漆酶基因在柑橘褐斑病發(fā)生過程中的表達(dá)模式分析

龔意輝 吳志蒙 李論 彭淑君 李鵬 陳致印

龔意輝（1988-），博士，主要從事園藝產(chǎn)品保鮮技術(shù)研究工作，主持或作為主要成員參與湖南省自然科學(xué)基金項目“漆酶在柑橘褐斑病中的作用機(jī)制”、湖南省教育廳科學(xué)研究項目“基于宏基因組學(xué)探討EGCG@β-CD納米粒增強(qiáng)降血脂功效的途徑及機(jī)制”和“漆酶在黃桃褐變中的作用”等科研項目3項;在《Food Chemistry》《Plant Physiology》《Postharvest Biology and Technology》《Food Chemistry Molecular Science》《International Journal of Molecular Sciences》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報》《包裝工程》《食品與發(fā)酵工業(yè)》等國內(nèi)外期刊發(fā)表學(xué)術(shù)論文18篇，其中第一作者或通訊作者11篇（SCI收錄期刊3篇）。

摘要：【目的】克隆柑橘漆酶基因（CsLAC）并分析其表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步完善柑橘褐斑病的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳蕴鸪葹樵囼灢牧?，利用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)分析柑橘褐斑病發(fā)生過程中主要酚類化合物的變化，并采用實(shí)時熒光定量PCR分析漆酶基因在柑橘褐斑病發(fā)生過程中的表達(dá)規(guī)律?！窘Y(jié)果】PE包裝明顯降低甜橙果實(shí)褐斑指數(shù)，利用LC-MS技術(shù)在甜橙果皮中共檢測到1191個差異離子，共鑒定出18種酚類物質(zhì)，其中沒食子酸（Gallic acid）、兒茶素（Catechin）、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin）和原花青素B2（Procyanidin B2）的含量在果實(shí)貯藏期間呈下降趨勢。成功克隆出7個柑橘漆酶基因，CsLAC4、CsLAC6、CsLAC11、CsLAC12、CsLAC13、CsLAC15和CsLAC17全長片段長度分別為1674、1716、1689、1740、1740、1713和1743 bp，分別編碼557、571、562、579、579、570和580個氨基酸殘基，與參考序列的相似性分別為99.88%、99.83%、99.70%、99.71%、99.60%、99.59%和99.89%。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，CsLAC15與荔枝LcLAC的氨基酸序列相似性較高（64.7%），CsLAC12與蘋果MdLAC7的氨基酸序列相似性較高（65.7%）。氨基酸保守序列結(jié)果表明柑橘漆酶氨基酸序列含有漆酶的3個典型銅離子結(jié)構(gòu)域，分別為Cu-oxidase-3、Cu-oxidase-1和Cu-oxidase-2。CsLAC4、CsLAC6、CsLAC11和CsLAC17在甜橙果實(shí)貯藏期間呈上調(diào)表達(dá)，CsLAC12和CsLAC15在果實(shí)貯藏期間總體上呈下調(diào)表達(dá)?！窘Y(jié)論】結(jié)合甜橙果皮褐斑與CsLAC表達(dá)量的關(guān)系，推測CsLAC6的大量上調(diào)表達(dá)可能對柑橘果皮褐斑形成起促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞： 柑橘;漆酶;褐斑病;酚類化合物;基因表達(dá)

中圖分類號： S666.4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）12-3195-10

Expression analysis of the laccase gene during the development of peel pitting in citrus fruit

GONG Yi-hui1， WU Zhi-meng1， LI Lun1， PENG Shu-jun1， LI Peng2， CHEN Zhi-yin1*

（1School of Agriculture and Biotechnology， Hunan University of Humanities， Science and Technology， Loudi， Hunan? 417000， China; 2Xiangtan City Agriculture Scientific Research Institute， Xiangtan， Hunan? 4171134， China）

Abstract：【Objective】To investigate the expression characteristics of laccase gene（CsLAC）of citrus fruit，to provide a theoretical basis for the mechanism of peel pitting in citrus fruit. 【Method】Sweet orange fruit were used as experimental materials. Liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS） was used to detect and analysis the main phenolic compounds during the development of peel pitting at the storage stage， and the expression of laccase genes were monitored during the development of peel pitting in citrus fruit using real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The results showed that peel pitting was inhibited by PE packaging treatment. A total of 1191 differential ions were detected in the peel of sweet oranges by LC-MS and 18 phenolic compounds were identified. The contents of gallic acid，catechin， epigallocatechin and procyanidin B2 were decreased during the storage of citrus fruit. Seven laccase genes were cloned by RT-PCR. The full lengths cDNA of CsLAC4， CsLAC6， CsLAC11， CsLAC12， CsLAC13， CsLAC15，CsLAC17 genes were 1674， 1716， 1689， 1740， 1740， 1713， 1743 bp， encoding 557， 571， 562， 579， 579， 570， 580 amino acids residues， with similarities to the reference sequence of 99.88%， 99.83%， 99.70%， 99.71%， 99.60%， 99.59% and 99.89%， respectively. Phylogenetic analysis showed that CsLAC15 had 64.7% amino acid sequence similarity to litchi LcLAC， while CsLAC12 had 65.7% similarity to apple MdLAC7 amino acid sequence. The laccase amino acid sequences in different plants had a structure of three highly conserved domains：Cu-oxidase-3， Cu-oxidase-1 and Cu-oxidase-2. The expressions of CsLAC4， CsLAC6， CsLAC11， CsLAC17 were up-regulated and CsLAC12 and CsLAC15 were down-regulated during the storage of sweet orange fruits. 【Conclusion】 Combining the relationship of peel pitting and CsLAC expression，it is suggested that the CsLAC6 in pericarp may contribute to the peel pitting of sweet orange fruit.

