腫瘤壞死因子α在大腸桿菌周質空間中的表達

武玉露，夏玲珍，王佳玲，成 騁，何冰芳,

(1. 南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800； 2. 臺州市中心醫(yī)院(臺州學院附屬醫(yī)院),浙江 臺州 318000； 3. 南京工業(yè)大學 藥學院，江蘇 南京 211800)

腫瘤壞死因子α(TNFα)最初被鑒定為導致小鼠中可移植腫瘤快速壞死的因子，現(xiàn)在它被認為是參與先天免疫應答和炎癥反應的多功能細胞因子[1-2]。TNFα發(fā)揮許多重要的生理和病理作用:TNFα通過與腫瘤細胞表面的TNFα受體結合而引起腫瘤細胞壞死和細胞凋亡；TNFα是急性和慢性系統(tǒng)性炎癥反應的關鍵介質，TNFα不僅誘導其自身分泌，而且還刺激其他炎性細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[3]。此外，TNFα在自身免疫疾病中起重要作用，例如類風濕性關節(jié)炎、炎性腸病(包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎)、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥[4]。TNFα已成為腫瘤發(fā)生，腫瘤增殖、侵襲和轉移的重要危險因素，是癌癥相關慢性炎癥的關鍵中介。因此，TNFα是一種具有潛力的應用于抗腫瘤、抗病毒以及免疫調節(jié)的生物制劑[5-6]。大腸桿菌(E.coli)[7-10]、畢赤酵母(Pichiapastoris)[11]和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)[12-13]等表達系統(tǒng)已經(jīng)應用于重組TNFα的表達研究。在這些表達系統(tǒng)中，大腸桿菌是重組TNFα生產(chǎn)的主要宿主，因其具有遺傳背景清晰、生長周期短、操作簡便、培養(yǎng)成本低、表達系統(tǒng)成熟穩(wěn)定等優(yōu)勢[14]。但外源蛋白在大腸桿菌細胞質中的表達存在一些問題：在細胞質中存在大量雜蛋白質而導致后續(xù)純化工藝的復雜性與產(chǎn)量的降低[15]；過表達可導致包涵體的形成[16]，而包涵體體外復性可能會帶入一些復性劑對活性的影響。

大腸桿菌的內外膜雙層膜結構之間的區(qū)域即所謂的周質空間。E.coli的細胞周質中含有一系列氧化還原酶及二硫鍵異構酶，生物體獨特的氧化還原環(huán)境有利于二硫鍵的正確形成，幫助蛋白正確折疊，提高活性蛋白的表達水平；與細胞質中相比，周質空間的蛋白酶活性更低，可減少目的蛋白的胞內降解從而使其穩(wěn)定存在。利用定向釋放技術釋放周質蛋白，使細胞外膜破損而不損害細胞內膜，可減少宿主菌蛋白的污染，簡化重組蛋白下游純化工藝[15]。

在大腸桿菌中實現(xiàn)外源蛋白可溶性表達的常用工具和有效手段是融合標簽技術，主要是將其與目的蛋白基因連接以介導目的蛋白的可溶性表達和純化。本課題組篩選到來源于阿氏節(jié)桿菌(Arthrobacterarilaitensis)NJEM01的β-呋喃果糖苷酶(β-Ffase)，該酶在大腸桿菌中能夠高效分泌表達，N末端含有53個氨基酸殘基組成的自身信號肽，具有強的折疊和分泌能力等特性。課題組前期工作中將其高度可溶且穩(wěn)定的截短體開發(fā)成一種新型的融合標簽Ffu，Cheng等[17]利用該融合標簽融合一些難以表達的外源蛋白在大腸桿菌中實現(xiàn)可溶性表達甚至胞外表達。

本研究的目的是篩選幾種融合標簽Ffu與目標蛋白TNFα形成重組蛋白，介導TNFα分泌至大腸桿菌周質空間中。另選取兩種常用的增溶性融合標簽MBP和NusA用來評估Ffu標簽的增溶效果；通過對誘導表達條件的優(yōu)化來提高重組蛋白Ffu-TNFα的可溶性和產(chǎn)量，采用滲透壓休克和溶菌酶法研究Ffu標簽介導TNFα在大腸桿菌中異源表達的細胞定位，采用Western blotting和MTT 法檢測重組蛋白Ffu-TNFα的抗原性和細胞毒活性，以期獲得高效可溶性表達且具有生物活性的重組腫瘤壞死因子α。

