基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的肉桂治療腰椎間盤突出癥分子機制研究

海云翔　宋敏　楊秀娟　田杰祥

【摘 要】目的：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究肉桂治療腰椎間盤突出癥的分子作用機制及關(guān)鍵靶點。

方法：從藥物和疾病兩個角度出發(fā)，通過TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫收集肉桂化學(xué)成分，根據(jù)閾值篩選有效活性成分并預(yù)測其作用靶點，構(gòu)建“肉桂活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。GenCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索腰椎間盤突出癥相關(guān)基因，建立“疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)，將藥物靶點與疾病靶點相互映射，并對映射所得到的關(guān)鍵靶點進行DAVID分析，構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果：獲得肉桂主要化學(xué)成分105個，篩選去重匯總后得到15個有效活性成分及藥物靶蛋白74個;腰椎間盤突出癥相關(guān)基因309個，藥物靶點與疾病靶點映射后獲得尿激酶型纖溶酶原激活劑、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶、超氧化物歧化酶1等8個共有靶點。GO富集分析確定了13個條目，主要包括細胞外區(qū)域、細胞外間隙等細胞成分，蛋白同源二聚化活動、蛋白結(jié)合等分子功能，一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、細胞對三磷酸腺苷的反應(yīng)、細胞遷移正調(diào)控等生物過程。KEGG通路富集分析確定了4條相關(guān)信號通路，主要有核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路、脂肪細胞脂解調(diào)節(jié)信號通路等，涉及炎癥、代謝、免疫等。結(jié)論：肉桂通過多途徑、多靶點發(fā)揮治療腰椎間盤突出癥的作用，該研究初步探討了其作用所涉及的關(guān)鍵靶點、生物學(xué)過程及信號通路，為進一步開展肉桂治療腰椎間盤突出癥的分子生物學(xué)實驗驗證提供了參考和依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 腰椎間盤突出癥;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);肉桂;分子機制;信號通路

Molecular Mechanism of Cinnamon Bark in the Treatment of Lumbar Disc Herniation Based on Network Pharmacology

HAI Yun-xiang，SONG Min，YANG Xiu-juan，TIAN Jie-xiang

【ABSTRACT】Objective：To explore the molecular mechanism and key targets of cinnamon bark in the treatment of lumbar disc herniation by network pharmacology.Methods：From the perspectives of drugs and diseases，the chemical components of cinnamon bark were collected through databases TCMSP and TCMID，and the active components were screened according to the threshold value and their targets were predicted to construct the "cinnamon active components-target" network.Databases GenCards and OMIM were used to search the genes related to lumbar disc herniation to establish the "disease-target" network，mapping the drug targets and disease targets，and conducting DAVID analysis on the key targets obtained from the mapping to construct the "component-target-pathway" network.Results：One hundred and five main chemical components of cinnamon bark were obtained，15 active components and 74 drug target proteins were obtained after screening，309 genes related to lumbar disc herniation were obtained，and 8 common targets including urokinase type plasminogen activator，prostaglandin endoperoxidase and superoxide dismutase 1 were obtained after mapping drug targets and disease targets.Thirteen items were identified by GO enrichment analysis，mainly including cellular components such as extracellular region and extracellular space，molecular functions such as protein homodimerization，protein binding，positive regulation of nitric oxide biosynthesis，cell response to adenosine triphosphate，and positive regulation of cell migration.KEGG pathway enrichment analysis identified four related signaling pathways，including nuclear factor-κB signaling pathway，adipocyte lipolysis regulation signaling pathway，involving inflammation，metabolism，immunity and so on.

Conclusion：Cinnamon bark can play a role in the treatment of lumbar disc herniation through multiple ways and targets.This study preliminarily discussed the key targets，biological processes and signal pathways involved in its role，and provided reference and basis for further molecular biological experimental verification of cinnamon bark in the treatment of lumbar disc herniation.