Key words： citrus; laccase; peel pitting; phenolic compounds; gene expression

Foundation item： Hunan Natural Science Foundation（2020JJ5270）; Science and Technology Innovation Project of Hunan（2020RC1014）; Scientific Research Project of Hunan Provincial Department of Education（20A281）

0 引言

【研究意義】柑橘是我國南方地區(qū)重要的特色水果，也是世界上栽培面積最廣的水果之一。柑橘因色澤鮮艷，果汁豐富，營養(yǎng)、保健及藥用價值高等特點(diǎn)而受到廣大消費(fèi)者的喜愛。柑橘果實(shí)褐斑病又稱干疤病，是柑橘果實(shí)低溫貯藏中普遍發(fā)生的一種生理失調(diào)病害，尤其是甜橙類果實(shí)褐斑病發(fā)病率達(dá)20%～50%，嚴(yán)重時高達(dá)90%（Fan et al.，2009;Cronjé et al.，2017）。褐斑病的發(fā)生嚴(yán)重降低柑橘果實(shí)的外觀品質(zhì)，其病斑部位更容易受到炭疽病、青霉病和綠霉病等病原菌的入侵而導(dǎo)致果肉變質(zhì)和果實(shí)腐爛。果皮褐斑病不僅嚴(yán)重影響果實(shí)外觀光潔度和風(fēng)味，還會降低鮮銷果實(shí)的出口價格和國際市場競爭力，嚴(yán)重制約我國柑橘產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。柑橘褐斑病的形成機(jī)理仍是目前柑橘果實(shí)采后生理研究中迫切需要解決的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題。漆酶（苯二醇：氧化還原酶，Laccase，EC1.1.03.2）是由多基因家族編碼并廣泛分布于果實(shí)中的一個重要酶，在果實(shí)中具有廣泛的生理作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，漆酶在荔枝和蘋果果皮褐變中起著重要的作用（Fang et al.，2015;Gong et al.，2018），但漆酶在柑橘褐斑病中的作用研究鮮見報道。因此，克隆柑橘LAC基因（CsLAC）并分析其表達(dá)模式，以期深入研究漆酶基因在柑橘褐斑病發(fā)生過程中的作用機(jī)制，對提高柑橘果實(shí)品質(zhì)和耐藏性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】不少學(xué)者對柑橘褐斑病的生理生化進(jìn)行了研究，且大多集中在癥狀、褐斑果皮組織特征及誘發(fā)因素等方面（Fan et al.，2009;Vicente et al.，2013），對褐斑病的發(fā)病機(jī)制卻缺乏系統(tǒng)研究。柑橘果實(shí)發(fā)生褐斑病后，果皮表現(xiàn)出皺縮、干疤的癥狀，并形成不規(guī)則的深褐色病斑（Lafuente and Zacarías，2006）。目前，國內(nèi)外研究認(rèn)為果實(shí)褐斑病與酶促褐變、冷害、膜脂過氧化等因素有著密切關(guān)系。高雪（2006）研究發(fā)現(xiàn)，在褐斑嚴(yán)重的奉節(jié)臍橙果皮中過氧化物酶（POD）活性較高，且隨褐斑病的嚴(yán)重程度總體呈升高趨勢。與正常果實(shí)比較，褐斑嚴(yán)重的皇冠梨果皮和果肉中酚含量及POD和多酚氧化酶（PPO）活性較高（關(guān)軍鋒等，2005，2009）。柑橘果實(shí)內(nèi)的自由基清除系統(tǒng)在持續(xù)低溫脅迫作用下被打破，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化加劇，大量積累丙二醛產(chǎn)物，進(jìn)一步加劇毒害細(xì)胞膜系統(tǒng)，在冷害后期細(xì)胞膜系統(tǒng)降解呈絮狀而變得不清晰，打破了細(xì)胞區(qū)域化分隔系統(tǒng)，造成細(xì)胞內(nèi)酚類物質(zhì)、PPO和POD等從液泡內(nèi)溢出與外界發(fā)生接觸，加快果皮酶促褐變進(jìn)程，使得果皮表現(xiàn)出褐斑病癥狀（Cajuste and Lafuente，2007）。漆酶是一個古老的氧化還原酶，屬于多銅氧化酶家族，廣泛分布于很多植物種類中（Giardina et al.，2010;Reichel et al.，2013）。漆酶能催化O2通過4個電子還原成水，并伴隨著一些酚類和芳香類底物的氧化，這些酚類和芳香類化合物脫去羥基上的電子和質(zhì)子形成自由基，導(dǎo)致酚類和木質(zhì)素類化合物裂解（Schuetz et al.，2014;Wang et al.，2015）。近年來，關(guān)于漆酶在植物組織褐變中的作用研究有一些報道。Fang等（2015）研究表明，荔枝漆酶在果皮花色素苷降解和采后果皮褐變中起著關(guān)鍵作用。帥良等（2017）采用RT-PCR對龍眼漆酶進(jìn)行全長克隆，發(fā)現(xiàn)漆酶基因的上調(diào)表達(dá)可能與龍眼褐變關(guān)系密切。Gong等（2018）研究漆酶在采后蘋果虎皮病中的生物學(xué)作用，發(fā)現(xiàn)MdLAC7在虎皮病嚴(yán)重的蘋果果皮中表達(dá)量高，可能在虎皮病發(fā)生過程中起著重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人研究表明漆酶在果實(shí)酶促褐變中起著重要作用，但有關(guān)漆酶在采后柑橘果實(shí)褐斑病中的作用尚未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以甜橙為試驗材料，結(jié)合聚乙烯（PE）包裝處理，利用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測漆酶在不同褐斑程度果皮中的相對表達(dá)量，并對漆酶進(jìn)行生物學(xué)信息分析，利用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)測定甜橙果實(shí)褐斑病發(fā)生過程中主要酚類物質(zhì)的相對豐度，為完善柑橘褐斑病的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

