基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法新進(jìn)展

季美超，付 斌，張養(yǎng)軍

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室，北京蛋白質(zhì)組研究中心，國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心-北京，北京 102206)

20世紀(jì)90年代，隨著基因組學(xué)的迅速發(fā)展，人類基因組測序工作初步完成。2001年，人類基因組草圖正式發(fā)表[1]，標(biāo)志著生命科學(xué)正式進(jìn)入后基因組時代。人們逐漸意識到基于mRNA水平的研究并不能包含生命的全部信息，因此對于生命活動的直接執(zhí)行者——蛋白質(zhì)研究逐漸成為熱點。不同于傳統(tǒng)方法針對一種或者幾種蛋白質(zhì)的研究，澳大利亞學(xué)者Williams等[2]于1994年首次提出“蛋白質(zhì)組學(xué)”這一概念，即“從整體水平對特定時間或環(huán)境下細(xì)胞或組織內(nèi)基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究”。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的對象動態(tài)且多變，與基因組學(xué)相比更加復(fù)雜。而隨著高通量蛋白質(zhì)組分析技術(shù)及方法的發(fā)展，其已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥及病理研究等領(lǐng)域，逐漸成為驅(qū)動精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的強(qiáng)勁動力。

蛋白質(zhì)組研究主要包括3個方面：表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)[3]。其中，表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)是對細(xì)胞組織或個體的蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析以及其蛋白質(zhì)組成含量和變化規(guī)律的檢測；結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)側(cè)重于亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的分析，對于細(xì)胞組成及通路研究具有重要意義；功能蛋白質(zhì)組學(xué)則是蛋白質(zhì)組研究的最終目的，即闡明某功能相關(guān)蛋白質(zhì)的活動規(guī)律以及蛋白質(zhì)間相互作用的問題。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要用于對蛋白質(zhì)組進(jìn)行定性鑒定以及定量分析，因其具有“整體性”和“動態(tài)性”的特點，需要靈敏、準(zhǔn)確且高通量的技術(shù)方法作為支撐。質(zhì)譜(MS)技術(shù)的出現(xiàn)很好地解決了這一難題，使得蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展更加迅速高效[4]。

自20世紀(jì)初，Thomson發(fā)明質(zhì)譜并將其應(yīng)用于同位素研究起，縱觀質(zhì)譜的發(fā)展歷史，其歷程近似于指數(shù)曲線。1987、1988年發(fā)明的基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrin assisted laser desorption ionization, MALDI)[5]和電噴霧電離(electronspray ionization, ESI)[6]使得質(zhì)譜從有機(jī)化學(xué)的應(yīng)用過渡到生物大分子的檢測。20世紀(jì)90年代中期，各種基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)分析策略基本上取代了Edman降解分析方法，成為鑒定多肽和氨基酸序列的主流方法[7]。近年來，質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，已成為蛋白質(zhì)組研究最突破且應(yīng)用最廣泛的技術(shù)手段之一。質(zhì)譜儀的基本構(gòu)造主要分為樣品導(dǎo)入系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器以及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)5個部分[8]。而近年來的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)以及在進(jìn)樣前串聯(lián)液相色譜(liquid chromatography, LC)的廣泛應(yīng)用，使得蛋白質(zhì)組樣品的分離、鑒定和定量效率得到極大提升[9]。

本文將綜述基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展及應(yīng)用，并討論和展望未來的發(fā)展前景。

1 蛋白質(zhì)組鑒定技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)方法可用于蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)組的定性分析，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)鑒定方法，如免疫印跡法、化學(xué)測序法等通常耗時耗力，且精度較低，不適用于高通量蛋白質(zhì)組的研究。質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)意味著高通量自動化蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組鑒定時代的來臨，基于質(zhì)譜的多種蛋白質(zhì)組鑒定方法陸續(xù)出現(xiàn)，主要包括二維凝膠電泳(2DE)-串聯(lián)質(zhì)譜分析以及多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析[10]，用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜的構(gòu)建，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾等研究。

1.1 蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析技術(shù)

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展與普及，大規(guī)模獲取生物體全部蛋白質(zhì)信息的設(shè)想成為可能。由于在基因組層面的研究缺乏對于蛋白功能、修飾及加工信息方面的了解，因此需要建立規(guī)?；牡鞍踪|(zhì)表達(dá)譜以達(dá)到此目的。另外，蛋白質(zhì)表達(dá)譜的構(gòu)建不僅對深入了解整體蛋白質(zhì)組信息非常重要，而且也是生物體蛋白功能以及蛋白質(zhì)之間相互作用研究的基礎(chǔ)及前提[10]。

1.1.1組織或器官蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析技術(shù)

由于技術(shù)條件的限制，早期蛋白質(zhì)表達(dá)譜研究僅限于簡單生物，所使用的手段多是基于二維凝膠電泳分離結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，如采用2DE結(jié)合MALDI-TOF/MS進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜分析技術(shù)[10]。之后，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，其準(zhǔn)確度及鑒定通量不斷提升，蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究對象也由簡單的模式生物逐漸轉(zhuǎn)為復(fù)雜生物，如鼠及胚胎[10]等，隨之衍生了一系列非二維凝膠電泳分離技術(shù)策略，例如：基于多維液相色譜分離的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(MudPIT)[11]、Top-Down分析策略[11]、亞蛋白質(zhì)組(Sub-proteomics)分析策略[10]等。

