu),以便更好地開發(fā)利用中藥資源是亟待開展的重要工作。

目前缺乏可以對大部分多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析的普遍適用的方法,因此很難實(shí)現(xiàn)對多糖結(jié)構(gòu)的快速準(zhǔn)確解析,從而制約了對多糖進(jìn)一步深入的研究。本文重點(diǎn)總結(jié)近年來科研工作者對多糖結(jié)構(gòu)解析的方法,并從多糖純度鑒定,分子量、單糖組成、單糖連接順序及糖苷鍵構(gòu)型的鑒定,多糖構(gòu)象研究等方面對多糖結(jié)構(gòu)解析的手段進(jìn)行總結(jié)歸納,介紹不同解析方法的特點(diǎn),以期為多糖結(jié)構(gòu)的快速準(zhǔn)確解析提供參考。

1 多糖的純度鑒定

多糖是大分子化合物,其純度是指在一定分子量范圍的均一組分,被純化的多糖,其微觀也不均一,它代表相似鏈長的平均分布,因此不能用小分子化合物的純度標(biāo)準(zhǔn)來衡量。通常直接提取得到的多糖分子量大,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析前要將蛋白等雜質(zhì)除去,將多糖分級純化,再進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。多糖的純度分析是對其精細(xì)結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)分析的前提,測定多糖純度的方法有比旋光度法、紫外分光光度法、高效凝膠滲透色譜法、電泳法、薄層色譜法等,常見多糖純度鑒定方法見表1。

表1 多糖純度鑒定方法的比較

景永帥等[7]采用紫外-可見光譜掃描法、比旋光度法及凝膠滲透色譜法3種方法來驗(yàn)證遠(yuǎn)志多糖的純度,紫外-可見光譜掃描結(jié)果顯示,該遠(yuǎn)志多糖260 nm及280 nm處無明顯特征吸收,表明不含核酸和蛋白結(jié)構(gòu),用比旋光度法進(jìn)行純度驗(yàn)證,結(jié)果顯示在3種體積分?jǐn)?shù)的乙醇下,比旋光度基本相同,表明其為相對均一的多糖,此外用凝膠柱層析進(jìn)一步驗(yàn)證該遠(yuǎn)志多糖純度,獲得單一、對稱的洗脫峰,表明該遠(yuǎn)志多糖均一性良好。Cheong等[8]為了消除蛋白質(zhì)對人參多糖研究的干擾,將樣品溶液在280 nm處進(jìn)行紫外檢測,結(jié)果表明,人參多糖中幾乎沒有蛋白質(zhì)。Huo等[9]采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)對白花蛇舌草多糖組分HD-PS-1和HD-PS-2進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,組分HD-PS-1和HD-PS-2的色譜圖均顯示為單一對稱峰,說明這2種組分是均一多糖。Sun等[10]在高效凝膠滲透色譜(HPGPC)圖中發(fā)現(xiàn),黨參多糖RCAP-1和RCAP-2為單個對稱峰,表明它們分子量分布較為均一。

2 多糖的分子量測定

多糖作為生物大分子,在測定其分子量時,往往是平均值。多糖的分子量分布是指多糖中各種不同的分子量組分在總量中所占的分量,一般用重均分子量與數(shù)均分子量的比值,即多分散系數(shù)α表示(α=Mw/Mn)[11],α值愈大,說明分子量分布愈寬,當(dāng)α=1時,表明是分子量均一體系。其中,重均分子量是按分子重量統(tǒng)計平均的分子量,數(shù)均分子量是以分子數(shù)統(tǒng)計平均,目前常用的測定多糖分子量的方法有高效凝膠滲透色譜法、多角度激光散射法及質(zhì)譜法等,其特點(diǎn)見表2。