于2020年11月15日在漣源市曲溪村柑橘基地采摘甜橙果實(shí)，挑選果實(shí)大小一致、色澤均勻、無病蟲害、無機(jī)械傷害的果實(shí)。采摘后立即運(yùn)到實(shí)驗室進(jìn)行試驗處理。甲醇、水、甲酸和醋酸銨均為質(zhì)譜級純度，購自美國Thermo Fisher公司;TRUEscript RT MasterMix購自北京密碼子生物科技有限公司;TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit購自北京艾德萊生物科技有限公司;TaKaRa PCR Amplification Kit、PMD 20-T Vector Kit和TaKaRa Gel DNA Purification Kit Ver2.0購自TaKaRa公司;2×SYBR Green QPCR Mixture預(yù)混液購自廣州東盛生物科技有限公司。

主要儀器設(shè)備：質(zhì)譜儀Q ExactiveTM HF-X（Thermo Fisher，Germany），色譜儀Vanquish UHPLC（Thermo Fisher，Germany），色譜柱Hypesil Gold colu-mn（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，Thermo Fisher，USA），低溫離心機(jī)D3024R（Scilogex，USA）;analytikjena-q TOWER2.2型熒光定量PCR儀、普通PCR儀analy-tikjena-Easycycler和超微量核酸蛋白測定儀scandrop100均購自德國耶拿分析儀器股份公司;PE保鮮袋由廣州健陽生物科技有限公司生產(chǎn)提供，規(guī)格為400 mm×400 mm，雙層膜厚度均為0.05 mm。

1. 2 試驗處理

將挑選好的甜橙果實(shí)12個一組裝入PE保鮮袋，用橡皮筋綁緊封口后置于溫度（15±1）℃、相對濕度85%的恒溫箱中貯藏42 d。同時，以不作任何處理的甜橙果實(shí)放置于相同貯藏條件下作為對照組（CK），每處理3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)3個果實(shí)。分別在0、14、28和42 d進(jìn)行果皮取樣，將果皮迅速用液氮充分浸泡，徹底凍結(jié)后立即用錫箔紙包裝，放入自封袋置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)漆酶基因表達(dá)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 果實(shí)褐斑指數(shù)測定 參照Knight等（2002）、高雪和李正國（2009）的方法略有改動，以12個甜橙果實(shí)為基數(shù)計算果實(shí)褐斑指數(shù)。褐斑分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級：果皮完全無褐斑;1級：≤1/4面積果皮輕微褐斑;2級：1/4～2/4面積果皮褐斑;3級：2/4～3/4面積果皮褐斑;4級：≥3/4面積果皮嚴(yán)重褐斑。

褐斑指數(shù)=Σ（褐斑級別×該級別果實(shí)占總果實(shí)