組織器官蛋白質(zhì)表達(dá)譜的構(gòu)建對于疾病機(jī)理以及藥物靶點的發(fā)掘意義重大。為此，陳曼等[12]利用高效液相色譜(HPLC)聯(lián)合Q-Exactive質(zhì)譜建立了帕金森病(PD)患者患病組及對照組的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，通過對患病組及對照組差異表達(dá)蛋白質(zhì)的統(tǒng)計分析，發(fā)掘出了潛在的生物標(biāo)志物。李瑞陽等[13]以其課題組設(shè)計的串聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)元件(transcription factor response elements, TFREs)為基礎(chǔ)，開發(fā)了新型轉(zhuǎn)錄因子富集法(transcription factor response elements on tip, TOT)，富集了肝實質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中的轉(zhuǎn)錄因子，并結(jié)合質(zhì)譜分析其動態(tài)變化，構(gòu)建了肝細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)譜分析系統(tǒng)。Jiang等[14]利用蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組圖譜，對110對與乙型肝炎病毒感染相關(guān)的臨床早期肝細(xì)胞癌(HCC)的腫瘤及非腫瘤組織進(jìn)行特征分析，發(fā)掘了HCC的異質(zhì)性，并利用這一點將HCC分為3種亞型，為肝細(xì)胞癌腫瘤生物學(xué)的發(fā)展以及臨床個性化治療奠定基礎(chǔ)。

1.1.2相互作用蛋白質(zhì)組分析技術(shù) 蛋白質(zhì)之間的相互作用(protein-protein interaction, PPI)在生命體分子結(jié)構(gòu)中扮演著重要角色，絕大多數(shù)的細(xì)胞功能和生理活動都是由非共價PPI實現(xiàn)的[15]。據(jù)估計，在智人中發(fā)生的PPI在12～100多萬之間，但其中有記錄的高質(zhì)量定性研究只有5萬個左右[15]，因此對PPI的認(rèn)識及探索仍任重道遠(yuǎn)。免疫沉淀技術(shù)(immunoprecipitation, IP)是研究蛋白互作的常用技術(shù)，包括Co-IP(蛋白-蛋白)、RIP(蛋白-RNA)、ChIP(蛋白-DNA)，通常根據(jù)互作的分子類型和檢測目的對其進(jìn)行高通量檢測[16]。蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展為蛋白互作研究提供了高通量的平臺，實現(xiàn)了從網(wǎng)絡(luò)水平大規(guī)模深入理解互作機(jī)理，剖析其在疾病防治及藥物研究中的作用。

高通量檢測互作技術(shù)主要包括兩類，第一類是以酵母-雙雜交系統(tǒng)為代表的遺傳方法[17]，主要測量成對的相互作用；第二類是大規(guī)模生化方法[17]，鑒定多個蛋白質(zhì)之間復(fù)合物的相互作用，主要包括蛋白質(zhì)芯片技術(shù)(protein chip technique)和串聯(lián)親和純化-質(zhì)譜分析技術(shù)(tandemaffinity purification-mass spectrometry, TAP-MS)[18]。

基于質(zhì)譜的TAP-MS技術(shù)分析步驟如下：首先使用誘餌(抗體或標(biāo)簽)捕獲蛋白，與之互作的蛋白會被同時捕獲，然后將誘餌與其潛在的相互作用蛋白一起洗脫，隨后采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)進(jìn)行鑒定和定量[10]。劉艷霞等[19]采用Co-IP技術(shù)結(jié)合納升級液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(nano-LC-MS/MS)檢測多柔比星處理組細(xì)胞與對照組細(xì)胞的核內(nèi)乳癌細(xì)胞核內(nèi)絲切蛋白(cofilin)相互作用蛋白的差異，探討了多柔比星對細(xì)胞周期的影響。Malovannaya等[20]在IP和MS基礎(chǔ)上，發(fā)展了一種高通量HT-IP/MS法，用于從人細(xì)胞系中分離和鑒定內(nèi)源性蛋白復(fù)合體，同時還提出了一種將HT-IP/MS數(shù)據(jù)去卷積成離散蛋白質(zhì)復(fù)合物的方法，解決了這類研究一部分?jǐn)?shù)據(jù)限制的問題。此外，蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及多種數(shù)據(jù)庫(如BioGRID、STRING和IntAct等)的建立也為蛋白質(zhì)互作研究提供了更廣泛的途徑[21]。

轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控在很大程度上是由RNA轉(zhuǎn)錄本與RNA結(jié)合蛋白(RNA binding proteins, RBPs)的相互作用介導(dǎo)的，在生物過程中起著重要作用[16]。RBPs調(diào)控RNA的剪接、穩(wěn)定性、核輸出和翻譯等過程，因此RBPs與mRNA互作研究對完善蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要[22]。由于RBPs產(chǎn)量較低，各個科研團(tuán)隊開發(fā)了許多方法用于細(xì)胞中RBPs的分離富集。最先提出的分離策略是由Hentze[23]和Landthaler[24]實驗室獨立開發(fā)的，稱為“相互作用組捕獲(interactome capture)”策略，其過程首先用紫外光(UV)將RBPs交聯(lián)到RNA上，然后通過與寡聚脫氧核糖核酸小球(oligo-dT)雜交，從細(xì)胞中富集polyA RNA-蛋白復(fù)合物，酶解后進(jìn)行質(zhì)譜檢測，此方法已廣泛用于RBPs與mRNA互作研究中。而另一種名為RBR-ID的方法則是通過分析交聯(lián)的胰蛋白酶肽來鑒定RBP結(jié)合區(qū)[25]。RBR-ID法不需要對RNA進(jìn)行富集，因此可以提供RNA結(jié)合蛋白質(zhì)組的無偏差瞬時圖像信息。

除了這兩種依賴核酸序列或親和試劑特異性識別分離交聯(lián)的RBPs-RNA復(fù)合物的方法，也可以直接利用結(jié)合蛋白-RNA結(jié)合物的理化特性從游離的RNA中富集RBPs。例如，XRNAX[26]和正交有機(jī)相分離(OOPS)[27]這兩種方法使用的是標(biāo)準(zhǔn)的Trizol試劑。苯酚-甲苯萃取(PTex)法[28]則利用改性的苯酚-甲苯有機(jī)層，并在中性和酸性pH值下連續(xù)萃取。與Oligo-dT的互作捕獲法相比，這3種方法在哺乳動物細(xì)胞中可以富集鑒定到更多的RBPs。

1.1.3單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析技術(shù) 細(xì)胞是生物體最基本的結(jié)構(gòu)單元，在生物體生命進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。不同的因素，例如遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、微環(huán)境或基因表達(dá)的不同都可以導(dǎo)致細(xì)胞異質(zhì)性[29]。細(xì)胞異質(zhì)性是細(xì)胞系統(tǒng)的基本屬性之一，也是各研究領(lǐng)域重要的基礎(chǔ)問題[30]。然而，常規(guī)的大規(guī)模組學(xué)通常是對大量細(xì)胞進(jìn)行分析，得到的結(jié)果一般是細(xì)胞群的平均值[31]。因此，對單個細(xì)胞的蛋白組成和含量進(jìn)行分析，對細(xì)胞的功能研究是非常必要的。2020年3月，郭國驥等[32]利用Microwell-seq高通量單細(xì)胞測序分析技術(shù)，首次從單細(xì)胞水平上系統(tǒng)性地繪制了跨越胚胎和成年2個時期、涵蓋8大系統(tǒng)的人類細(xì)胞圖譜，發(fā)掘了單細(xì)胞研究在免疫及疾病方面的重要應(yīng)用。

2004年，Dovichi及Nolan[33]共同提出了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)(single cell proteomics)的概念。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法相比，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)可以更加準(zhǔn)確、系統(tǒng)地揭示細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾、分子相互作用和信號通路[34]，有助于生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，這將推動生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展變革。然而，由于在單細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)種類繁多、濃度極低[35]，因此面臨非常巨大的挑戰(zhàn)性。近年來，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要包括單細(xì)胞Western blotting、流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜法[36]、微流控芯片技術(shù)和化學(xué)細(xì)胞儀等[34-35]。黃超蘭等[37]將微流控技術(shù)與傳統(tǒng)獵槍蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了一種納升規(guī)模的油氣液滴(nanoliter-scale oil-air-droplet, OAD)芯片，并將其應(yīng)用于小鼠單個卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析。結(jié)果表明，此芯片系統(tǒng)使進(jìn)樣效率、序列覆蓋度、疏水蛋白富集效率以及酶解效率均得以大幅提升，從而提高了單細(xì)胞樣品的分析靈敏度。

高靈敏度和高覆蓋度的質(zhì)譜技術(shù)作為一種有效的單細(xì)胞分析工具，有著廣闊的應(yīng)用前景。目前，已經(jīng)發(fā)展了電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)、二次離子質(zhì)譜(SIMS)、激光質(zhì)譜和電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)[35]等多種單細(xì)胞水平上的質(zhì)譜技術(shù)。由于單體細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量極低，對質(zhì)譜技術(shù)提出了更高的要求。為此，秦少杰等[38]通過對不同質(zhì)譜分析前的分離技術(shù)進(jìn)行總結(jié)和比較，分析了多方法聯(lián)用在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的優(yōu)勢。目前的大多數(shù)單細(xì)胞質(zhì)譜技術(shù)在操作時都需要破壞細(xì)胞，這限制了對細(xì)胞發(fā)育過程中或藥物治療期間的動態(tài)變化分析[39]。而這一障礙可以通過開發(fā)破壞性最小的采樣方法以及提高儀器靈敏度來解決。目前研究表明，MS結(jié)合其他分析工具，如膜片鉗、熒光顯微鏡和拉曼光譜儀等對單細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，既可以減少破壞作用，又有利于捕獲更多的細(xì)胞動態(tài)信息、探索細(xì)胞行為和發(fā)掘特定亞群[39]。

