DNA條形碼在我國常見魚肉樣品鑒定中的應用

黃曼虹，熊 雄，袁方穎，陸利霞,2，熊曉輝,2

(1.南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京 211800；2.江蘇省食品安全快速檢測公共技術服務中心， 江蘇 南京 211800)

水產品種類繁多，營養(yǎng)價值和經濟價值千差萬別。為了追求利益的最大化，國際市場上各種水產品以次充好，假冒替代的現(xiàn)象時有發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計，2010—2015年，世界水產品平均物種錯誤標簽率達到30%[1]。

非法的經濟獲益是水產品摻假的最大誘因。Miller等[2]根據(jù)愛爾蘭當?shù)厥袌鰞r格，估算鱈魚制品因物種摻假每年可產生非法收益40萬～50萬英鎊。而除了經濟損失，水產品摻假也給食品安全帶來巨大的風險隱患。如Armani等[3]從預包裝魷魚片中鑒定出有毒的河豚魚品種。

我國是世界水產品消費大國。據(jù)《中國統(tǒng)計年鑒》統(tǒng)計：2017年，我國人均水產品消費量達到11.5 kg，比2013年增加了10.58%。其中，城鄉(xiāng)居民人均水產品消費量分別達到了14.8和7.4 kg，比2013年分別增加了5.71%和12.12%。在水產品消費量增長的同時，人們對水產品的質量安全也提出了更高的要求，其中一個重要的方面就是對水產類原料的生物種屬進行準確的標識和鑒定[4]。然而，由于缺乏對一些水產類物種命名的統(tǒng)一標準以及不少商販缺乏專業(yè)的水產類物種分類知識，我國市場上水產品物種摻假現(xiàn)象不斷被曝光，如“真假鱈魚”[5]和“真假三文魚”[6]等。

傳統(tǒng)的形態(tài)學特征法需要鑒定者擁有良好的形態(tài)學鑒定知識，但鑒定者不能通過該法對水產品加工制品進行準確鑒定，因此，該法不能滿足水產品摻假檢測的需求?；贒NA的分子生物學方法具有高效、特異、靈敏、快速的特點，在水產品鑒別方面已經展現(xiàn)出巨大的潛力。其中，DNA條形碼(DNA barcoding)技術是應用最廣泛的一種，其基本原理是利用一段較短的DNA標準序列的多態(tài)性來實現(xiàn)快速、準確的物種鑒定[7]。對動物而言，該標準序列一般為線粒體COⅠ基因5′端的一段長約650 bp的片段。該技術對鑒定者的經驗和專業(yè)知識背景要求較低，為物種鑒定提供了新的手段，已被廣泛應用于水產品品種鑒定[5,8-9]。

本研究中，筆者對江蘇市場采集的127份(42種魚肉)樣品進行DNA提取、擴增、測序和序列分析，分析其標簽標注的準確性，以期為水產品市場監(jiān)管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 魚肉樣品

1.1.2 試劑

10×Reaction Buffer、BioReady rTaqDNA聚合酶、dNTP Mixture，日本BioFlux株式會社；6×Loading Buffer、DL1000 DNA Marker，寶日醫(yī)生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠，西班牙Biowest公司；GelRedTM核酸凝膠染料，美國Biotium公司；蛋白酶K，BBI生命科學有限公司；引物合成，金斯瑞生物科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備

BioPhotometer D30型核酸蛋白測定儀，德國Eppendorf公司；Laborzentrifugen高速離心機，德國Sigma公司；Life Express梯度PCR儀，中國杭州博日科技有限公司；Bio-Rad ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)，伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司；JY300C型凝膠電泳儀、JY-SPFT型電泳槽，北京君意東方電泳設備有限公司；GWA-UNI-F40型純水/超純水器，北京普析通用儀器有限責任公司；MS-100型恒溫混勻儀，杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

DNA提取參照Armani等[10]的鹽析法，操作步驟如下：用滅菌的剪刀取魚背部肌肉50 mg于1.5 mL的離心管中，分別加入200 μL的裂解緩沖液(質量分數(shù)2% SDS，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA，0.5 mol/L Tris，pH 8.0)、200 μL NaH2PO4和10 μL的蛋白酶K，置于恒溫混勻儀中1 500 r/min、65 ℃加熱60 min。然后，離心管14 000g離心5 min，取上清液至新的1.5 mL離心管中，并加入0.5倍體積的乙酸鈉(4 mol/L，pH 8.2)，混勻后14 000g離心5 min，取上清液至新的離心管并重復該步驟。最后，向離心管中加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后靜置10 min，14 000g離心10 min去上清液，并用70%乙醇和100%無水乙醇分別清洗DNA 2次和1次，65 ℃烘箱烘干。每個樣品設2個平行。