1 材料與方法

1.1 材料

表達載體pFfu、表達菌株E.coliBL21(DE3)、小鼠成纖維癌細胞L929，何冰芳教授實驗室保存。

各種內切酶、T4連接酶，TaKaRa公司；DNA回收、質粒提取試劑盒，Axygen公司；Anti-TNF alpha鼠源單抗，Proteintech(武漢)公司；HRP2羊抗鼠抗體，正能公司。

PCR引物及編碼人TNFα的基因均由金唯智生物科技有限公司(蘇州)合成。

1.2 方法

1.2.1 重組表達質粒的構建

以構建好的包含新型融合標簽Ffu的質粒pFfu用于表達人源TNFα。將全基因合成的人源TNFα(構建在pUC57質粒中)作為模板進行PCR擴增。含有不同融合標簽的質粒pFfu209和pFfu217用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，膠回收并純化擴增后的目的片段及質粒載體基因片段，以T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉入宿主菌E.coliBL21(DE3)中，在含有卡那霉素(50 mg/mL)的LB瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)過夜。隨機挑取重組子進行菌落PCR驗證，將陽性重組子測序。所涉及的相關實驗操作方法參照文獻[18]。

1.2.2 融合標簽的選擇及重組蛋白的誘導表達優(yōu)化

將含有表達載體pFfu209-TNFα、pFfu217-TNFα的重組菌，接種至含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。以2%(體積分數(shù))的接種量轉接于新鮮含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)90 min，當OD600為0.6～0.8時加0.5 mmol/L IPTG，25 ℃誘導表達6 h。收集菌體，在1 mmol/L PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)、20 mmol/L Tris-HCl緩沖(pH8.0)中超聲破碎，用冷凍離心機(5424R型，Eppendorf公司)離心(12 000 r/min，20 min，4 ℃)，收集破碎上清及破碎沉淀，SDS-PAGE分析表達結果。分析各標簽對TNFα的增溶效果，選擇表達效果較好的重組蛋白，分別從誘導劑濃度、誘導表達溫度以及誘導時間上進行優(yōu)化。分析重組蛋白的表達情況，以得到較優(yōu)的表達條件。

1.2.3 重組蛋白的細胞定位

分別應用滲透壓休克法和溶菌酶法定向釋放大腸桿菌周質蛋白。滲透壓休克法是參照文獻[19]的方法將培養(yǎng)物分離成周質和細胞質部分。取1 mL發(fā)酵液12 000 r/min，離心2 min，得菌體；用1 mL高滲緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA，質量分數(shù)20%的蔗糖，pH 9.0)重懸菌體，室溫放置30 min，離心棄上清，再加入1 mL低滲緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，冰上放置20 min，離心，所得上清即為周質蛋白。

溶菌酶法是根據(jù)French等[20]的方法將1 mL培養(yǎng)物以3 000g離心20 min，將沉淀重懸于1 mL破碎緩沖溶液(0.5 mg/mL的雞蛋清溶菌酶、200 mmol/L Tris、500 mmol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA，pH 8.0)中?；鞈乙罕戏胖?5 min，15 000g離心30 min，所得上清即為周質空間中的蛋白。

1.2.4 重組蛋白的純化

通過軟件ExPASY在線預測重組蛋白Ffu209-TNFα的理論pI值約為5.64，使用DEAE-sepharose FF柱聯(lián)合AKTA Prime Plus System(GE Healthcare Life Science Inc.)進行陰離子交換色譜層析。選擇pH為6.5的平衡緩沖與洗脫緩沖液。固相載體用平衡緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4，pH 6.5)平衡，將5 mL蛋白樣品以0.5 mL/min的流速加入，再平衡；洗脫緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4、1 mol/L NaCl，pH 6.5)以1 mL/min的流速在不同NaCl濃度下進行梯度洗脫。收集各梯度濃度的洗脫液，進行12%SDS-PAGE電泳，確定目的蛋白洗脫時所需的鹽濃度。透析法除鹽，選用合適分子量的透析袋，20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)作為置換緩沖，4℃透析過夜。BCA(bicinchoninic acid)法測定蛋白濃度。

1.2.5 Western blotting鑒定重組蛋白的免疫原性

將純化得到的重組蛋白Ffu209-TNFα在12% SDS-PAGE 上分離，并轉印到PVDF膜上。轉印結束后將膜在5%脫脂牛奶中室溫振搖封閉 1 h。將膜加到用封閉液稀釋的抗TNFα一抗溶液中4 ℃孵育過夜，TBST (TBS+Tween)洗滌 3 遍(每次10 min)后加入 HRP 標記的二抗(用封閉液稀釋)，室溫孵育 2 h，TBST 洗滌3遍(每次10 min)。將膜上水分吸干，加入顯色液，用增強化學發(fā)光(ECL)檢測系統(tǒng)(GE Healthcare Life Science Inc)顯影。