表2 多糖分子量測定方法的比較

Guo等[14]以右旋糖酐作校準(zhǔn)曲線,采用HPGPC法測得喇叭菌多糖CCP的的平均分子量為1.97×103kD。Xia等[15]采用高效凝膠色譜-多角度激光散射法(HPGPC-MALLS)測定得刺五加多糖ASP-B-2和ASP-B-3的分子量分別為5.32 kD和30.51 kD,且ASP-B-2和ASP-B-3分子量分布系數(shù)(Mw/Mn)分別為1.180和2.295,表明ASP-B-2和ASP-B-3是相對均一的多糖。Zhang等[11]采用高效凝膠色譜-示差折光-多角度激光散射法HPGPC-RI-MALLS測定紫花苜宿多糖,結(jié)果表明其Mw和Mn分別為3.30×106g/mol和4.06×105g/mol,多分散系數(shù)Mw/Mn為8.14,表明該多糖分布不均一,并且測得其均方根旋轉(zhuǎn)半徑(數(shù)均半徑Rn=53.4,重均半徑Rw=51.8,Z均半徑Rz=59.0)。黃雪松等[16]利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)方法的測定大蒜多糖的分子量,結(jié)果表明,大蒜多糖GPⅡ分子量分布在1 010-2 811 u之間,聚合度為6-17,說明純大蒜多糖樣品是低聚果糖與果聚糖的混合物。目前最常用的分子量測定方法為高效凝膠滲透色譜法,它通過比較多糖樣品的保留時間和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來確定其分子量,但嚴(yán)重依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),不同標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),得出的結(jié)果不同;其次,它依賴于色譜柱,不同色譜柱得到的分子量結(jié)果也不完全相同。因此,需要綜合各種方法,選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及色譜柱,使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

3 多糖的單糖組成分析

通常需要將多糖完全水解成單糖后再進(jìn)行單糖組成分析,常用的水解方法有酶解、酸水解、甲醇解、乙酰解、氧化水解等,其中三氟乙酸水解應(yīng)用最廣泛,對糖殘基破壞小,三氟乙酸可減壓蒸餾去除,后處理方便。某些酶可以作用于多糖的特定糖苷鍵從而使其斷裂。目前單糖組成的分析方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、高效陰離子交換色譜安培檢測法、薄層色譜法以及毛細(xì)管電泳法等。

3.1 氣相色譜法(GC)

GC法主要將多糖經(jīng)完全水解后得到單糖的采用衍生試劑進(jìn)行化學(xué)修飾,對得到的易揮發(fā)且對熱穩(wěn)定的衍生物進(jìn)行氣相色譜分析,通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較,即可進(jìn)行定性定量分析。常見的單糖衍生化方法見表3。

Sun等[10]將黨參多糖用TFA完全酸水解之后,糖醇乙酸酯衍生后用GC法分析得,該黨參多糖由阿拉伯糖和半乳糖組成。梁軍等[19]將麻黃多糖樣品經(jīng)三甲基硅醚衍生化,采用氣相色譜法測定麻黃根多糖的單糖組成,結(jié)果表明麻黃根多糖中主要含阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醛酸,其摩爾比為7.59 ∶5.93 ∶9.94,還有少量的半乳糖、葡萄糖、甘露糖。Chen等[20]采用氣相色譜對糖腈乙酸酯衍生后的黑木耳多糖APP3a的進(jìn)行單糖組成分析,結(jié)果表明,APP3a由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成,其摩爾比為1 ∶1.33 ∶1.06 ∶1.23。張培等[17]采用糖腈乙酸酯衍生化法結(jié)合氣相色譜法測定黨參多糖中醛糖的含量;同時采用糖肟三甲基硅醚衍生化法利用GC-MS對黨參多糖中果糖的含量進(jìn)行測定,結(jié)果表明黨參多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸及果糖組成。

表3 常見的單糖衍生化方法

3.2 柱前衍生化-高效液相色譜法

由于絕大多數(shù)糖類本身不含有發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán),沒有紫外或熒光吸收,用常規(guī)的紫外或熒光檢測器無法直接檢測,通常將多糖水解產(chǎn)生的單糖用衍生化試劑衍生后再利用色譜法檢測,其中1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP)應(yīng)用最為廣泛,不僅給糖鏈帶上生色基團(tuán),也使其帶上疏水基團(tuán),由于糖鏈的極性降低,在反相色譜柱上可以實(shí)現(xiàn)較好的分離,適合復(fù)雜樣品的單糖組成分析[21],石麗霞等[22]采用PMP柱前衍生化-高效液相色譜法建立不同柴胡單糖特征圖譜,確定了4種柴胡均由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成。杜澤飛等[23]采用柱前衍生化結(jié)合高效液相色譜法(PMP-HPLC)測得黃精多糖含有D-半乳糖醛酸、D-鹽酸氨基葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-木糖。Li等[24]采用PMP柱前衍生化-高效液相色譜法對黃芪多糖3個不同分子量的組分進(jìn)行單糖組成分析,結(jié)果顯示3個組分均由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸組成。

