膽汁反流性胃炎與腸化生的關(guān)系及其分子機制

蘇保偉,林 強,王景杰

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710038;*通訊作者,E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn)

膽汁反流性胃炎是由于過量的含膽汁的十二指腸液反流入胃損傷胃黏膜,引起胃黏膜炎癥性改變的一種臨床疾病。膽汁反流現(xiàn)象是Beaumout[1]于1833年首次發(fā)現(xiàn),隨著胃腸道手術(shù)的日益增加及消化內(nèi)鏡診療技術(shù)的日益成熟,BRG發(fā)病率及檢出率隨之升高。有研究表明膽汁反流性胃炎在接受胃鏡檢查的患者中檢出率高達(dá)11.3%[2]。胃黏膜腸上皮化生(intestinal metaplasia,IM)是指由于胃黏膜在長期慢性炎癥影響下導(dǎo)致正常胃黏膜上皮細(xì)胞被腸上皮細(xì)胞所替代,進(jìn)而出現(xiàn)杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞及吸收上皮細(xì)胞的一種病理改變[3]。近年來的研究已證實長期的膽汁酸暴露可增加正常胃黏膜向腸上皮化生轉(zhuǎn)變的風(fēng)險,尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(caudal type homeobox,CDX2)、性別決定區(qū)Y框蛋白2(SRY-related HMG box-2,SOX2)、G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5(G protein-coupled bile acid receptor 5,TGR5)在膽汁酸誘導(dǎo)的腸化生中起重要作用[4-6]。本研究擬探討膽汁反流嚴(yán)重程度對腸化生發(fā)生率及腸化生病理類型的影響,同時通過檢測膽汁反流性胃炎伴腸化生患者CDX2、SOX2和TGR5表達(dá)的變化,旨在探討膽汁反流性胃炎參與腸化生的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2019年10月至2020年10月在空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科內(nèi)鏡中心診斷為膽汁反流性胃炎的350例患者作為病例組,包括輕度膽汁反流(膽汁反流Ⅰ度+Ⅱ度)患者215例和重度膽汁反流(膽汁反流Ⅲ度)患者135例,其中輕度患者中確診腸化生34例(膽汁反流Ⅰ度患者中確診腸化生11例,膽汁反流Ⅱ度確診腸化生23例),重度組患者中確診腸化生37例。隨機選取同期接受胃鏡檢查診斷為慢性非萎縮性胃炎的30例患者作為對照組。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批,批件號:第202007-01號。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡18-70歲;②經(jīng)胃鏡下診斷為膽汁反流性胃炎患者;③簽署知情同意書并同意接受胃黏膜活檢。排除標(biāo)準(zhǔn):①胃鏡檢查合并有胃食管反流病、胃癌、胃潰瘍、胃出血等器質(zhì)性疾病者;②合并膽道梗阻等占位性疾病;③合并嚴(yán)重心腦血管、肝腎疾病不適宜接受胃鏡檢查者。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 膽汁反流性胃炎診斷 將胃鏡插至胃內(nèi)靜止不動1 min以上,可見膽汁由十二指腸經(jīng)幽門口反流入胃;在被檢查者無明顯惡心的情況下見黏液湖有黃染或胃黏膜有膽汁斑附著,胃黏膜紅白相間,充血腫脹或糜爛[7]。

1.3.2 膽汁反流性胃炎嚴(yán)重程度分級 Ⅰ度膽汁反流，胃黏膜有少量膽汁附著，或潴留液呈淡黃色；Ⅱ度膽汁反流，胃黏膜有較深膽汁附著，或潴留液呈深黃色；Ⅲ度膽汁反流，大量深黃、深綠色的潴留液，或大量黃色泡沫從有門口溢出[8]。

1.3.3 腸化生診斷 對胃鏡下經(jīng)窄帶成像內(nèi)鏡(NBI)及放大內(nèi)鏡(ME)疑診腸上皮化生的患者于疑診部位取胃黏膜活組織送病理檢查確診有無腸化生[9]。