的百分比）

1. 3. 2 酚類物質(zhì)提取 參照Want等（2012）的方法并略有改動。稱取100 mg經(jīng)液氮研磨至粉末的甜橙果皮樣品，加500 μL 80%（v/v）甲醇后渦旋振蕩混勻，將樣品置于冰浴中靜置5 min，在4 ℃、18000 r/min條件下離心20 min，吸取一定量的上清液加質(zhì)譜級水稀釋至甲醇含量為53%;并在4 ℃、18000 r/min條件下離心20 min，然后從每個樣品中取550 μL放入新的樣品管中，記錄好樣品名稱和順序，最后從每個試驗樣本中取30 μL混勻作QC樣本;以53%甲醇作空白樣本，前處理過程與試驗樣本相同。將以上各樣品保存至樣品瓶中，用于后續(xù)LC-MS分析。

1. 3. 3 色譜條件 色譜柱Hypesil Gold column（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）;柱溫40 ℃;流速0.2 mL/min;正模式：流動相A為0.1%（v/v）甲酸，流動相B為甲醇;負(fù)模式：流動相A為5 mmol/L醋酸銨，pH 9.0，流動相B為甲醇;進(jìn)樣量100 μL;色譜梯度洗脫程序如表1所示。

1. 3. 4 酚類物質(zhì)的LC-MS分析 采用高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀Q ExactiveTM HF-X對色譜柱洗脫下來的未知酚類物質(zhì)進(jìn)行正負(fù)離子模式檢測。正離子模式掃描范圍選擇m/z 100～1500;ESI源的設(shè)置：毛細(xì)管電壓3.2 kV，氣體Ⅰ（GSⅠ）和氣體Ⅱ（GSⅡ）分別設(shè)為40和10 arb，離子源溫度320 ℃。將下機(jī)數(shù)據(jù)（.raw）文件導(dǎo)入CD搜庫軟件（CD3.1，Thermo Fisher）中，進(jìn)行保留時間、質(zhì)荷比等參數(shù)的簡單篩選，然后對不同樣品根據(jù)保留時間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差在百萬分之五內(nèi)進(jìn)行峰對齊，使鑒定更準(zhǔn)確，隨后根據(jù)設(shè)置的質(zhì)量偏差為百萬分之五、信號強(qiáng)度偏差30%、信噪比3、最小信號強(qiáng)度100000、加和離子等信息進(jìn)行峰提取，同時對峰面積進(jìn)行定量，再整合目標(biāo)離子，然后通過分子離子峰和碎片離子進(jìn)行分子式預(yù)測，與北京諾禾致源科技股份有限公司自建代謝物數(shù)據(jù)庫、Metlin（http：//metlin.scripps.edu）和mzVault數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，用空白樣本去除背景離子，并對定量結(jié)果進(jìn)行歸一化，最后得到酚類物質(zhì)的鑒定和定量結(jié)果。

1. 3. 5 總RNA提取與cDNA第一鏈合成 使用RNA提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）提取甜橙果皮總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。以總RNA為模板，采用Aidlab公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）的步驟合成cDNA第一鏈，置于-30 ℃保存，用于后續(xù)漆酶基因的克隆及表達(dá)分析。

1. 3. 6 CsLAC基因克隆及生物信息學(xué)分析 在 NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找已發(fā)表的柑橘漆酶基因的氨基酸序列，設(shè)計漆酶基因的特異性引物（表2）。以甜橙果皮cDNA為模板，參照TaKaRa PCR Amplification Kit的說明步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段，切膠，回收，連接pMD20-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR鑒定出陽性克隆，將各樣品送至中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司測序。根據(jù)柑橘漆酶基因測序所得到的氨基酸序列，使用Clustal X 1.83對柑橘漆酶基因的同源性及序列進(jìn)行多重比較分析;運(yùn)用MEGA 6.0中的鄰位相連法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建漆酶基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 3. 7 CsLAC基因表達(dá)分析 利用Primer 5.0進(jìn)行漆酶基因熒光引物設(shè)計，通過Oligo 6.0對已設(shè)計好的引物進(jìn)行評價，如表3所示。參照Shuai等（2016）、Gong等（2018）的方法，qRT-PCR使用熒光染料為2×SYBR Green QPCR Mixture，擴(kuò)增體系10.0 μL：cDNA模板1.0 μL，200 nmol/L上、下游引物各0.5 μL，2×SYBR? Green Supermix 5.0 μL，ddH2O 3.0 μL。以Citrus RNA polymeraseII（CRPII，EF174422）作為本研究的內(nèi)參基因（Liu et al.，2008），各樣品的表達(dá)量均是相對于內(nèi)參基因。熒光表達(dá)量計算采用2-△△Ct法（Ponchel et al.，2003），由熒光定量PCR儀軟件系統(tǒng)自動分析得出結(jié)果。

1. 4 統(tǒng)計分析

使用Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，以Sigmaplot 12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PE包裝對甜橙果實(shí)褐斑指數(shù)的影響