3.3 高效陰離子交換色譜-脈沖安培法(HPAEC-PAD)

HPAEC是利用多糖分子電化學(xué)活潑性,糖分子在強(qiáng)堿性溶液洗脫過程中,羥基轉(zhuǎn)變成氧負(fù)離子,從而使糖以陰離子的形式作用于色譜。不同糖分子中羥基的pKa(電離常數(shù))有細(xì)微的差別,這種差別使得氧負(fù)離子與陰離子交換樹脂的相互作用產(chǎn)生的差異表現(xiàn)在HPAEC中的不同洗脫位置。果糖與葡萄糖是差向異構(gòu)體,在堿性條件下發(fā)生酮式-烯醇式互變,導(dǎo)致對單糖進(jìn)行柱前衍生化時,果糖會轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?從而干擾這兩種糖的定量與定性測定,HPAEC-PAD具有避免因糖衍生化產(chǎn)生的異構(gòu)體的優(yōu)勢。柴銀等[25]利用離子色譜-脈沖安培法(HPAEC-PAD)實(shí)現(xiàn)牛蒡多糖中核糖、巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸的定性定量分析。

3.4 薄層色譜法(TLC)

薄層色譜法(TLC)是一種微量而快速的分析方法。根據(jù)各種單糖在展開劑與吸附劑中分配與吸附力不同,可將各種單糖或寡糖分開,之后采用不同的顯色劑進(jìn)行顯色,達(dá)到檢測目的。孟燕等[26]采用完全酸水解法聯(lián)合薄層色譜(TLC)法對黨參多糖中組分CP1-2-1、CP3-1-1進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,組分CP1-2-1中只含有果糖,是一種單一組成的多糖;而組分CP3-1-1則由阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖以及半乳糖醛酸等單糖組成,是一種酸性雜多糖。

3.5 高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)

高效毛細(xì)管電泳多用于單糖和寡糖的分析,分析多糖降解后得到的寡糖常用硼酸鹽和磷酸鹽為絡(luò)合劑和緩沖液,使糖類成為帶電絡(luò)合物,且作用位點(diǎn)只是糖鏈的外圍糖基,絡(luò)合物只帶一個電荷,便于樣品組分的分離分析。陳蕾等[27]將洋甘菊多糖經(jīng)三氟乙酸水解成單糖后用PMP衍生化,采用HPCE測得洋甘菊多糖中甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖的物質(zhì)的量之比為1 ∶1.53 ∶3.10 ∶4.12 ∶7.28 ∶2.27 ∶0.90。菅麗君等[28]將刺糖多糖水解成單糖,PMP衍生化后采用高效毛細(xì)管電泳法分離測定各單糖,結(jié)果表明刺糖多糖中阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的摩爾比為2.80 ∶38.61 ∶5.28 ∶3.76 ∶1.91 ∶3.82 ∶2.45,且刺糖多糖中葡萄糖的含量為35.65%。以上不同單糖組成的研究方法比較見表4。

表4 不同單糖組成研究方法的比較

綜上,測定多糖的單糖組成需要綜合考慮多種方法的優(yōu)缺點(diǎn)與適用,克服單一分析方法的缺點(diǎn),相互補(bǔ)充,以準(zhǔn)確分析其單糖組成。

4 多糖的單糖連接方式及構(gòu)象分析

4.1 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)

得知多糖的單糖組成后,還要確定多糖各種單糖殘基的連接方式以及不同連接類型的單糖比例,甲基化分析是必不可少的方法。對于酸性糖,需在甲基化反應(yīng)前先對其進(jìn)行還原。先將糖中各種單糖殘基的游離羥基全部甲基化,進(jìn)而將糖中的糖苷鍵水解,水解后得到的化合物,其羥基所在的位置,即為原來糖殘基的連接點(diǎn)。將這些部分甲基化的單糖還原及乙?；?通過GC-MS分析,可以計算出不同連接類型單糖的比例,但該方法無法判斷糖鏈的連接順序。Zhang等[31]采用GC-MS對甲基化后的何首烏多糖WPMP-2進(jìn)行分析,結(jié)果表明,有6個甲基化糖苷殘基,即端基阿拉伯糖殘基,(1→2)-連接鼠李糖殘基,(1→2,4)-連接鼠李糖殘基,(1→5)-連接阿拉伯糖殘基,(1→3,5)-連接阿拉伯糖殘基和(1→4)-連接半乳糖殘基,比例分別為0.82 ∶2.33 ∶0.81 ∶3.86 ∶1.00 ∶2.07。此外,王穎等[32]對生曬山參根糖類化合物(PGO)的糖醇乙酸酯衍生物進(jìn)行GC-MS測定,測定結(jié)果為PGO主鏈?zhǔn)怯?1→4)連接的吡喃葡萄糖殘基構(gòu)成。