1.2.6 重組蛋白Ffu209-TNFα的體外細胞毒活性

L929細胞于DMEM-10%(體積分數(shù))FBS，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。將 L929 細胞傳于96孔板(105個/孔)，37 ℃、5% CO2貼壁生長24 h后小心棄培養(yǎng)基，每孔加入100 mL待測樣品，樣品溶于含放線菌素D的DMEM-10%FBS(放線菌素D的終質量濃度為1 μg/mL)，每個樣品設5個平行點，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)18 h。每孔加入20 μL MTT (5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。小心棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床上低速混勻。測定490 nm處的A490值。細胞存活率計算見式(1)。

細胞存活率=[(A490Ffu-TNFα-A490空白)/
(A490對照-A490空白)]×100%

(1)

2 結果與討論

2.1 融合蛋白重組質粒的構建

為了設計合適片段長度的Ffu標簽利于融合表達載體的構建，不同長度Ffase截短體的可溶性進行了預測使用了修正后的Wilkinson和Harrison法[17]，根據(jù)Ffase截短體的氨基酸序列、蛋白分子量和等電點信息，預測了相應的Ffase截短體蛋白可溶性數(shù)據(jù)?；谠咏?jīng)濟性原則，結合初步的截短體可溶性驗證實驗結果，選擇了分子量大小適中，可溶性高的β-FFase截短體，即Ffu209和Ffu217，融合標簽Ffu209、Ffu217的部分特征分析見表1。由表1可知：截短體Ffu209和Ffu217的親水性平均值(GRAVY)較低，表明它們具有較高的親水性。MBP和NusA是最常用來提高融合蛋白溶解度且增溶性較好的融合標簽。相比較于MBP和NusA而言,Ffu融合標簽具有分子量適中、親水性較強并且自身具有極好的可溶性且穩(wěn)定等特性。由此可見Ffu標簽的這些特征使其有望開發(fā)成很有潛力的融合標簽。本研究中，選擇MBP和NusA作為對照組來比較Ffu融合標簽的增溶能力。

表1 Ffu融合標簽的特征

將全基因合成的人源TNFα與含有不同融合標簽的質粒pFfu209、pFfu217、pMAL-MBP和pET/NusA酶切后，用T4 DNA連接酶連接，得到重組質粒pFfu209-TNFα、pFfu217-TNFα、pMAL-MBP-TNFα和pET/NusA-TNFα，進行PCR鑒定，結果見圖1。由圖1可知：pFfu重組子基因長度分別是1 400、1 500 bp左右，與理論值一致；pMAL-MBP-TNFα和pET/NusA-TNFα使用對應引物顯示目的基因長度為700 bp左右。重組子的陽性單菌落經(jīng)測序后結果顯示目的基因成功地克隆到表達載體中。結果表明成功構建了融合表達TNFα的重組菌E.coliBL21(DE3)/pFfu209-TNFα、E.coliBL21(DE3)/pFfu217-TNFα、E.coliBL21(DE3)/pMAL-MBP-TNFα和E.coliBL21(DE3)/pET/NusA-TNFα。

(a)：1～3—重組子pFfu209-TNFα,4～6—重組子pFfu217-TNFα；(b)：1～3—重組子pMAL-MBP-TNFα,4～6—重組子pET/NusA-TNFα。M—標準DNA圖1 重組子菌落的鑒定Fig.1 Identification of recombinant colonies

2.2 重組融合蛋白的選擇

pFfu209-TNFα、pFfu217-TNFα、pMAL-MBP-TNFα和pET/NusA-TNFα重組表達載體，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導、25 ℃培養(yǎng)6 h后分別分析細胞破碎液上清液(可溶性)以及細胞破碎液沉淀(包涵體)，結果如圖2所示。

M—標準蛋白；S—可溶性組分；ib—包涵體沉淀圖2 融合標簽對TNFα在大腸桿菌中表達的影響Fig.2 Effect of fusion tags on the expression of TNFα in E. coli