【Keywords】 lumbar disc herniation;network pharmacology;cinnamon bark;molecular mechanism;signaling pathway

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是由各種原因?qū)е碌淖甸g盤退行性變，在外力因素下，以纖維環(huán)破裂、髓核從破裂口突出，刺激和壓迫馬尾神經(jīng)、腰神經(jīng)根、坐骨神經(jīng)而引起腰腿疼痛的臨床綜合征[1]。LDH為骨科常見病、多發(fā)病，是引起腰腿痛的最主要原因。研究統(tǒng)計，LDH好發(fā)于0～50歲人群，其中男女比例約為2∶1，在25～55歲人群中，95%的LDH發(fā)生在L4～5和L5～S1水平[2]。本病除與年齡增長退行性病變的發(fā)生相關(guān)外，還與性別、體質(zhì)量、職業(yè)、生活習(xí)慣等因素密切相關(guān)[3]。LDH屬中醫(yī)學(xué)“腰痛”“腰腿痛”“痹證”范疇?！端貑枴っ}要精微論篇》云：“腰者腎之府，轉(zhuǎn)搖不能，腎將憊矣?！薄吨T病源候論》云：“肝主筋而藏血，腎主骨而生髓?！笨梢奓DH的發(fā)生與“腎”有著密不可分的關(guān)系[4-5]。西醫(yī)學(xué)對LDH的發(fā)病機制主要以機械壓迫學(xué)說、化學(xué)炎癥反應(yīng)學(xué)說及自身免疫學(xué)說為主[6]。

肉桂為樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥樹皮，其性大熱，味辛、甘，歸腎、脾、心、肝經(jīng)，具有補火助陽、散寒止痛、溫通筋脈、引火歸元之效[7]，臨床治療LDH多以腎陽虛寒、寒凝血瘀等證為主，正如《本草綱目》記載肉桂“堅筋骨，通血脈，宜導(dǎo)百藥”。由于肉桂成分復(fù)雜，其治療LDH涉及機體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中多個生物過程和信號通路，單個成分對應(yīng)單個基因的研究方法已不適合闡明肉桂治療LDH的分子機制。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過建立活性成分-靶點-疾病的復(fù)雜可視化網(wǎng)絡(luò)，從而以多成分、多靶點角度闡釋肉桂治療LDH的分子機制，為進一步開展肉桂治療LDH的分子生物學(xué)實驗驗證提供參考和依據(jù)[8]。

1 資料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）、中藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID，http：//www.Megabionet.org/ tcmid/）收集肉桂化學(xué)成分;孟德爾疾病基因數(shù)據(jù)庫（OMIM，http：// www.omim.org/about）、人類基因數(shù)據(jù)庫（Gene Cards，http：//www.Genecards.Org/）收集LDH相關(guān)基因;Venny 2.1（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/cg-bin/liste/Venn/calculate_venn.htpl）軟件繪制“成分-靶點、疾病-靶點”韋恩圖，找出映射;采用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcr f.gov/）對獲得的共有靶點進行基因本體論（GO）功能富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析;Cytoscape 3.5.1軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)及數(shù)據(jù)分析。

1.2 肉桂主要化學(xué)活性成分篩選及靶點預(yù)測 TCSMP、TCMID數(shù)據(jù)庫搜集獲得肉桂所有化學(xué)成分，數(shù)據(jù)庫使用時間截止到2019年11月。以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性指數(shù)（DL）≥0.08兩項指標[9]作為篩選閾值并結(jié)合文獻報道確定最終藥物活性成分，后對有效活性成分所對應(yīng)的潛在靶蛋白進行逐一搜集，在Unipot數(shù)據(jù)庫上對蛋白名稱進行標準化處理，選擇物種為“homo sapiens”，得到藥物對應(yīng)的潛在靶點。

1.3 LDH疾病相關(guān)靶點獲取 以“l(fā)umber disc herniation”為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫及OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索得到LDH疾病相關(guān)基因，對搜集到的疾病靶點處理、去重后，得到LDH相關(guān)靶點[10-11]。

1.4 肉桂治療LDH的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 利用Venny網(wǎng)站將藥物-靶點與疾病-靶點進行映射，繪制韋恩圖并得到肉桂治療LDH的作用靶點。運用Cytoscape3.5.1軟件構(gòu)建“藥物活性成分-靶點”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 生物功能與通路富集分析 利用人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫DAVID將獲取的肉桂治療LDH的潛在靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，從而探討肉桂治療LDH的生物過程及相關(guān)信號通路。

2 結(jié) 果

2.1 肉桂主要活性成分 經(jīng)收集整理，共獲得肉桂化學(xué)成分105個。以O(shè)B≥30%、DL≥0.08作為標準篩選并結(jié)合文獻報道最終確定15個肉桂主要活性成分。見表1。