表1 樣品信息

用核酸蛋白測定儀測定DNA在230、260和280 nm處吸光值，并分別計算其濃度和純度。用1%瓊脂糖凝膠進行總DNA電泳。所有DNA樣品于-20 ℃保藏。

本報訊日前，農業(yè)農村部決定在部分具備條件的縣（市、區(qū)）開展農民專業(yè)合作社質量提升整縣推進試點?！掇r業(yè)農村部辦公廳關于組織申報農民專業(yè)合作社質量提升整縣推進試點有關事項的通知》提出，試點縣（市、區(qū)）農民合作社規(guī)模和農戶覆蓋面明顯擴大，示范社建設深入實施。合作社運行管理制度健全，組織機構運轉有效，民主管理水平不斷提高，財務社務管理公開透明，經濟實力、發(fā)展活力和帶動能力明顯增強，成員權益得到切實保障。力爭試點縣（市、區(qū)）農民專業(yè)合作社年報公示率達80%以上，80%以上的合作社建立完備的成員賬戶、實行社務公開、依法進行盈余分配。試點為期2年，自2018年8月至2020年底。

1.2.2 PCR擴增

采用通用引物擴增序列，引物序列見表2。

表2 擴增引物序列

PCR反應體系為20 μL：10×Reaction Buffer(含有15 mmol/L MgCl2)2 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1 μL，BioReady rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，引物(10 μmol/L)各0.25 μL，DNA模板1 μL，滅菌超純水12.5 μL。

PCR反應程序：94 ℃預變性2 min，35個循環(huán)(94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min)，72 ℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產物測序與序列分析

PCR擴增完成后，以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，挑選擴增成功且條帶單一的產物送南京金斯瑞生物科技有限公司進行雙向測序。

采用BioEdit軟件對測序所得的峰圖進行校對拼接，去除正反向引物和低質量的序列后，提交至BOLD(http://boldsystems.org/index.php/IDS_OpenId Engine)和GenBank(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)數(shù)據(jù)庫比對分析。數(shù)據(jù)庫中與未知序列相似度≥98%的品種即為目標物種[12]。根據(jù)序列相似度比較的結果(相似度≥98%[12])，確認各樣品的物種類別。

對于只可鑒定到屬的樣品，在GenBank中下載對應屬的所有序列，并刪去重復序列。將下載的序列用來自Handy等[11]的DNA條形碼片段在BioEdit軟件中比對，去除正反向引物和低質量的序列后，再將所得序列通過MEGA 7.1軟件進行基于Kimura 2-parameter(K2P)模型的種內和種間遺傳距離分析。

2 結果與討論

2.1 DNA濃度及質量

所有127份樣品均可以成功提取總DNA。DNA的質量濃度為73.19～1 406.83 ng/μL，均值為483.20 ng/μL。所有DNA樣品的A260/A280為1.8～2.0?？侱NA電泳圖顯示所有樣品均未發(fā)生明顯降解。

本研究采用的DNA提取方法為改良鹽析法[10]，該方法把傳統(tǒng)的肌肉組織裂解時間縮短至60 min，并通過NaCl濃度的變化使DNA析出。前人研究結果已證實該方法可以成功從新鮮魚肉樣品、壽司、烤鱈魚產品以及魚罐頭產品中提取總DNA[5,8-10]。本研究中的所有樣品DNA均具有較高濃度和質量，再一次證明該方法的可靠性。

2.2 PCR擴增與測序

對PCR產物進行電泳分析，發(fā)現(xiàn)除DNA提取空白和加樣空白對照外，所有127份樣品DNA均在750 bp左右有單一的目標條帶(圖1)。所有127份樣品均成功測序。去除正反向引物(約88 bp)和低質量的序列后，片段長度為646～653 bp，平均長度為649 bp。

1～22—S1～S22；23—陽性對照；24—陰性對照；M—DL1000 DNA Marker圖1 部分樣品PCR產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis of partial PCR products

2.3 序列比對分析

GenBank是美國國家生物技術信息中心(NCBI)建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫，可保存所有序列的相關記錄。BOLD數(shù)據(jù)庫是保存來自DNA指定區(qū)域的條形碼片段，旨在建立一個所有真核生物的條形碼庫，包括鳥類、魚類和鱗翅類等。物種鑒定時，用BLAST程序對GenBank數(shù)據(jù)庫進行未知序列的同源性搜索，或者將測序獲得的條形碼序列粘貼到BOLD網(wǎng)站窗口中，數(shù)據(jù)庫中與未知序列相似度≥98%的品種即為目標物種[12]。