由圖2可見：所選的2種Ffu融合標簽分別介導TNFα在大腸桿菌中成功表達且不同程度地提高了TNFα的可溶性表達；相對而言，F(xiàn)fu209標簽對TNFα的增溶效果較好且表達量高，幾乎沒有包涵體產(chǎn)生；MBP標簽在提高融合蛋白的可溶性同時會產(chǎn)生較多的包涵體；NusA標簽在提高TNFα總體表達水平上也較有效。然而，分子量較大的融合標簽對細胞產(chǎn)生更大的代謝負擔，而且可能會導致對融合蛋白可溶性和總體表達量過于樂觀的評估[21-22]。NusA標簽分子量大小為5.45×104，F(xiàn)fu209標簽的分子量為1.76×104，約為NusA分子量的1/3。因此，F(xiàn)fu209標簽對細胞的代謝負擔遠低于NusA。同時，考慮到原子經(jīng)濟學原則，故選取Ffu209作為融合標簽進行誘導表達條件的優(yōu)化以得到更多的可溶性重組蛋白。

2.3 重組蛋白Ffu209-TNFα的誘導表達優(yōu)化

對誘導溫度、IPTG的濃度、IPTG與乳糖聯(lián)合誘導以及誘導時間等條件進行優(yōu)化，結果如圖3所示。由圖3可知：重組蛋白Ffu209-TNFα在20 ℃、IPTG濃度為0.3 mmol/L、乳糖為1 g/L條件下聯(lián)合誘導，發(fā)酵24 h時，表達效果較優(yōu)。

SDS-PAGE分析該條件下重組蛋白的表達情況，結果見圖4。由圖4可知：利用灰度掃描計算重組蛋白Ffu209-TNFα占總蛋白表達量的76%左右，其中可溶性組分占89%左右。此外，還可發(fā)現(xiàn)破碎上清與破碎沉淀中的目標蛋白存在分子量上的高度差，這可能是由于融合標簽Ffu的N末端含有一段53個氨基酸殘基的自身信號肽，在重組蛋白分泌至周質空間表達時被剪切，由此產(chǎn)生了分子量的差異。

圖3 不同誘導條件對應重組蛋白Ffu209-TNFα的表達量和可溶性比例Fig.3 Different induction conditions correspond to the expression level and soluble ratio of the recombinant protein Ffu209-TNFα

2.4 重組蛋白Ffu209-TNFα的細胞定位

分別采用滲透壓休克和溶菌酶法定向釋放大腸桿菌周質空間蛋白，并以超聲破碎樣品為對照，結果見圖5。由圖5可知：滲透壓休克法和溶菌酶法均可釋放出目標蛋白，證明融合標簽Ffu可以幫助TNFα實現(xiàn)可溶性甚至周質空間分泌表達。兩種方法提取的周質空間蛋白中雜蛋白數(shù)量比超聲破碎中的雜蛋白低了一個數(shù)量級，并且溶菌酶法提取的雜蛋白量更少，故在后續(xù)大量釋放周質蛋白選取溶菌酶法，溶菌酶可以在下一步純化中除去。由此可知，使用新型融合標簽Ffu可以基于質粒pET的表達系統(tǒng)將TNFα分泌至大腸桿菌周質中。TNFα含有2個半胱氨酸可以形成1個分子內二硫鍵，周質空間中含有一系列氧化還原酶及二硫鍵異構酶可以幫助二硫鍵正確折疊而更易獲得有生物活性的重組蛋白。

M—標準蛋白；1—0.3 mmol/LIPTG誘導24 h后超聲破碎上清；2—超聲破碎沉淀圖4 SDS-PAGE分析重組蛋白在大腸桿菌中表達Fig.4 Analysis of recombinant protein expression in Escherichia coli by SDS-PAGE

M—標準蛋白；1—超聲破碎上清；2—溶菌酶法；3—滲透壓休克法圖5 SDS-PAGE分析不同方法提取周質蛋白Fig.5 SDS-PAGE analysis of different methods for extracting periplasmic proteins

2.5 重組蛋白的純化

將提取的周質空間蛋白在陰離子交換色譜層析柱中分離，利用不同濃度的NaCl進行梯度洗脫，當NaCl濃度為200 mmol/L時，目的蛋白被洗脫下來，結果如圖6所示。由圖6可知：獲得電泳純的重組融合蛋白Ffu209-TNFα，且灰度掃描得其純度達95%左右。BCA法測定純化后的重組蛋白濃度，計算得重組蛋白分泌到周質空間中的產(chǎn)量達12 mg/L。已有多種融合標簽應用于幫助TNFα在大腸桿菌中高效表達，例如：Osaki等[7]構建了抗體-細胞因子融合蛋白(Ia1-TNFa)，在大腸桿菌表達系統(tǒng)以可溶形式產(chǎn)生，產(chǎn)量達2 mg/L；Ma等[8]制備了由ACDCRGDCFCG肽融合TNFα組成的RGD-hTNFα，從大腸桿菌發(fā)酵菌體中獲得約18 mg/L的RGD-hTNFα；Dai等[23]構建重組GST-TNFα融合蛋白原核表達載體，產(chǎn)量為0.466 mg/g。由此可見，融合標簽Ffu可以幫助TNFα實現(xiàn)在大腸桿菌周質空間中以較高表達量來表達。