4.2 高碘酸氧化和Smih降解

由于高碘酸可以選擇性斷裂糖分子中的連二羥基或連三羥基,生成相應(yīng)的多糖醛、甲醛或甲酸,且反應(yīng)能定量進(jìn)行,可以根據(jù)高碘酸的消耗量及甲酸的釋放量來判斷糖苷鍵的位置,直鏈多糖的聚合度,支鏈多糖的分支數(shù)目等。對于化合物中的1,2或1,4連接鍵,平均每個糖基消耗1分子高碘酸,且無甲酸釋放;1,3連接鍵不被高碘酸氧化;1,6位鍵合的糖基或非還原末端糖基經(jīng)高碘酸氧化,消耗2分子高碘酸同時釋放1分子甲酸。一般Smih降解反應(yīng)分為三步,首先用高碘酸將糖氧化開裂為二元醛,然后將二元醛用硼氫化物還原成醇后用酸進(jìn)行水解,1,2位糖苷鍵產(chǎn)生甘油和甘油醛,1,3位糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖,1,4位糖苷鍵產(chǎn)生赤蘚醇和羥基乙醛,1,6位糖苷鍵產(chǎn)生甘油和羥基乙醛,非還原末端糖基的降解產(chǎn)物亦為甘油。由降解的產(chǎn)物可以推斷糖苷鍵的位置。Guo等[14]通過對喇叭菌多糖(CCP)的高碘酸氧化和Smih降解產(chǎn)物分析,結(jié)果顯示CCP中分別存在(1→6)-,(1→2,6)-,(1→4)-和(1→3,6)-連接鍵。Xia等[33]在刺五加葉中提取的多糖的Smih降解產(chǎn)物檢測到未被氧化的阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖,表明阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖中具有(1→3)-糖苷鍵,由于有大量的丙三醇,少量乙二醇和丁四醇,表明可能包含(1→2)-、(1→4)-、(1→6)-糖苷鍵。

4.3 質(zhì)譜法

一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以檢測到糖分子的質(zhì)量數(shù),二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以簡單地判斷確定糖鏈的線性結(jié)構(gòu),而通過分析單糖與單糖之間的裂解信息,可以分析單糖的環(huán)內(nèi)裂解信息,確定糖鏈序列,從而確定糖鏈的分支情況。對于多糖結(jié)構(gòu)的完全解析,需要采用多級質(zhì)譜,在多級質(zhì)譜模式下,可以選擇特定的母離子,使用氣體進(jìn)行碰撞,產(chǎn)生子離子碎片,子離子碎片越小,其包含的結(jié)構(gòu)信息越少,更有利于確定其準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)。在確定碎片結(jié)構(gòu)后,將所有的碎片信息重組,可以獲得完整的糖鏈結(jié)構(gòu)信息。質(zhì)譜法靈敏度高,快速,結(jié)合計算軟件可降低質(zhì)譜結(jié)果分析時間,提高糖鏈結(jié)構(gòu)解析的效率[34],整合質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及如何選擇特定的母離子進(jìn)行分析是質(zhì)譜解析流程中最具有挑戰(zhàn)的環(huán)節(jié)[35]。