GenBank和BOLD數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)所有樣品均可以獲得相似度>98%[12]的對應物種(表3)。對于GenBank數(shù)據(jù)庫，樣品在種水平和屬水平鑒定成功率分別為38.10%(16/42)和40.48%(17/42)；對于BOLD數(shù)據(jù)庫，則對應分別為35.71%(15/42)和47.62%(20/42)，可見BOLD與GenBank數(shù)據(jù)庫在種和屬水平鑒定成功率基本相同。綜合2個數(shù)據(jù)庫的結果，樣品在種和屬水平鑒定成功率分別為40.48%(17/42)和50.00%(21/42)，即9.52%(4/42)的樣品無法在種屬水平進行鑒定，表明DNA條形碼技術對我國市場常見魚肉樣品的物種鑒定具有一定的可行性。

其中，GenBank和BOLD均可以準確鑒定至同一物種的有14種樣品，分別是小黃魚(S20～S26，Larimichthyscrocea)、海鱸魚(S32～S36，Lateolabraxjaponicus)、多寶魚(S37～S41，Scophthalmusmaximus)、鮮池蛋魚(S54～S57，Planilizahaematocheila)、刀鯧(S72～S76，Menemaculata)、虎頭鯊(S77～S78，Odontobutispotamophila)、黑魚(S79～S81，Channaargus)、南極犬牙魚(S112，Dissostichusmawsoni)、加州鱸魚(S115，Micropterussalmoides)、清江魚(S118，Ictaluruspunctatus)、鱸魚(S126，Micropterussalmoides)、黃顙魚(S127，Tachysurusfulvidraco)、金目鱸魚(S124，Lateolabraxjaponicus)和紅古魚(S42～S47，Sciaenopsocellatus)?；?S119)和青鰻(S121)在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對均可得唯一的物種，分別是Hypophthalmichthynobilis和Congerjaponicus；而在BOLD數(shù)據(jù)庫中比對，花鰱與H.nobilis和H.molitrix的相似度均大于98%，青鰻與C.myriaster和Muraenesoxcinereus的相似度均大于98%。秋刀魚(S63～S67)在BOLD數(shù)據(jù)庫中比對均可得唯一的物種是Cololabissaira；而在GenBank數(shù)據(jù)庫比對中，其與C.saira、Cololabissp.和Scomberesoxsaurus的相似度均大于98%(表3)。

只能鑒定到屬的21種樣品分別為野生鯽魚(S5～S10，Carassius)、刀魚(S11～S15，Coilia)、金鯧魚(S27～S31，Trachinotus)、白鯧魚(S48～S53，Pampus)、青占魚(S68～S71，Scomber)、鳀魚(S125，Scomber)、鱖魚(S82～S83，Siniperca)、太湖銀魚(S90～S99，Neosalanx)、南極冰魚(S100～S103，Patagonotothen)、冰魚(S104～S105，Patagonotothen)、帶魚(S122，Trichiurus)、小魚(S84～S89，Chanodichthys)、白魚(S123，Chanodichthys)、河豚魚(S110，Takifugu)、石斑魚(S116，Epinephelus)、鮰魚(S117，Tachysurus)、紅石斑魚(S106～S108，Helicolenus)、江魚(S16～S19，Cirrhinus)、鯽魚(S1～S4，Cyprinus)、鯉魚(S109，Cyprinus)和金線魚(S58～S62，Nemipterus)。紅石斑魚只可在GenBank數(shù)據(jù)庫中鑒定到屬，而江魚、鯽魚、鯉魚和金線魚只可在BOLD數(shù)據(jù)庫中鑒定到屬(表3)。

最后，4種樣品在GenBank和BOLD數(shù)據(jù)庫均無法鑒定到屬，分別為金槍魚(S111)、巴沙魚(S113)、鱈魚(S114)和草魚(S120)。

事實上，由于BOLD和GenBank數(shù)據(jù)庫均為開放平臺，所有研究者均可提交序列，且數(shù)據(jù)庫自身并不會核對提交物種序列，因此，并不是所有提交至數(shù)據(jù)庫的序列都標有對應的物種拉丁學名，有些僅標注屬名或科名，甚至只是做一個簡單的描述[13]。本研究中，巴沙魚(S113)在GenBank數(shù)據(jù)庫比對中與Fish environmental sample相似度>98%。類似的問題前人也有報道，如Carvalho等[14]對巴西市場進行研究，發(fā)現(xiàn)種水平鑒定成功率為78.4%?？赡艿脑虬ǎ孩傧鄬ξ锓N數(shù)量而言，數(shù)據(jù)庫中有標準序列的物種數(shù)太少；②挑選的COI條形碼片段種內種間遺傳距離較大，無法滿足鑒定相近屬間的要求。