2.2 構(gòu)建肉桂活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò) 利用TCMSP檢索肉桂15個活性成分，共獲得166個藥物作用靶點（hexadec-11-enal無對應(yīng)靶點），經(jīng)去重及Unipot數(shù)據(jù)庫標準化處理后得到74個有效作用靶點。將活性成分、有效作用靶點導(dǎo)入Cytoscape網(wǎng)絡(luò)可視化軟件，構(gòu)建肉桂活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，在成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中，共有88個節(jié)點（14個中藥活性成分節(jié)點和74個作用靶點節(jié)點），166條邊，其中，紅色節(jié)點代表肉桂活性成分，藍色節(jié)點表示藥物作用靶點，見圖1、表2。結(jié)果表明，肉桂活性成分中油酸可作用于48個靶點。對于化合物作用的靶點，程度最高的為毒蕈堿型乙酰膽堿受體M1（CHRM1），與11個化學(xué)成分相關(guān)，其次為γ-氨基丁酸受體亞基α-1（GABRA1），與10個化學(xué)成分相關(guān)。

2.3 肉桂治療LDH的潛在靶點 通過Gene Cards、OMIM等數(shù)據(jù)庫共得到LDH相關(guān)靶點309個，采用韋恩圖將藥物預(yù)測所得74個靶點與疾病對應(yīng)309個靶點進行映射，最終得到尿激酶型纖溶酶原激活劑（PLAU）、胰島素（INS）、5-羥色胺轉(zhuǎn)運體SLC6A4基因、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、生長相關(guān)蛋白43（GAP43）、乙酰膽堿（ACHE）等8個肉桂作用于LDH的潛在靶點。見圖2。

2.4 肉桂治療LDH關(guān)鍵靶點的GO功能富集分析 將2.3中肉桂作用于LDH的8個潛在靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，從生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）3個層面對關(guān)鍵靶點進行不同生物學(xué)過程分析，依據(jù)P < 0.05列出13條GO功能富集分析結(jié)果。見表3、圖3、圖4。其中細胞成分主要有細胞外區(qū)域、細胞外間隙等，分子功能主要為蛋白同源二聚化活動、蛋白結(jié)合等，生物過程包括一氧化氮（NO）生物合成過程的正調(diào)控、藥物反應(yīng)、細胞遷移正調(diào)控等。

2.5 肉桂治療LDH作用靶點的KEGG通路分析 對肉桂作用于LDH的8個關(guān)鍵靶點進行KEGG通路富集分析，確定了4條主要信號通路，主要與核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、卵巢類固醇生成、脂肪細胞脂解的調(diào)節(jié)、含血清素的神經(jīng)突觸等信號通路相關(guān)，涉及代謝、炎癥、免疫等多個方面。見表4。

2.6 構(gòu)建肉桂“活性成分-作用靶點-通路”網(wǎng)絡(luò) 采用Cytoscape軟件建立肉桂“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)模型，9個成分，8個靶點，17條代謝通路間的關(guān)聯(lián)關(guān)系見圖5。肉桂所含效應(yīng)成分與靶點間、靶點與作用通路間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，其中藍色表示肉桂效應(yīng)成分，紅色代表成分靶點，綠色代表作用通路。肉桂化學(xué)成分中油酸（oleic acid）可調(diào)節(jié)NF-κB、脂肪細胞脂解、突觸集合、含血清素的神經(jīng)突觸、應(yīng)對受傷等信號通路中的PTGS2、PLAU、GAP43、BDNF、SLC6A4、INS;靶點PTGS2與EIC、棕櫚油酸（zoomaric acid）、石竹烯（caryophyllene）、蓽澄茄油烯（Cubebene、Sativene）、石竹烯氧化物（Caryophyllene oxide）、α-雪松烯（alpha-cedrene）、油酸（oleic acid）等8個化學(xué)成分相對應(yīng)。

3 討 論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可從多成分、多靶點層面預(yù)測藥物作用于疾病的靶點和通路。本研究基于該方法探討肉桂治療LDH的作用機制，通過TCMSP、TCMID等平臺查找肉桂活性成分、作用靶點，GenCards、OMIM等平臺查找LDH疾病靶點，采用Cytoscape軟件構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，并將成分-靶點和疾病-靶點映射所得的8個共同靶點輸入至 DAVID 軟件進行通路富集，并構(gòu)建“成分-靶點-通路”三維網(wǎng)絡(luò)模型。