郎銀芝等[36]采用ESI-MSn技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對分離制備得到的8個唾液酸化人乳寡糖單體的結(jié)構(gòu)序列分析。Zhang等[11]使用EI-MS對苜蓿多糖APS進(jìn)行糖苷鍵連接分析,結(jié)果表明APS主要由7個不同的糖殘基組成,其中半乳糖和葡萄糖為非還原末端,分別占總含量的4.02%和10.28%,此外1,5-Araf,1,4-GalA,1,4-Glc,1,6-Gal和1,3,4-GalA的占比分別為10.30%,52.29%,17.02%,3.52%和2.57%。Juvonen等[37]采用直接輸注ESI-MSn法分析阿拉伯木聚糖[(A)XOS]的糖鏈斷裂方式,根據(jù)(A)XOS每根鍵斷裂產(chǎn)生的交叉環(huán)片段的存在或缺失來確定其連接位置,結(jié)果表明(A)XOS含有(1→4)-連接鍵,(1→2)-連接鍵及(1→3)-連接鍵。Xia等[33]對刺五加葉中提取的多糖進(jìn)行部分酸水解后采用超高效液相色譜-電噴霧負(fù)離子化-質(zhì)譜(HILIC-UPLC-ESI-MS)分析,分析結(jié)果顯示該多糖主鏈由重復(fù)的→4-GalA-1→單元和重復(fù)的→4-GalA-1→2-Rha-1→單元構(gòu)成。

4.4 核磁共振光譜法

核磁共振光譜主要解決多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵的構(gòu)型和重復(fù)結(jié)構(gòu)中單糖的數(shù)目。多糖的分子量越大,NMR譜圖中峰的重疊越嚴(yán)重,也就越難解析,如果多糖的分子量超過2萬,則有可能得不到十分清晰的圖譜,所以分子量大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖,最好將多糖部分酸水解之后再進(jìn)行NMR分析[38]。1H NMR主要用來分析多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵的構(gòu)型,13C NMR化學(xué)位移范圍寬廣,信號清晰,不僅來確定多糖殘基中取代位置和分支點(diǎn),而且可確認(rèn)各種碳核以及分辨分子的構(gòu)型。王婭等[39]采用二維核磁共振波譜(2D-NMR)對何首烏多糖(PMT)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,結(jié)果表明,PMT為葡聚糖,1H-NMR中異頭H的化學(xué)位移為δ5.38,13C-NMR中異頭C的化學(xué)位移為δ100.32,表明糖環(huán)為α構(gòu)型,結(jié)果顯示PMT是由1→4連接的α-D-葡萄糖構(gòu)成。Sun等[14]采用核磁共振光譜法通過氫碳?xì)w屬分析結(jié)果顯示,喇叭菌多糖由(1→3)連接的β-D-Manp-(1→6)連接α-D-Galp單元作為主干,在O-6部分被(1→4)連接的α-D-Xylp-α-D-Manp和β-D-Glup作為支鏈取代。

4.5 紅外光譜法

紅外光譜對分子結(jié)構(gòu)中官能團(tuán)有高度特征性,紅外光譜圖上每一個吸收峰,都對應(yīng)于分子中原子或官能團(tuán)振動的情況,每一種化合物都具有其特殊的紅外光譜,紅外光譜廣泛應(yīng)用于多糖的結(jié)構(gòu)表征。在糖類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究中,紅外光譜還可用于識別呋喃糖和吡喃糖,吡喃糖環(huán)的振動在917 cm-1和770 cm-1,呋喃糖環(huán)則在924 cm-1和799 cm-1處,此外,α/β構(gòu)型可以通過判斷低頻區(qū)域的特征吸收來確定,α構(gòu)型通常在844 cm-1處,β構(gòu)型通常在891 cm-1處。Liu等[40]采用FI-IR分析枸杞多糖(LBPs)的結(jié)構(gòu)特征,結(jié)果表明在3 359.9 cm-1處的強(qiáng)吸收帶為-OH的特征峰,在2 933.6 cm-1處的弱帶為-CH2-的C-H伸縮振動;在1 749.4 cm-1是酯基伸縮振動,在1 610.5 cm-1處的吸收帶是-CONH-的N-H彎曲振動,表明LBPs是多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合物。在1 417.6 cm-1和1 253.7 cm-1處的兩個帶分別對應(yīng)于-COOH的C-O伸縮振動和-OH彎曲振動,在1 330.8 cm-1處的帶可能由于-CH3的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動,在1 253.7 cm-1處的吸收帶顯示C-O-C的非對稱伸縮振動,從1 141.8 cm-1到1 018.4 cm-1的吸收帶是C-O-C和C-O-H的振動,在916.2,831.3,767.6 cm-1處的吸收帶表明存在吡喃糖環(huán)。