1.2 翻譯后修飾蛋白質(zhì)組分析技術(shù)

翻譯后修飾(post-translational modification, PTMs)是指通過蛋白質(zhì)水解或在一個或多個氨基酸殘基上添加修飾基團(tuán)來改變蛋白質(zhì)性質(zhì)和功能的共價修飾。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾不僅僅是“裝飾品”，它可以決定蛋白活性狀態(tài)、定位、轉(zhuǎn)運(yùn)以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用[40]。早期不斷優(yōu)化Edman降解法用于翻譯后修飾蛋白的鑒定，而后質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展使得PTMs的定性及定量更加精確[40]。常見的PTMs包括磷酸化、糖基化、泛素化和磺酸化等，分析步驟基本相同。通常根據(jù)修飾類型的不同調(diào)整所使用的富集方法及質(zhì)譜裂解方式，以期得到更準(zhǔn)確的分析結(jié)果。

1.2.1磷酸化蛋白組分析技術(shù) 蛋白質(zhì)磷酸化是一種常見的翻譯后修飾，作為快速可逆的手段來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性以及傳導(dǎo)信號，它基本上參與協(xié)調(diào)了所有的細(xì)胞進(jìn)程[41]。真核生物蛋白質(zhì)中常發(fā)生磷酸化的氨基酸為絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸[42-43]。據(jù)估計，至少2/3的細(xì)胞蛋白含有1個或多個磷酸化位點[41]。磷酸化調(diào)控是細(xì)胞健康和疾病的中心機(jī)制，并且已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要內(nèi)容之一。因此，需要高通量的技術(shù)對生理和病理條件下發(fā)生的大量磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，而質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步可滿足這一要求。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的常用實驗策略是將細(xì)胞裂解提取蛋白質(zhì)，然后對提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，再對其中的磷酸化肽段進(jìn)行LC-MS/MS分析[44]。由于蛋白質(zhì)的磷酸化是一種低化學(xué)計量的修飾，磷酸化蛋白的豐度通常較低，因此，非磷酸化肽(或蛋白)的“背景噪聲”中富集磷酸肽(或蛋白)是質(zhì)譜分析面臨的挑戰(zhàn)[45]。隨著該領(lǐng)域的發(fā)展，出現(xiàn)了各種各樣的富集策略[46]，包括基于抗體的親和捕獲、磷酸化氨基酸的化學(xué)衍生化、基于金屬離子的親和捕獲和離子交換層析，以及經(jīng)典的用于磷酸化酪氨酸研究的免疫沉淀技術(shù)等。其中最常用的是基于金屬離子的親和富集技術(shù)，包括固定化金屬親和層析(IMAC)或金屬氧化物親和層析(MOAC，通常使用TiO2)[44-47]。這兩種技術(shù)在許多實驗室中得到了很好的應(yīng)用，在常規(guī)的LC-MS/MS分析中可鑒定得到大量的磷酸化位點。最常見的磷酸化肽段分級方法是強(qiáng)陽離子交換(SCX)色譜。實驗證明[41]，高pH值的反相色譜對磷酸化肽段分級非常有效，能夠?qū)崿F(xiàn)深入的磷酸化蛋白質(zhì)組覆蓋，但對用于分離的色譜柱的性能要求較高。

許多科研工作側(cè)重于優(yōu)化磷酸化樣本富集策略和分級技術(shù)，以降低富集復(fù)雜度和最大限度地提高采樣深度。李素貞等[48]通過將基于Ti4+-IMAC材料的磷酸肽富集方法與早期發(fā)明的SH2超親體(SH2 superbinder)親和層析相結(jié)合，實現(xiàn)了對肝癌細(xì)胞系HCCLM6細(xì)胞中酪氨酸磷酸化(pTyr)肽段的大規(guī)模富集，并結(jié)合LC-MS/MS及MaxQuant軟件對富集得到的肽段進(jìn)行檢測及數(shù)據(jù)分析。Dong等[49]采用同樣的方法有效地從復(fù)雜的小鼠骨骼肌組織蛋白裂解液中回收低豐度的pTyr肽段，并結(jié)合同位素標(biāo)記得到了高通量的鑒定結(jié)果。此外，Miao等[50]利用TiO2富集法，結(jié)合親水作用色譜分級及LC-MS/MS鑒定，揭示登革病毒(DENV-2)感染后的宿主蛋白磷酸化修飾情況。Zhao等[51]對方法進(jìn)行了改進(jìn)，即將填充有TiO2和C18反相填料結(jié)合2個相連的離心裝置對磷酸肽富集和分級，可用于分析大量尿磷蛋白樣本，適用于尿磷蛋白生物標(biāo)志物篩選和藥物反應(yīng)研究。Sun等[52]同樣利用此方法實現(xiàn)了小鼠肝臟酪氨酸磷酸化肽段的快速、高通量富集分離。Qin等[53]則報道了一種利用表面吸附原子轉(zhuǎn)移自由基聚合物(SI-ATRP)開發(fā)的新型毛細(xì)管柱，并將其成功應(yīng)用于高效特異性富集HepG2細(xì)胞裂解產(chǎn)物的低濃度磷酸化肽段，其負(fù)載能力較常規(guī)毛細(xì)管柱高，且與多種功能化單體兼容，在毛細(xì)管反向色譜、離子交換和親和層析方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