由圖1可知，在甜橙果實(shí)貯藏期間，果皮褐斑指數(shù)隨著貯藏時間的延長呈逐漸上升趨勢，而PE包裝處理的甜橙果實(shí)在貯藏0～14 d無褐斑病發(fā)生，貯藏至第28和42 d的果實(shí)褐斑指數(shù)均極顯著低于對照組（P<0.01，下同）。表明PE包裝處理能明顯抑制甜橙果實(shí)褐斑病的發(fā)生。

2. 2 PE包裝對甜橙果實(shí)酚類物質(zhì)含量的影響

利用LC-MS技術(shù)鑒定采后甜橙果實(shí)貯藏期間的代謝物，共鑒定出1191個差異離子，在甜橙果皮中鑒定出18種酚類物質(zhì)（表4），包括矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、根皮苷、綠原酸、槲皮素、甜橙素等。

在甜橙果實(shí)貯藏期間，矢車菊素-3-O-蕓香糖苷總體上呈升高趨勢，PE包裝處理的矢車菊素-3-O-蕓香糖苷含量高于對照組（圖2-A）;沒食子酸、表沒食子兒茶素、原花青素B2和兒茶素含量在果實(shí)貯藏期間呈逐漸下降趨勢（圖2-B、圖2-D、圖2-E和圖2-G）;根皮苷含量呈逐漸上升趨勢，PE包裝誘導(dǎo)根皮苷含量增加（圖2-C），槲皮素和綠原酸含量在果實(shí)貯藏期間呈先升高后下降的變化趨勢（圖2-F和圖2-H）;對照組的桔黃酮含量呈先升高后下降的變化趨勢，PE包裝的桔皮素含量則變化不大（圖2-I）。

2. 3 CsLAC基因克隆結(jié)果

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找柑橘漆酶基因的氨基酸序列，以甜橙果皮cDNA為模板，設(shè)計漆酶基因的特異性引物。擴(kuò)增序列經(jīng)BLAST比對后發(fā)現(xiàn)成功從甜橙果皮中克隆得到7個漆酶基因，分別為CsLAC4、CsLAC6、CsLAC11、CsLAC12、CsLAC13、CsLAC15和CsLAC17（圖3），基因片段長度分別為1674、1716、1689、1740、1740、1713和1743 bp，分別編碼557、571、562、579、579、570和580個氨基酸殘基，與參考序列的相似性分別為99.88%、99.83%、99.70%、99.71%、99.60%、99.59%和99.89%。

2. 4 CsLAC基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果

對上述克隆得到的7個甜橙漆酶基因編碼的氨基酸序列與荔枝（LcLAC）、蘋果（MdLAC7）和黃桃（PpLAC）進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，CsLAC15與LcLAC的氨基酸序列相似性較高（64.7%），而CsLAC12與MdLAC7的氨基酸序列相似性較高（65.7%）（圖4）。結(jié)合本課題組證實(shí)了荔枝漆酶在果皮褐變中起著關(guān)鍵作用（Fang et al.，2015），MdLAC7可能在虎皮病褐變中起著重要作用（Gong et al.，2018），初步推測柑橘漆酶基因可能與褐斑病的發(fā)生存在一定關(guān)聯(lián)性。通過選取荔枝、蘋果和甜橙漆酶的氨基酸序列進(jìn)行保守序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柑橘漆酶氨基酸序列同樣含有漆酶的3個典型銅離子結(jié)構(gòu)域，分別為Cu-oxidase-3、Cu-oxidase-1和Cu-oxidase-2（圖5）。

2. 5 CsLAC基因表達(dá)分析結(jié)果

本研究利用qRT-PCR檢測7個漆酶基因在甜橙褐斑病發(fā)生過程中的表達(dá)情況。由圖6可知，甜橙果皮中的CsLAC4、CsLAC6和CsLAC11相對表達(dá)量隨著貯藏時間的延長呈增加趨勢，在采后貯藏第42 d表達(dá)水平達(dá)最大值，PE包裝處理則抑制這3個基因的表達(dá)水平（圖6-A～圖6-C）;CsLAC12和CsLAC15基因在果實(shí)貯藏過程中呈下調(diào)表達(dá)（圖6-D和圖6-F）;CsLAC13相對表達(dá)量在果實(shí)貯藏期間呈先上升后下降的變化趨勢，在采后貯藏第14 d出現(xiàn)最大值（圖6-E）;對照組中CsLAC17相對表達(dá)量在甜橙果實(shí)貯藏期間呈先升高后降低的變化趨勢，而PE包裝處理的CsLAC17相對表達(dá)量在貯藏期間總體上呈上升趨勢（圖6-G）。綜合這7個漆酶基因的表達(dá)水平，CsLAC6的相對表達(dá)量明顯高于其他6個漆酶基因，表明不同漆酶基因在柑橘褐斑病中的表達(dá)水平存在明顯差異，CsLAC6在甜橙果實(shí)貯藏過程中的高表達(dá)量水平可能促進(jìn)甜橙果實(shí)褐斑病的發(fā)生。