5 多糖的高級結(jié)構(gòu)研究

多糖的高級結(jié)構(gòu)即二、三、四級結(jié)構(gòu),直接決定了多糖的生物活性。高分子鏈構(gòu)象是指高聚物主鏈由于C-C單鍵內(nèi)旋轉(zhuǎn)造成高分子在空間的各種形態(tài)。由于單糖組成以及糖苷鍵連接方式不同,多糖分子在溶液中具有多種形態(tài),即多糖的構(gòu)象。多糖的高級結(jié)構(gòu)與構(gòu)象并沒有嚴(yán)格的區(qū)別[41]。多糖的高級結(jié)構(gòu)研究主要有多糖的各種分子量及其分布,鏈的尺寸及狀態(tài),主鏈和側(cè)鏈的相互作用,以及多糖分子的形貌特征等。測定方法有:剛果紅實(shí)驗(yàn)、黏度法、靜態(tài)和動態(tài)光散射、X-射線衍射法(XRD)、旋光度(ORD)、圓二色譜(CD)、差示掃描量熱法(DSC)、原子力顯微鏡(AFM)及掃描隧道顯微鏡(STM)等,其特點(diǎn)見表5。

表5 不同多糖高級結(jié)構(gòu)研究方法的比較

Li等[47]通過剛果紅實(shí)驗(yàn)表明亞側(cè)耳多糖具有與剛果紅形成絡(luò)合物的螺旋結(jié)構(gòu),并具有與剛果紅發(fā)生特征反應(yīng)的三股螺旋結(jié)構(gòu);X射線衍射結(jié)果表明亞側(cè)耳多糖是無定形或半結(jié)晶聚合物;掃描電子顯微照片(SEM)結(jié)果顯示,亞側(cè)耳多糖表面較疏松,由許多小顆粒組成。Tang等[48]用掃描電子顯微鏡分析表明,所有紫甘薯多糖表面為微絨毛狀。張紅運(yùn)等[49]用原子力顯微鏡(AFM)對大豆種皮多糖微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,結(jié)果表明多糖鏈在某些區(qū)域的外圍呈分散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);而在區(qū)域中心,由于多糖鏈分散性差導(dǎo)致其呈嚴(yán)重的重疊核狀體結(jié)構(gòu)。Zeng等[50]用凝膠滲透色譜(SEC)、多角度激光光散射檢測器(MALLS)與示差折光檢測器(RI)串聯(lián)即SEC-MALLS-RI法測得的橄欖多糖CPS1的分子量大于CPS2和CPS3,并且CPS的分子量和半徑無正相關(guān),糖鏈構(gòu)象分析結(jié)果表明,CPS1和CPS2是典型的高度分支多糖,而CPS3在水中呈球狀。Guo等[14]用圓二色譜法(CD)分析了喇叭菌多糖CCP,CCP與剛果紅絡(luò)合物,CCP在197 nm處有一個正的Cotton峰,在215 nm處有一個負(fù)的Cotton峰。當(dāng)加入剛果紅時,Cotton峰沒有明顯變化;然而,當(dāng)加入NaOH時,出現(xiàn)了幾個CD信號,表明CCP存在三螺旋構(gòu)象。

多糖的高級結(jié)構(gòu)研究方法有很多,隨著分析技術(shù)的發(fā)展,計算機(jī)預(yù)測與多種分析方法的結(jié)合將為多糖高級結(jié)構(gòu)解析提供更準(zhǔn)確糖結(jié)構(gòu),是一種更簡便的新策略。但是因?yàn)槎嗵堑膹?fù)雜性,至今還沒有一種有效的可以研究多糖全結(jié)構(gòu)的方法,將不同的研究方法聯(lián)用是研究多糖高級結(jié)構(gòu)的發(fā)展方向。

6 結(jié)語

本文對近年來多糖的結(jié)構(gòu)解析方法進(jìn)行綜述,各種分析方法各有其優(yōu)勢與不足,有時采用一種方法往往達(dá)不到理想結(jié)果,多種方法聯(lián)用才能夠彌補(bǔ)各種方法的不足。在選擇分析方法時,應(yīng)考慮樣品本身的物理化學(xué)性質(zhì),實(shí)驗(yàn)條件與方法來建立樣品分析的方法,使多糖的結(jié)構(gòu)解析結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠,從而為中藥中糖類成分的質(zhì)量控制以及中藥多糖藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。