蛋白質(zhì)磷酸化作為最常見的翻譯后修飾，研究前景廣闊，且隨著更多成熟、高效的富集策略不斷出現(xiàn)，人類對磷酸化蛋白質(zhì)組也將會有更深入的認(rèn)識。

1.2.2糖基化蛋白組分析技術(shù) 蛋白質(zhì)糖基化是翻譯后修飾中最常見、最復(fù)雜的類型之一。據(jù)估計，參與淋巴細(xì)胞激活與調(diào)亡、抗原識別清除及信號傳遞等多種生命過程的人源蛋白質(zhì)中，超過一半發(fā)生了糖基化修飾[54]，并且在蛋白質(zhì)的折疊、降解、定位及運(yùn)輸中均發(fā)揮重要的作用。而目前數(shù)據(jù)庫中糖蛋白的信息量相對較少，因此針對生物體蛋白質(zhì)的糖基化研究意義重大。

根據(jù)糖基側(cè)鏈連接蛋白氨基酸殘基的不同，可以分為幾種不同類型的糖基化修飾。N-連接的糖基化(N-linked glycosylation)和O-連接的糖基化(O-linked glycosylation)是最常見的兩種類型，其糖肽鍵分別與天冬酰胺和絲氨酸/蘇氨酸殘基相連[55]。除此之外，糖基磷脂酰肌醇錨(glycosyl-phos phatidyl inositol anchor)[56]和蛋白聚糖(proteogly can)等類型常出現(xiàn)于糖基化蛋白質(zhì)組研究中。

質(zhì)譜與其他分離技術(shù)相結(jié)合已成為分析蛋白質(zhì)糖基化的有力工具[57]。然而，糖基化蛋白的低豐度和異質(zhì)性使質(zhì)譜分析面臨挑戰(zhàn)，因此，對低豐度糖肽進(jìn)行富集和質(zhì)譜分析是目前蛋白質(zhì)糖基化研究的重點。常用的分離富集親和技術(shù)主要包括親水相互作用色譜法(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)[55]、肼化學(xué)富集法[58]、凝集素親和技術(shù)和硼酸親和層析等[59]，其中近年來最常用的是HILIC和凝集素親和技術(shù)。HILIC富集原理是以水-水溶性有機(jī)溶劑混合物作為流動相，利用糖肽和非糖肽的親水性差異分離富集，以去除非糖肽干擾，達(dá)到不破壞糖肽糖鏈結(jié)構(gòu)的富集目的。秦偉捷等[60]利用HILIC富集結(jié)合質(zhì)譜鑒定，發(fā)展了一種選擇性去糖基化新策略，并獲得了首個人尿液蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾數(shù)據(jù)集；黃怡等[61]基于此技術(shù)，從完整糖肽水平對貝伐單抗(抑制腫瘤血管生成的抗體藥物)糖型進(jìn)行定性定量分析，優(yōu)化并建立了糖肽的高靈敏度、全覆蓋的定性定量分析技術(shù)流程。凝集素可用于捕獲特定糖蛋白或糖肽，實現(xiàn)保持肽鏈完整性的富集。例如，譚增琦等[62]利用凝集素親和富集技術(shù)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用，對小鼠乳腺上皮細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞中平分型GlcNAc糖基化修飾的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及功能研究；趙洋等[63]基于人源半乳糖凝集素3的糖識別結(jié)構(gòu)域(CRD)，構(gòu)造了Gal3C和Tetra-Gal3C兩種重組凝集素親和柱，并將其成功用于人肝癌細(xì)胞系HepG2的糖蛋白富集。

各種糖蛋白骨架在質(zhì)譜中的斷裂規(guī)律不同，可根據(jù)需求的不同選擇相應(yīng)的質(zhì)譜體系對糖蛋白進(jìn)行分析。當(dāng)僅研究糖蛋白中糖骨架信息時，需使糖、肽分離而防止肽骨架結(jié)構(gòu)被破壞，因此可使用低能量的碰撞誘導(dǎo)解離方式。若需要將肽骨架斷裂時，可采用高能量的碰撞誘導(dǎo)解離肽段，也可采用電子捕獲解離(ECD)以及電子轉(zhuǎn)移解離技術(shù)(ETD)[64]。例如，張思琦等[65]使用ESI-ETD-MS/MS，鑒定得到人源轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白A1(FOXA1)在體外ppGalNAc-T2酶的O-GalNAc修飾位點-S355；Stavenhagen等[66]采用CID和ETD技術(shù)結(jié)合C18多孔石墨化碳(PGC)-LC-ESI-QTOF-MS/MS，對人C1-抑制物(C1-Inh)進(jìn)行了深入的位點特異性N-和O-糖基化分析，為進(jìn)一步研究這些糖鏈修飾的功能奠定了基礎(chǔ)。