結(jié)果表明，肉桂治療LDH可能與細胞外區(qū)域、細胞外間隙、蛋白同源二聚化活動、正調(diào)控褐色脂肪細胞分化、細胞對三磷酸腺苷（ATP）的反應(yīng)、NO生物合成過程的正調(diào)控、細胞遷移正調(diào)控等生物過程相關(guān)。這些生物過程與肉桂抗氧化、抗炎、抗菌和抗腫瘤等藥理作用相一致[12]。KEGG通路富集中的4條代謝通路中，NF-κB信號通路與LDH關(guān)系最為密切。NF-κB是一種普遍存在于細胞質(zhì)中的核轉(zhuǎn)錄因子，在細胞受到刺激時起著信號傳遞、誘導(dǎo)基因表達的作用[13]。因其參與并調(diào)節(jié)多種免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及細胞增殖與凋亡，故NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活，轉(zhuǎn)錄活性增強，并引起細胞間信號的級聯(lián)放大效應(yīng)，導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生[14]。近年來，NF-κB與椎間盤退變性疾病之間的聯(lián)系成為研究熱點，文獻報道顯示，椎間盤退變性疾病的發(fā)病過程中NF-κB信號通路得到激活，大量炎癥因子（如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8）呈現(xiàn)高表達，進而導(dǎo)致LDH患者疼痛發(fā)生[15-16]。同樣GO功能富集中，LDH與細胞對ATP反應(yīng)生物過程關(guān)系密切，YAMAZAKI等[17]研究發(fā)現(xiàn)，人和兔椎間盤纖維環(huán)細胞受到振動刺激后可檢測到ATP的釋放，受振動負荷ATP有快速釋放并可快速恢復(fù)到基礎(chǔ)水平的現(xiàn)象，ATP可作為信號物質(zhì)調(diào)節(jié)細胞反應(yīng)，并可能激活基質(zhì)破壞的生化通路。

在細胞對ATP反應(yīng)生物過程及NF-κB信號通路中最為顯著的靶點為PTGS2。PTGS2的表達與炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)系，當細胞受到刺激時，PTGS2表達上調(diào)，影響花生四烯酸代謝產(chǎn)生多種前列腺素（PGs），引發(fā)疼痛和炎癥反應(yīng)[18]。KATO等[19]通過構(gòu)建小鼠椎間盤突出模型研究椎間盤自發(fā)性再吸收，結(jié)果表明，PLAU在基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）激活中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，酶原形式存在的MMP-3和MMP-7被激活后發(fā)揮基質(zhì)降解作用，引起椎間盤再吸收。羅繼[20]通過免疫組織化學(xué)染色，比較了LDH細胞與正常椎間盤組織細胞中PLAU的表達情況，首次發(fā)現(xiàn)PLAU在人退變椎間盤組織中表達增高，在正常椎間盤組織中表達低，且PLAU與MMP-3在椎間盤的退變過程中呈正相關(guān)，這進一步為椎間盤退變的生物學(xué)修復(fù)和生物學(xué)治療提供了理論依據(jù)。通過圖5可以看出，NF-κB信號通路是LDH相關(guān)基因及肉桂靶蛋白共同參與的生物學(xué)通路，但它們作用的靶點卻不盡相同，提示肉桂中的靶蛋白PTGS2、PLAU通過調(diào)控NF-κB信號通路對LDH發(fā)揮治療作用。進一步的實驗主要探討NF-κB信號通路及其相關(guān)靶點（PTGS2、PLAU）在肉桂可能治療LDH動物模型中的作用機制。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段對肉桂治療LDH的潛在靶點進行預(yù)測，探討肉桂治療LDH可能涉及的生物學(xué)過程及信號通路，為今后在此研究結(jié)果基礎(chǔ)上進一步開展肉桂治療LDH的動物實驗及臨床試驗提供參考和依據(jù)。但本研究也存在一定的局限性，如KEGG富集分析顯示與卵巢類固醇生成、含血清素的神經(jīng)突觸等通路相關(guān)，尚缺研究報道，需后期進一步探討。

參考文獻

[1] KREINER DS，HWANG SW，EASA JE，et al.An evidence-based clinical guideline for the diagnosis and treatment of lumbar disc herniation with radiculopathy[J].Spine J，2014，14（1）：180.