2.4 標簽真實性評價

食品標簽是傳遞產品信息的重要載體。如何規(guī)范食品標簽，防止食品欺詐，保護消費者合法權益，已經成為保障食品安全的重要組成部分。我國《食品安全法》《食品標識管理規(guī)定》和GB 7718—2011《預包裝食品標簽通則》等相關法律法規(guī)均要求規(guī)范食品標簽，防止食品欺詐。但是我國并未建立具體針對水產品標簽以及水產品俗名的規(guī)范使用的相關法律法規(guī)。一些商販由于缺少基本的魚類分類知識，濫用魚類俗名，給市場帶來巨大的混亂。

表3 GenBank和BOLD數(shù)據(jù)庫中的鑒定結果

在本研究中，對于預包裝冷凍魚肉樣品(13種)，只有南極犬牙魚、巴沙魚和鱈魚同時標注有拉丁學名，分別為Dissostichusmawsoni、Pangasiushypophthalmus和Albatrossiapectoralis(表1),結果發(fā)現(xiàn):僅南極犬牙魚(S112)可以鑒定至物種水平，且鑒定結果與標簽標注的物種一致；而巴沙魚和鱈魚的鑒定結果分別包含Pangasiushypophthalmus和Albatrossiapectoralis的多個來自不同屬的物種，無法判定標簽的正確與否;剩余的10種冷凍魚肉樣品均僅標注中文俗名。由于我國并未建立相關制度來規(guī)范水產品俗名的使用，其標簽真實性無法評判。對于新鮮整魚樣品(29種)，均只標注中文俗名。只有15種可以準確鑒定到種水平，且除小黃魚外，其他14種均與形態(tài)學鑒定結果一致。

魚類俗名的濫用容易讓消費者產生誤解，如本研究中發(fā)現(xiàn)的用“鱸魚”來標記Micropterussalmoides和用“海鱸魚”及“金目鱸魚”來標記Lateolabraxjaponicus。事實上，鱸魚是指包含一大類魚品種的統(tǒng)稱，M.salmoides和L.japonicus都是我國市場上常見的鱸魚品種。M.salmoides屬于鱸形目、太陽魚科、黑鱸屬，原產于北美，20世紀80年代被引進我國。Fishbase登記的俗名為“大口黑鱸”和“似鮭赫羅魚”。中文網(wǎng)站可以檢索到M.salmoides的俗名包括“加州鱸魚”。L.japonicus屬于鱸形目鮨科花鱸屬。Fishbase登記的俗名為“石斑”“過魚”“花鱸”和“日本真鱸魚”，但是中文網(wǎng)站可以檢索到L.japonicus和Percafluviatilis(鱸形目河鱸科鱸屬)的俗名均包括“海鱸魚”。

魚類俗名的濫用也給摻假制假者帶來了可乘之機。如Carvalho等[14]指出，由于使用那些可以代表多個品種的俗名，巴西市場上17.3%的魚肉制品發(fā)生品種摻假。而在我國臺灣地區(qū)，Chang等[13]發(fā)現(xiàn)市場上因濫用魚類俗名導致的魚肉制品摻假率高達70%。在本研究中，雖然由于相關標準的缺失，大部分樣品均無法判定是否摻假，但小黃魚被鑒定為Larimichthyscrocea，與形態(tài)學鑒定不一致。

3 結論

首次利用DNA條形碼技術對江蘇市場上常見的魚肉樣品進行物種鑒定,結果表明:GenBank和BOLD數(shù)據(jù)庫比對中所有樣品均可以獲得相似度大于98%的對應物種;種和屬水平的最大鑒定成功率分別為40.48%(17/42)和50.00%(21/42)，表明DNA條形碼技術對我國市場常見魚肉樣品的物種鑒定具有一定的可行性。

在采集的13種(36份)預包裝冷凍魚肉樣品中，3種樣品(S112、S113、S114)標注有物種拉丁學名，S113、S114皆鑒定出兩個屬，只有S112可以準確鑒定到種水平，且鑒定結果與標注的物種名一致。而29種(91份)新鮮魚樣品均僅標注中文俗名，有1種樣品鑒定結果(S20～S26，小黃魚)與形態(tài)學鑒定結果(Larimichthyspolyactis)不一致。

從本次研究結果看，江蘇市場上存在魚肉樣品的物種摻假情況。水產品物種摻假不僅侵害了消費者的經濟利益，而且誤標的水產品會使消費者誤食含有過敏原或者有毒的商品，這也會對消費者的健康安全造成威脅。因此，為防止由俗名濫用導致水產品摻假，建立我國水產品標簽以及水產品俗名使用的相關法律法規(guī)迫在眉睫。