1.2.3泛素化蛋白組分析技術(shù) 泛素化修飾是泛素分子在一系列特殊酶類的作用下，從細(xì)胞內(nèi)選出靶蛋白分子并對其進(jìn)行修飾的過程。泛素化在蛋白質(zhì)定位、代謝、降解中發(fā)揮著重要作用，參與了包括細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄及免疫反應(yīng)在內(nèi)的幾乎一切生命活動[67]。只有一個泛素分子連接靶蛋白稱為單泛素化，靶蛋白上多個賴氨酸殘基均連接泛素分子則為多泛素化[68]。Western blotting(WB)是定量蛋白質(zhì)泛素化廣泛使用的生化方法。徐平[68]課題組基于此方法引入了泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ThUBD)，構(gòu)建了串聯(lián)雜交法(TUF-WB)，將合成的泛素鏈或泛素化的共軛物在固體膜上的信號可視化，準(zhǔn)確定量膜上的多泛素化信號，具有極高的靈敏度和較寬的動態(tài)范圍。

基于質(zhì)譜泛素化位點的鑒定需首先對樣品進(jìn)行胰蛋白酶解，結(jié)合泛素化的抗體肽段富集方法，實現(xiàn)泛素化肽的定性定量。例如，Xiao等[69]設(shè)計了一種新的胰蛋白酶和Ac-LysargiNase串聯(lián)消化的高效泛素化鑒定流程，隨著泛素化富集技術(shù)的發(fā)展，使得低豐度泛素化肽段的高效鑒定成為可能。例如，Akimov等[70]將特異性泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ubiquitin binding domains, UBDs)結(jié)合SILAC技術(shù)進(jìn)行泛素化蛋白質(zhì)組分析?；赨BD的高泛素親和力，Gao等[71]構(gòu)建了串聯(lián)雜合 UBD(tandem hybrid UBD, ThUBD)用于高效、無偏性富集不同類型泛素鏈的泛素化蛋白及質(zhì)譜分析；Hjerpe等[72]還開發(fā)出特異性分離富集泛素化蛋白的串聯(lián)泛素結(jié)合實體(tandem ubiquitin binding entities, TUBE)技術(shù)，以及K48或K63或線性(M1)多泛素化蛋白選擇性結(jié)合的鏈特異性TUBE技術(shù)。這些泛素化蛋白質(zhì)特異性富集結(jié)合質(zhì)譜分析對泛素化蛋白質(zhì)組的研究具有重要意義。

1.2.4磺酸化蛋白組分析技術(shù) 蛋白質(zhì)磺酸化是發(fā)生在活性半胱氨酸殘基上的一種可逆修飾，是將半胱氨酸上的巰基(—SH)氧化為磺酸(—SO3H)的過程[73]，在蛋白質(zhì)的氧化還原調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。由于磺酸化具有不穩(wěn)定性，通常很難被直接檢測或分析，因此在過去的幾十年中，發(fā)展了許多磺酸化標(biāo)記方法。2008年，Reddie等[74]引入名為DAz-1的原位磺酸探針，這是一種帶有疊氮基團(tuán)的雙甲酮標(biāo)記探針，可以結(jié)合磷酸化試劑，通過Staudinger反應(yīng)選擇性地富集、鑒定磺酸化修飾的蛋白質(zhì)。然而，由于以雙甲酮為基礎(chǔ)的探針不能穿透細(xì)胞膜，因此其不能用來標(biāo)記活細(xì)胞中的磺酸化蛋白。2011年，Paulsen等[75]開發(fā)了另一種具有細(xì)胞透性的炔基標(biāo)記雙甲酮類似物DYn-2，與其他基于雙甲酮的探針相比，其穩(wěn)定性更好、標(biāo)記效率更高。Yang等[76]優(yōu)化了此工作流程，并將其命名為SulfenM，結(jié)合DYn-2探針以及Q-Exactive MS分析，定位了RKO結(jié)腸腺癌細(xì)胞中蛋白磺酸化位點，之后進(jìn)一步通過親和純化和Western blotting相結(jié)合的方法對其進(jìn)行了驗證。為了發(fā)展二代探針技術(shù)，使磺酸化修飾的標(biāo)記鑒定更加全面準(zhǔn)確，Gupta等[77]開發(fā)了4種新的炔烴標(biāo)記探針，其中，一種基于苯并噻嗪的探針(BTD)顯示出最高水平的S-磺酰胺反應(yīng)性，與DYn-2相比，標(biāo)記效率提高了2個數(shù)量級以上。Fu等[78]利用此BTD探針，通過銅催化的疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)和強(qiáng)陽離子交換(SCX)技術(shù)，結(jié)合LC-MS/MS分析，全面系統(tǒng)地鑒定及定量了RKO細(xì)胞蛋白的磺酸化位點，證實了其標(biāo)記的高效性。