1.4 試驗方法

1.4.1 試劑 鼠抗人CDX2單克隆抗體、兔抗人SOX2單克隆抗體均購自武漢賽維爾公司,兔抗人TGR5單克隆抗體購自Abcam公司。超敏SP免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色劑購自DAKO公司。

1.4.2 病理學(xué)檢測及結(jié)果判讀 首先通過HE染色進(jìn)一步明確活檢標(biāo)本有無腸化生。對確診腸化生的標(biāo)本進(jìn)一步行AB-PAS染色,根據(jù)1998年P(guān)odova會議共識將腸化生分為完全型腸化生及不完全型腸化生兩種病理類型。同時對確診腸化生的標(biāo)本進(jìn)一步采用超敏SP法,測定CDX2、SOX2、TGR5的表達(dá)情況。結(jié)果采用半定量計分方法:隨機選取5個高倍鏡視野計數(shù),根據(jù)細(xì)胞染色強度和染色細(xì)胞所占比例兩者乘積進(jìn)行結(jié)果判定。染色強度按下列標(biāo)準(zhǔn)評定計分:0分為不著色;1分為淺黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色。染色的陽性細(xì)胞數(shù)所占比例按下列標(biāo)準(zhǔn)評定計分:陽性細(xì)胞<5%為0分;陽性細(xì)胞占5%-25%為1分;陽性細(xì)胞占26%-50%為2分;陽性細(xì)胞>50%為3分。細(xì)胞染色強度和染色比例兩者乘積,結(jié)果分為:0-5分為低表達(dá);>5分為高表達(dá)[10]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件,各組間腸化生發(fā)生率及CDX2、SOX2、TGR5的表達(dá)率的比較均采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽汁反流嚴(yán)重程度與腸化生發(fā)生率相關(guān)性分析

輕度和重度膽汁反流患者間腸化生發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。與輕度膽汁反流組(膽汁反流Ⅰ度+Ⅱ度)相比，重度膽汁反流組(膽汁反流Ⅲ度)腸化生發(fā)生率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。膽汁反流及腸化生胃鏡下表現(xiàn)見圖1。

2.2 膽汁反流嚴(yán)重程度與腸化生病理類型的相關(guān)性分析

與輕度膽汁反流組相比,重度膽汁反流組不完全型腸化生的發(fā)生率顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。腸化生的病理表現(xiàn)見圖2。

表2 不同膽汁反流程度間腸化生病理類型比較 例(%)

A.慢性非萎縮性胃炎胃黏膜組織(HE,×400);B.腸化生胃黏膜組織(HE,×400);C.完全型腸化生(AB-PAS,×400);D.不完全型腸化生(AB-PAS,×400)圖2 慢性非萎縮性胃炎及腸化生胃黏膜的病理表現(xiàn)Figure 2 Pathological features of gastric mucosa in chronic non-atrophic gastritis and intestinal metaplasia

2.3 CDX2、SOX2、TGR5在不同分組間的表達(dá)

將71例膽汁反流型胃炎伴腸化生的患者作為病例組,另選取胃鏡下胃黏膜表現(xiàn)為慢性非萎縮性胃炎的患者30例為對照組,比較兩組間和不同膽汁反流程度組間CDX2、SOX2和TGR5的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,CDX2和TGR5在膽汁反流性胃炎伴腸化生組中的高表達(dá)率顯著高于慢性非萎縮性胃炎組,而SOX2在膽汁反流性胃炎伴腸化生組中的高表達(dá)率顯著低于慢性非萎縮性胃炎組,兩組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表3)。同時,CDX2和TGR5在重度膽汁反流組中的高表達(dá)率顯著高于輕度膽汁反流組,而重度膽汁反流組SOX2的高表達(dá)率顯著低于輕度膽汁反流組(P<0.05,見表4)。CDX2、SOX2和TGR5在慢性非萎縮性胃炎及腸化生患者中的病理表現(xiàn)見圖3。

表3 CDX2、SOX2、TGR5在病例組及對照組的表達(dá)比較 例(%)

表4 CDX2、SOX2和TGR5在不同膽汁反流程度組間的表達(dá)比較 例(%)