3 討論

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于很多果實(shí)中（Fang et al.，2015;Berni et al.，2019）。漆酶是一個古老的氧化還原酶，不同來源的漆酶核苷酸序列差異很大（Mayer and Staples，2002）。其底物分布廣泛，能催化酚類、芳胺類、羧酸類、甾體類激素、生物色素、金屬有機(jī)化合物和非酚類物質(zhì)生成醌類化合物、羰基化合物和水（D'Annibale et al.，2010）。柑橘果實(shí)中含有豐富的酚類化合物且種類豐富，包括兒茶素、咖啡酸、綠原酸、沒食子酸、根皮苷和桔皮素等酚類物質(zhì)（Marie et al.，2015;Buyukkurt et al.，2019;Multari et al.，2020）。本研究利用LC-MS初步在甜橙果皮中鑒定出19種主要酚類物質(zhì)，包括兒茶素、綠原酸、沒食子酸、咖啡酸、原花青素B2和表沒食子兒茶素等。鄭潔等（2014）利用超高效液相色譜法在紐荷爾臍橙和寬皮柑橘類果皮中鑒定出綠原酸、橙皮苷、咖啡酸等18種酚類化合物。本研究發(fā)現(xiàn)，沒食子酸、兒茶素、表沒食子兒茶素和原花青素B2的含量在甜橙果實(shí)貯藏期間呈逐漸下降趨勢，推測可能作為漆酶氧化的底物，逐漸被催化氧化生成褐色物質(zhì)，導(dǎo)致其含量下降，從而使甜橙果皮褐斑癥狀表現(xiàn)出來。羅耀紅等（2008）研究表明，植物漆酶能氧化表兒茶素、綠原酸及原花青素聚合體等多酚類物質(zhì)。由此可知，柑橘果皮中漆酶催化氧化酚類底物生成褐色物質(zhì)，從而導(dǎo)致果皮褐斑病的形成。

本研究系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析顯示，CsLAC15與荔枝漆酶具有較高的同源性，而CsLAC12與蘋果漆酶具有較高的同源性。氨基酸保守序列分析發(fā)現(xiàn)，柑橘漆酶氨基酸序列含有漆酶的3個典型銅離子結(jié)構(gòu)域，分別為Cu-oxidase-3、Cu-oxidase-1和Cu-oxidase-2。研究表明荔枝漆酶和蘋果漆酶包含3個多銅氧化酶家族結(jié)構(gòu)域，并與PPO區(qū)分開（Fang et al.，2015;Gong et al.，2018）。甜橙果皮中CsLAC6基因的表達(dá)水平逐漸上升，果實(shí)褐斑指數(shù)也呈迅速上升趨勢，CsLAC6基因相對表達(dá)量與果皮褐斑指數(shù)存在較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，推測原因可能是CsLAC6基因相對表達(dá)量的增加導(dǎo)致甜橙果皮中漆酶總量及活性的增加，使果皮中底物氧化量增加，加快了甜橙果實(shí)褐斑癥狀的形成。結(jié)合漆酶基因在蘋果虎皮病褐變和荔枝果皮褐變過程中所起的作用和研究結(jié)果（Fang et al.，2015;Gong et al.，2018），推測CsLAC6基因在甜橙貯藏期間的大量上調(diào)表達(dá)可能促進(jìn)了甜橙褐斑癥狀的形成。綜上所述，CsLAC6可能在甜橙果實(shí)褐斑病形成中起著重要作用。

4 結(jié)論

不同漆酶基因在甜橙果實(shí)褐斑病發(fā)生進(jìn)程中的表達(dá)水平存在明顯差異，其中CsLAC6在貯藏期間高水平的上調(diào)表達(dá)，暗示CsLAC6可能在甜橙果實(shí)褐斑病的發(fā)生過程中起著重要作用。

參考文獻(xiàn)：

高雪，李正國. 2009. 奉節(jié)臍橙果皮褐變生理的研究[J]. 食品科學(xué)，30（8）：280-283. [Gao X，Li Z G. 2009. Physiological study of peel pitting of Fengjie navel orange fruit[J]. Food Science，30（8）：280-283.] doi：10.3321/j.issn：1002-6630.2009.08.064.

高雪. 2006. 奉節(jié)臍橙果皮褐變生理及相關(guān)基因的分離研究[D]. 重慶：重慶大學(xué). [Gao X. 2006. Study on the phy-siology of peel browning and isolation of related genes of Fengjie Navel Orange fruit[D]. Chongqing：Chongqing University.]