此外，在磺酸化蛋白質(zhì)組研究中，氯磺酰乙酰氯(CSAC)、N-羥基琥珀酰亞胺酯類、鄰磺基苯甲酸環(huán)酐(SACA)及磺苯基異硫氰酸(SPITC)等常用的磺酸化試劑對鑒定物引入磺基，從而起到輔助解離肽段以及質(zhì)譜測序的作用[79]。然而，磺酸化試劑的毒性、副反應(yīng)等問題會干擾鑒定準(zhǔn)確度[80]，成為此類研究亟待解決的難點。盡管近年來科研人員對于磺酸化的興趣與日俱增，但磺酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究依然相對較少[81]，仍需進(jìn)一步的探索及挖掘。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，僅局限于對蛋白質(zhì)類型及修飾的定性分析已無法滿足科研需求。在此情況下，定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，成為近年來生命科學(xué)的研究熱點之一。蛋白質(zhì)組學(xué)的定量技術(shù)是在已知蛋白類型的基礎(chǔ)上，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)給出的信號強(qiáng)度對其表達(dá)量及豐度進(jìn)行定量。這不僅需要對實驗進(jìn)行周密設(shè)計，同時對實驗的每個步驟有較高的要求。蛋白質(zhì)組的定量技術(shù)主要包括非靶向的相對定量技術(shù)，以及靶向的絕對定量技術(shù)[82]兩種類型。定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，對疾病標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)及臨床應(yīng)用具有重要意義。

2.1 蛋白質(zhì)組相對定量技術(shù)

蛋白質(zhì)組相對定量技術(shù)又稱為比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，是指對不同生理病理狀態(tài)下的細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行相對的比較分析。根據(jù)是否對蛋白質(zhì)進(jìn)行同位素標(biāo)記，相對定量技術(shù)可分為標(biāo)記定量和非標(biāo)記定量[83]兩大類。

2.1.1蛋白質(zhì)組標(biāo)記定量技術(shù) 蛋白質(zhì)組標(biāo)記定量技術(shù)(stable isotopic labeling quantification)是指利用同位素標(biāo)簽標(biāo)記蛋白或多肽，結(jié)合高準(zhǔn)確度的質(zhì)譜技術(shù)，通過對同位素標(biāo)記后肽段的串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果確定肽段的序列，并且通過同位素峰的信號強(qiáng)度差異對肽段豐度進(jìn)行定量分析的手段[82]。標(biāo)記定量技術(shù)可用于大規(guī)模樣品分析，可避免由于提取以及前處理技術(shù)不同而產(chǎn)生的誤差。

根據(jù)標(biāo)簽類型的不同，將蛋白質(zhì)組標(biāo)記定量技術(shù)方法分為化學(xué)標(biāo)記法及代謝標(biāo)記法兩種類型[84]。目前用于定量的化學(xué)標(biāo)簽策略種類較多，其中最常用的一種化學(xué)標(biāo)簽是對半胱氨酸的巰基進(jìn)行標(biāo)記[85]。根據(jù)標(biāo)記對象的不同，可分為母離子標(biāo)記以及子離子標(biāo)記兩類[84]。母離子標(biāo)記是將標(biāo)簽所產(chǎn)生的質(zhì)量差在一級譜圖上進(jìn)行觀測，從而達(dá)到對蛋白定量的目的。例如，同位素親和標(biāo)簽技術(shù)(isotope-coded affinity tags, ICAT)和同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)標(biāo)簽技術(shù)(isotope-coded protein labels, ICPL)[85]。它們根據(jù)所設(shè)計的同位素標(biāo)簽具有相同的電離行為和效率的假設(shè)，在蛋白酶處理之前將標(biāo)記好的不同樣品的蛋白混合在一起，可以在多肽水平上減少每組樣品間的差異。雖然早期經(jīng)常采用ICAT和ICPL標(biāo)記方法，但這兩種標(biāo)簽分子質(zhì)量較大，無法分析不含Cys的蛋白，因此現(xiàn)在很少使用[85]。為了得到更直觀精確的定量結(jié)果，通過分析肽段化學(xué)標(biāo)簽的子離子，即利用質(zhì)譜二級碎裂后產(chǎn)生的報告離子進(jìn)行定量。典型的有相對和絕對定量的同位素標(biāo)記技術(shù)(isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ)，以及串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽技術(shù)(tandem mass tag, TMT)[84]，它們是具有相同質(zhì)量的等量標(biāo)簽。目前商品化的iTRAQ標(biāo)記分為4標(biāo)及8標(biāo)，TMT常用4/6/10標(biāo)[82]。近年來，iTRAQ及TMT技術(shù)廣泛用于疾病診斷以及藥物研究。例如，Xiong[86]、Du等[87]分別利用iTRAQ技術(shù)研究了腦外傷后認(rèn)知障礙患者和急性心肌梗死(AMI)患者血清蛋白質(zhì)組的變化，發(fā)掘新生物標(biāo)志物，為疾病診斷提供了新方向；Ren[88]、Tang等[89]則分別利用iTRAQ技術(shù)分析了膽管癌和胰腺癌患者與對照組的血清蛋白質(zhì)組，揭示了2種癌癥的潛在治療靶點；Zhou等[90]利用基于TMT的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究了骨質(zhì)疏松癥患者在脊柱融合術(shù)中骨髓微環(huán)境的蛋白質(zhì)變化，揭示其發(fā)病機(jī)制；Hou等[91]利用TMT標(biāo)記，探討了二氫青蒿素抗肝癌的作用效果，為進(jìn)一步了解抗肝癌的相關(guān)分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。此外，其他化學(xué)標(biāo)記策略，如18O、14/15N、12/13C、苯胺和苯甲酸標(biāo)記、碘乙酰苯胺標(biāo)記等也逐漸應(yīng)用于組學(xué)研究，使標(biāo)記技術(shù)具有更多的選擇性。