A.CDX2在慢性非萎縮性胃炎;B.CDX2在膽汁反流伴腸化生;C.SOX2在慢性非萎縮性胃炎;D.SOX2在膽汁反流伴腸化生;E.TGR5在慢性非萎縮性胃炎;F.TGR5在膽汁反流伴腸化生圖3 CDX2、SOX2、TGR5在慢性非萎縮性胃炎及腸化生中的病理表現(xiàn) (SP法,×400)Figure 3 Pathological features of CDX2,SOX2 and TGR5 in chronic non-atrophic gastritis and intestinal metaplasia

3 討論

1988年Correa等[11]提出了腸型胃癌發(fā)生發(fā)展的模型,認(rèn)為腸型胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟的過程,一般經(jīng)歷正常胃黏膜-慢性非萎縮性胃炎-慢性萎縮性胃炎-腸化生-低級別上皮內(nèi)瘤變-高級別上皮內(nèi)瘤變-胃癌的發(fā)展路徑。因此腸化生被認(rèn)為是一種癌前病變,有研究表明腸化生患者患癌風(fēng)險約為正常健康人群的6-10倍[12]。腸化生可分為完全型腸化生和不完全型腸化生兩種病理類型,完全型腸化生又稱小腸型腸化生,這類腸化生具有完整的刷狀緣及杯狀細(xì)胞,組織形態(tài)上類似小腸細(xì)胞,可分泌唾液黏蛋白。不完全型腸化生又稱為大腸型腸化生,與小腸型相比缺乏刷狀緣,組織形態(tài)上類似大腸細(xì)胞,可分泌唾液黏蛋白及硫黏蛋白。兩種病理類型發(fā)生癌變的風(fēng)險不同,目前認(rèn)為大腸型腸化生較小腸型更易進(jìn)展為胃癌,有研究[13]對兩種病理類型的腸化生隨訪13年后發(fā)現(xiàn),不完全型腸化生中有18.2%發(fā)展為胃癌,而完全型腸化生中僅有0.96%發(fā)生癌變。

本研究對膽汁反流性胃炎不同嚴(yán)重程度患者間腸化生的發(fā)生率進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示隨著膽汁反流程度的加重,腸化生的發(fā)生率呈升高趨勢。這與日本的一項研究一致,2013年日本的一項臨床研究將2 283例接受胃鏡檢查的患者根據(jù)胃液中是否能檢測到膽汁酸將其分為試驗組和對照組,同時根據(jù)測定的膽汁酸濃度由低到高將試驗組分為4組進(jìn)行比較,結(jié)果顯示高濃度膽汁酸組腸化生的發(fā)生率顯著高于低濃度組[14],提示高濃度膽汁酸會增加腸化生的發(fā)生率。另一項研究也得出了類似的結(jié)果[15]。本研究還比較了不同膽汁反流嚴(yán)重程度組間發(fā)生腸化生病理類型的差別,結(jié)果顯示膽汁反流程度較重的患者不完全型腸化生的發(fā)生率顯著高于膽汁反流輕度患者,提示膽汁反流嚴(yán)重程度可能會影響腸化生的病理類型。查閱既往的文獻(xiàn)未見相關(guān)的報道,我們猜測可能是高濃度的膽汁酸通過某種分子機制引起腸化生病理類型的不同,具體的機制解釋還需要更多的基礎(chǔ)及臨床研究佐證。