關(guān)軍鋒，竇世娟，及華，孫玉龍. 2009. 采后包裝對黃冠梨冷藏期間品質(zhì)和果皮褐斑的影響[J]. 保鮮與加工，9（6）：25-27. [Guan J F，Dou S J，Ji H，Sun Y L. 2009. Effect of postharvest packaging on quality and peel browning spot of Huangguan pears during cold storage[J]. Storage and Process，9（6）：25-27.] doi：10.3969/j.issn.1009-6221.2009. 06.007.

關(guān)軍鋒，及華，馮云霄，李麗梅，孫玉龍，司建麗. 2005. 黃冠梨果皮褐斑病與酚類物質(zhì)代謝的關(guān)系[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，20（6）：80-83. [Guan J F，Ji H，F(xiàn)eng Y X，Li L M，Sun Y L，Si J L. 2005. The correlation of peel browning spot with phenolics metabolism in Huangguan pears[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，20（6）：80-83.] doi：10.3321/j.issn：1000-7091.2005.06.021.

羅耀紅，左瑩，蘇鈺琦，馬惠玲. 2008. 漆酶對酚類化合物生物催化氧化動力學(xué)研究——以兒茶酚和表兒茶素為模式底物[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，28（3）：13-17. [Luo Y H，Zuo Y，Su Y Q，Ma H L. 2008. Study on kinetic behaviors of the biocatalysis of laccase on oxidation of phenolic compounds——Using catechol and epicatechin as model substrates[J]. Chemistry and Industry of Forest Products，28（3）：13-17]. doi：10.3321/j.issn：0253-2417.2008.03.003.

帥良，趙昱清，廖玲燕，宋慕波，朱東建，蔡文，段振華，吳振先，韓冬梅. 2017. 龍眼漆酶基因（DlLac）的克隆及表達(dá)分析[J]. 食品工業(yè)科技，38（13）：95-100. [Shuai L，Zhao Y Q，Liao L Y，Song M B，Zhu D J，Cai W，Duan Z H，Wu Z X，Han D M. 2017. Cloning and expression analysis of the laccase gene （DlLac） from Dimocarpus longan[J]. Science and Technology of Food Industry，38（13）：95-100.] doi：10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.018.

鄭潔，趙其陽，張耀海，焦必寧. 2014. 超高效液相色譜法同時測定柑橘中主要酚酸和類黃酮物質(zhì)[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，47（23）：4676-4687. [Zheng J，Zhao Q Y，Zhang Y H，Jiao B N. 2014. Simultaneous determination of main flavonoids and phenolic acids in citrus fruit by ultra performance liquid chromatograph[J]. Scientia Agricultura Sinica，47（23）：4676-4687.] doi：10.3864/j.issn.0578-1752. 2014.23.015.

Berni R，Piasecki E，Legay S，Hausman J F，Siddiqui S K，Cai G，Guerriero G. 2019. Identification of the laccase-like multicopper oxidase gene family of sweet cherry（Prunus avium L.） and expression analysis in six ancient Tuscan varieties[J]. Scientific Reports，9（1）：3557. doi：10.1038/s41598-019-39151-z.

Buyukkurt O K，Guclu G，Kelebek H，Selli S. 2019. Characterization of phenolic compounds in sweet lime （Citrus limetta） peel and freshly squeezed juices by LC-DAD-ESI-MS/MS and their antioxidant activity[J]. Journal of Food Measurement and Characterization，13（1）：3242-3249. doi：10.1007/s11694-019-00246-w.

Cajuste J F，Lafuente M T. 2007. Ethylene-induced tolerance to non-chilling peel pitting as related to phenolic metabolism and lignin content in ‘Navelate fruit[J]. Postharvest Biology & Technology，45（2）：193-203. doi：10.1016/j.postharvbio.2007.01.019.

Cronjé P J R，Zacarías L，Alférez F. 2017. Susceptibility to postharvest peel pitting in Citrus fruits as related to albedo thickness，water loss and phospholipase activity[J]. Postharvest Biology and Technology，123：77-82. doi：10. 1016/j.postharvbio.2016.08.012.

D'Annibale A，Celletti D，F(xiàn)elici M，Mattia E D，Giovannozzi-Sermanni G. 2010. Substrate specificity of laccase from Lentinus edodes[J]. Acta Biotechnologica，16（4）：257-270. doi：10.1002/abio.370160408.

Fan J，Yang Y W，Gao X，Yang Y W，Xue G，Deng W，F(xiàn)alara V，Kanellis A K，Li Z G. 2009. Expression of a senescence-associated cysteine protease gene related to peel pitting of navel orange（Citrus sinensis L. Osbeck）[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture，98（3）：281-289. doi：10.1007/s11240-009-9561-7.

Fang F，Zhang X L，Luo H H，Zhou J J，Gong Y H，Li W J，Shi Z W，He Q，Wu Q，Li L，Jiang L L，Cai Z G，Oren-Shamir M，Zhang Z Q，Pang X Q. 2015. An intracellular laccase is responsible for epicatechin-mediated anthocyanin degradation in litchi fruit pericarp[J]. Plant Physiology，169（4）：2391-2408. doi：10.1104/pp.15.00359.