M—標準蛋白；1—周質蛋白；2—200 mmol/L NaCl的洗脫峰圖6 SDS-PAGE分析陰離子交換色譜純化周質中 重組Ffu209-TNFα Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant Ffu209-TNFα in the periplasm by anion exchange chromatography

2.6 Western blotting鑒定重組蛋白的免疫原性

為了確認重組TNFα的性質，使用抗TNFα抗體進行蛋白質印跡分析，結果見圖7。由圖7可知：周質空間蛋白組分中及純化洗脫峰中均有蛋白與抗TNFα抗體反應，顯示的位置條帶大小與重組蛋白Ffu209-TNFα的預期值一致，結果說明利用融合標簽Ffu在大腸桿菌中實現(xiàn)了Ffu209-TNFα的周質空間分泌表達，且陰離子交換色譜成功純化出重組Ffu209-TNFα。

M—標準蛋白；1—周質組分Ffu209-TNFα；2—純化后的Ffu209-TNFα圖7 Western blotting鑒定重組蛋白Ffu209-TNFα的 免疫原性Fig.7 Immunogenicity of the recombinant protein Ffu209-TNFα was identified by Western blotting

2.7 重組蛋白Ffu209-TNFα的生物學活性

用L929小鼠成纖維細胞通過測定重組蛋白Ffu209-TNFα的體外細胞毒活性，結果見圖8。以濃度值(以對數(shù)表示)作為自變量，細胞存活率作為因變量，并以50%的細胞毒活性作為活性單位(U)，計算得重組Ffu209-TNFα的體外細胞毒活性為3.47×105U/mg。由圖8可以看出：重組蛋白Ffu209-TNFα對L929細胞具有致死活性，并且致死率與Ffu209-TNFα濃度呈量效關系。在本研究中，周質TNFα是可溶的，且具有生物活性。因此，融合標簽Ffu209對TNFα的活性不具有明顯影響。Ma等[8]制備了由ACDCRGDCFCG肽融合人TNFα組成的RGD-hTNFhTNFα與RGD-hTNFα的體外比酶活分別為2.45×107和 4.15×107U/mg。Osaki等[7]構建了抗體-細胞因子融合蛋白(Ia1-TNFa)，其生物活性比TNFα自身低7倍左右。Dai等[23]構建重組GST-TNFα融合蛋白原核表達載體，細胞毒活性為1.82×105U/mg。Tsukamoto等[24]使用Trx A硫氧還蛋白在大腸桿菌中表達TNFα重組蛋白，重組TNFα的EC50為0.19 pmol/L。盡管我們已經(jīng)利用融合標簽Ffu實現(xiàn)了TNFα在大腸桿菌周質空間中有活性的表達，但是與標準TNFα蛋白相比其活性有所降低，可能是融合標簽的存在影響到目標蛋白的結構功能與生物活性。融合標簽Ffu存在一定的局限性，標簽分子量較大，對較小分子量的蛋白活性可能會有一定的影響。

圖8 重組蛋白Ffu209-TNFα對L929的細胞毒活性(n=5)Fig.8 Cytotoxic activity of recombinant protein Ffu209-TNFα against L929 (n=5)

3 結論

利用新型標簽Ffu得到了一個可以成功將TNFα高效可溶性表達分泌至大腸桿菌周質空間中的系統(tǒng)，經(jīng)過誘導條件的優(yōu)化，重組蛋白Ffu209-TNFα表達量占總蛋白表達量的76%左右，其中可溶性組分占89%左右，分泌至周質空間表達量達到12 mg/L。對重組蛋白的免疫原性及生物活性進行鑒定與檢測，表明融合標簽Ffu對周質的TNFα的正確折疊具有適當?shù)拇龠M作用。為一些生物活性蛋白，尤其是含二硫鍵的活性蛋白，在大腸桿菌周質空間表達提供了一個新的工具。