CDX2屬于尾型同源盒基因(CDX)家族,是胃黏膜腸化生的重要調(diào)節(jié)因子,CDX2的異位表達(dá)在腸化生的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。正常情況下CDX2蛋白僅在腸內(nèi)表達(dá),在正常胃黏膜上皮內(nèi)不表達(dá),主要起調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞增殖分化的作用。SOX2屬于性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)基因家族,主要在正常食管及胃內(nèi)表達(dá),在腸道中不表達(dá)[10]。有大量研究表明CDX2/SOX2在膽汁酸誘導(dǎo)的腸化生中起重要作用。既往有研究將SOX2在不完全型腸化生和完全型腸化生中的表達(dá)陽性率進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示,SOX2在不完全型腸化生中的表達(dá)陽性率顯著高于在完全型腸化生中的表達(dá)[5]。最近的一項研究[16]顯示,膽汁酸可通過FXR/NF-κB信號通路上調(diào)CDX2和MUC2(黏蛋白2)的表達(dá),從而促進(jìn)腸上皮化生的發(fā)生。另一項研究[17]顯示SOX2可通過上調(diào)CDX2的轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)腸化生標(biāo)志物KLF4、HNF4α、鈣黏蛋白17的表達(dá),從而在腸化生的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)膽汁反流性胃炎伴腸化生患者CDX2的表達(dá)顯著高于慢性非萎縮性胃炎患者,且在膽汁反流度Ⅲ患者中的高表達(dá)率顯著高于膽汁反流Ⅰ度和Ⅱ度患者,提示膽汁反流嚴(yán)重程度與CDX2的表達(dá)正相關(guān),膽汁反流可能會促進(jìn)CDX2的表達(dá)。而SOX2顯示出相反的表達(dá)結(jié)果,提示膽汁反流嚴(yán)重程度與SOX2的表達(dá)負(fù)相關(guān),膽汁反流可能會抑制SOX2的表達(dá)。

TGR5受體是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員。TGR5受體在人類和動物體內(nèi)廣泛表達(dá),在與膽汁酸相互作用時可激活多種細(xì)胞內(nèi)信號通路,在抗炎、免疫調(diào)節(jié)、葡萄糖代謝、能量代謝等方面都具有十分重要的作用[18,19]。我們的研究顯示TGR5在膽汁反流性胃炎伴腸化生患者中的表達(dá)顯著高于慢性非萎縮性胃炎患者。已經(jīng)有研究表明TGR5在大多數(shù)胃腸型腺癌中過表達(dá),中度至強烈的TGR5染色與所有胃腺癌患者生存率降低密切相關(guān)[20]。而我們知道腸化生是胃腺癌形成的重要癌前病變形式。結(jié)合本次實驗結(jié)果,我們推測膽汁反流誘發(fā)TGR5高表達(dá),可能是導(dǎo)致膽汁反流相關(guān)性腸化生進(jìn)一步發(fā)生癌變的重要分子基礎(chǔ),這也為膽汁反流相關(guān)胃癌的防治提供新的診療思路。此外,我們還將TGR5在不同膽汁反流嚴(yán)重程度患者中的表達(dá)進(jìn)行比較,結(jié)果顯示TGR5在膽汁反流Ⅲ度患者中的高表達(dá)率顯著高于膽汁反流Ⅰ度和Ⅱ度患者,提示膽汁反流嚴(yán)重程度可能會對TGR5的表達(dá)產(chǎn)生影響。既往的研究中膽汁酸被認(rèn)為是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的腫瘤促進(jìn)因子[21]。同時研究[22]發(fā)現(xiàn)膽汁酸可以通過作用于巨噬細(xì)胞膜上TGR5受體,參與調(diào)控腸道炎癥,而膽汁酸失衡與腸道TGR5信號通路介導(dǎo)的炎癥失調(diào)密切相關(guān),并參與結(jié)腸癌的形成。結(jié)合以上研究基礎(chǔ),膽汁反流導(dǎo)致胃黏膜TGR5表達(dá)上調(diào),而TGR5表達(dá)上調(diào)可能參與黏膜炎癥反應(yīng)失衡過程,長期的慢性炎癥促進(jìn)了胃黏膜腸化的形成,因此TGR5可能是介導(dǎo)膽汁酸-炎癥-腸化生這一過程的重要分子基礎(chǔ)。

綜上所述,膽汁反流嚴(yán)重程度可影響腸化生的發(fā)生率,隨著膽汁反流程度的加重,腸化生的發(fā)生率呈升高趨勢。同時,膽汁反流嚴(yán)重程度與腸化生病理類型相關(guān),膽汁反流程度越重的患者發(fā)生腸化生的病理類型更傾向于不完全型。此外,膽汁反流可能通過影響CDX2、SOX2及TGR5的表達(dá)參與腸化生的發(fā)生發(fā)展。但由于本次試驗納入的病例數(shù)相對較少,進(jìn)一步的證實還需要更多樣本的納入。