Giardina P，F(xiàn)araco V，Pezzella C，Piscitelli A，Vanhulle S，Sannia G. 2010. Laccases：A never-ending story[J]. Cellular & Molecular Life Sciences，67（3）：369-385. doi：10.1007/s00018-009-0169-1.

Gong Y H，Song J，Du L N，Vinquest M，Palmer L C，F(xiàn)illmore S，Pang X Q，Zhang Z Q. 2018. Characterization of laccase from apple fruit during postharvest storage and its response to diphenylamine and 1-methylcyclopropene treatments[J]. Food Chemistry，253（1）：314-321. doi：10. 1016/j.foodchem.2018.01.142.

Knight T G，Klieber A，Sedgley M. 2002. Structural basis of the rind disorder oleocellosis in Washington navel orange（Citrus sinensis L. Osbeck）[J]. Annals of Botany，（6）：765-773. doi：10.1093/aob.mcf258.

Lafuente M T，Zacarías L. 2006. Postharvest physiological disorders in citrus fruit[J]. Stewart Postharvest Review，2（1）：1-9. doi：10.2212/spr.2006.1.2.

Liu H G，Wang Z K，Cao Y Q，Xia Y X，Yin Y P. 2008. Detection of Citrus tristeza virus using conventional and fluo-rescence quantitative RT-PCR assays[J]. Acta Phytopathologica Sinica，238：24-30. doi：10.3724/SP.J.1005.2008. 01083.

Marie D H，Audray D，Thibault D，Bidel L P R，Christian J A，Yann F，F(xiàn)rédéric B，F(xiàn)anciullino A L. 2015. Mapping the genetic and tissular diversity of 64 phenolic compounds in Citrus species using a UPLC-MS approach[J]. Annals of Botany，115（5）：861-877. doi：10.1093/aob/mcv012.

Mayer A M，Staples R C. 2002. Laccase：New functions for an old enzyme[J]. Phytochemistry，60（6）：551-565. doi：10.1016/S0031-9422（02）00171-1.

Multari S，Licciardello C，Caruso M，Martens S. 2020. Monitoring the changes in phenolic compounds and carote-noids occurring during fruit development in the tissues of four Citrus fruits[J]. Food Research International，134：109228. doi：10.1016/j.foodres.2020.109228.

Ponchel F，Toomes C，Bransfield K，Leong F T，Douglas S H，F(xiàn)ield S L，Bell S M，Combaret V，Puisieux A，Mighell A J，Robinson P A，Inglehearn C F，Isaacs J D，Markham A F. 2003. Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence：An alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements，gene amplifications and micro gene deletions[J]. BMC Biotechnology，3（1）：1-13. doi：10.1186/1472-6750-3-18.

Reichel M，Triani R，Wellh?fer J，Sruamsiri P，Reinhold C，Sybille N. 2013. Vital characteristics of litchi （Litchi chinensis Sonn.） pericarp that define postharvest concepts for Thai cultivars[J]. Food & Bioprocess Technology，6（5）：1191-1206. doi：10.1007/s11947-011-0762-9.

Schuetz M，Benske A，Smith R A，Watanabe Y，Tobimatsu Y，Ralph J，Demura T，Ellis B，Samuels A L. 2014. Laccases direct lignification in the discrete secondary cell wall domains of protoxylem[J]. Plant Physiology，166（2）：798-807. doi：10.1104/pp.114.245597.

Shuai L，Li J，Niu J J，Qian P H，Liu W H，Xue X Q，Han D M，Wu Z X. 2016. Sucrose-metabolizing enzymes and their genes in the arils of two Dimocarpus longan cultivars[J]. Biologia Plantarum，60：741-748. doi：10.1007/s10535-016-0602-x.

Vicente A R，Manganaris G A，Minas I S，Goulas V，Lafuente M T. 2013. Cell wall modifications and ethylene-induced tolerance to non-chilling peel pitting in citrus fruit[J]. Plant Science，210（9）：46-52. doi：10.1016/j.plantsci.2013. 05.001.

Wang W，Liu F，Jiang Y J，Wu G M，Guo L X，Chen R L，Chen B Z，Lu Y P，Dai Y C，Xie B G. 2015. The multigene family of fungal laccases and their expression in the white rot basidiomycete Flammulina velutipes[J]. Gene，563（2）：142-149. doi：10.1016/j.gene.2015.03.020.

Want E J，Masson P，Michopoulos F，Wilson I D，Theodoridis G，Plumb R S，Shockcor J，Loftus N，Holmes E，Nicholson J K. 2012. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS[J]. Nature Protocols，8（1）：17-32. doi：10.1038/nprot.2012.135.

（責(zé)任編輯 羅 麗）