[2] HUANG W，HAN Z，LIU J，et al.Risk factors recurrent lumbar disc herination：a systematic revivew and meta-anaiysis[J].Medicine，2016，95（2）：e2378

[3] GAO T，LAI Q，ZHOU S，et al.Correlation between facet tropism and lumbar degenerative disease[J].BMC Musculosket Disord，2017，18（1）：483.

[4] 莫偉，許海金，葉潔，等.腰椎間盤突出癥中醫(yī)治療方法的研究進展[J].中國中醫(yī)急癥，2016，25（3）：474-476.

[5] 曹盼舉，于海洋，張曉剛，等.腰椎間盤突出癥的中醫(yī)病因病機及其治療思考[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2018，30（11）：1999-2002.

[6] 王洪偉，李長青，周躍.腰椎間盤突出癥疼痛發(fā)生機制的研究進展[J].中國矯形外科雜志，2011，19（7）：568-571.

[7] 陳旭，劉暢，馬寧輝，等.肉桂的化學(xué)成分、藥理作用及綜合應(yīng)用研究進展[J].中國藥房，2018，29（18）：2581-2584.

[8] 李冰濤，章輝，肖思雨，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的葛根治療冠心病作用機制研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2019，26（10）：96-100.

[9] XU X，ZHANG W，HUANG C，et al.A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability[J].Int J Mol Sci，2012，13（6）：6964-6982.

[10] 孫凱，魏戌，朱立國，等.“杜仲-牛膝”藥對治療腰痛機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討[J].中藥新藥與臨床藥理，2019，30（8）：935-942.

[11] 孫凱，朱立國，魏戌，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“淫羊藿-白芍”配伍治療腰椎間盤突出癥作用機制研究[J].中國中藥雜志，2020，45（3）：609-616.

[12] 鄧淑蓉，潘宇政.肉桂主要化學(xué)成分及藥理作用研究概況[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，27（4）：448-451.

[13] CHATTERJEE A，CHANG X，SEN T，et al.Regulation of p53 family member isoform DeltaNp63 alpha by the nuclear factor-kappa B targeting kinase IkappaB kinase beta[J].Cancer Res，2010，70（4）：1419-1429.

[14] 譚偉偉.基于NF-κB信號通路探討腰突顆粒治療腰椎間盤突出癥的機制[D].合肥：安徽中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[15] 譚旭儀，仇杰，仇湘中，等.補肝健腰方對腰椎間盤突出大鼠NF-κB信號通路的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2019，25（10）：37-39.

[16] 易威威，溫亞楓，劉浠，等.NF-κB抑制劑對脂多糖刺激的退變?nèi)俗甸g盤髓核細胞炎癥因子表達的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2017，39（8）：755-759.

[17] YAMAZAKI S，WEINHOLD PS，GRAFF RD，et al.Annulus cells release ATP in response to vibratory loading in vitro[J].J Cell Biochem，2003，90（4）：812-818.

[18] FRUNGIERI MB，WEIDINGER S，MEINEKE V，et al.

Prolifera-tive action of mast-cell tryptase is mediated by PAR2，COX2，prostaglandins，and PPARgamma：possible rele-vance to human fibrotic disorders[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（23）：15072-15077.

[19] KATO T，HARO H，KOMORI H，et al.Sequential dynamics of inflammatory cytokine，angiogenesis inducing factor and matrix degrading enzymes during spontaneous resorption of the hemiated disc[J].J Orthop Res，2004，22（4）：895-900.

[20] 羅繼.尿激酶型纖溶酶原激活劑、基質(zhì)金屬蛋白酶-3在退變腰椎間盤中的表達研究及生物學(xué)意義[D].長沙：中南大學(xué)，2007.

收稿日期：2020-08-15;修回日期：2020-09-18

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81960832）;甘肅省中醫(yī)藥防治慢性疾病重點實驗室開放基金項目（GSMBKY2015-07）

作者單位：1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000;2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020

通信作者：宋敏 甘肅省蘭州市和平開發(fā)區(qū)中醫(yī)大道1號，sm@gszy.edu.cn，（0931）8765377