代謝標(biāo)記與化學(xué)標(biāo)記不同，需在蛋白質(zhì)生物合成的第一階段進(jìn)行，因此，獲得樣品后可以立即混合，從而避免樣品處理(蛋白質(zhì)提取、分級、消化等)過程中產(chǎn)生的偏差。由于此特性，使用代謝標(biāo)記法可以適當(dāng)減少技術(shù)重復(fù)次數(shù)。典型的代謝標(biāo)記技術(shù)是基于氨基酸標(biāo)記的穩(wěn)定同位素氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC)[92]，其基本原理是在細(xì)胞培養(yǎng)時加入輕、重同位素標(biāo)記的必需氨基酸(通常為賴氨酸和精氨酸)，在蛋白層次混勻樣本，避免了后續(xù)操作所帶來的定量誤差，提高了定量的準(zhǔn)確性。早期SILAC技術(shù)只適用于活體培養(yǎng)的細(xì)胞，而后基于此發(fā)展出Super-SILAC[93]和 NeuCode SILAC[94]等技術(shù)，并將其廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)中組織、體液等樣本的研究。

2.1.2蛋白質(zhì)組非標(biāo)記定量技術(shù) 標(biāo)記定量法應(yīng)用范圍廣泛，但也存在一定的缺陷。例如，標(biāo)記試劑成本昂貴、樣品制備過程較為復(fù)雜等。另外，復(fù)雜樣品中存在電離競爭以及樣品處理重復(fù)精度限制[95]，MS信號多變且不可預(yù)測，易加大誤差，影響定量準(zhǔn)確度。因此，直接依賴離子MS信號強(qiáng)度進(jìn)行相對定量技術(shù)，即蛋白質(zhì)組非標(biāo)定量技術(shù)(label-free quantification)[95]逐漸受到重視。這種技術(shù)不需要昂貴的標(biāo)記試劑，且適用于任何類型蛋白質(zhì)的相對定量，具有較高的定量準(zhǔn)確度，目前已普遍應(yīng)用于定量蛋白質(zhì)組研究中。

非標(biāo)記定量技術(shù)主要分為譜圖計數(shù)法和信號強(qiáng)度法兩大類。譜圖計數(shù)(spectral counts, SpC)[96]的原理是利用肽段匹配的二級譜圖數(shù)量進(jìn)行定量。理論上來說，豐度越高的蛋白，質(zhì)譜碎裂后得到的肽段數(shù)和二級譜圖數(shù)越多?；诖耍珿riffin等[97]開發(fā)了歸一化譜圖計數(shù)法(normalized spectral index, SIn)，優(yōu)化了SpC的可重復(fù)性，提高了鑒定準(zhǔn)確度。Piersma等[96]利用SIn評估并比較了3種非標(biāo)定量蛋白質(zhì)組學(xué)流程；Asara等[98]開發(fā)了總離子計數(shù)法(total ion count, TIC)，對定量低豐度蛋白時的SpC進(jìn)行優(yōu)化。

信號強(qiáng)度法最早由Chelius等[99]提出并驗證，是基于一級譜圖母離子強(qiáng)度的定量，通過比較母離子的面積及信號強(qiáng)度對樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。例如，Nakamura等[100]提出，在混合樣品的一級質(zhì)譜檢測中，所鑒定到1個蛋白中所有肽段峰強(qiáng)度平均值與該蛋白量正相關(guān)。Silva等[101]則發(fā)現(xiàn)，蛋白濃度與質(zhì)譜檢測所得到的3個信號最高離子峰強(qiáng)度的平均值正相關(guān)。隨后，Grossmann等[102]基于此提出了T3PQ法(Top3 protein quantification)用于定量計算。

通常根據(jù)實驗需求的不同，選擇不同的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式，如數(shù)據(jù)依賴采集模式(data dependent analysis, DDA)和數(shù)據(jù)非依賴采集模式(data independent analysis, DIA)。DDA基于鳥槍法原理，按照離子強(qiáng)度從高到低采集母離子進(jìn)行二級碎裂，其結(jié)果具有一定的隨機(jī)性。DIA法在2000年初首次提出，它將掃描范圍分為若干窗口，可以最大限度地獲得樣本碎片離子信息，提高定量精度。2012年，出現(xiàn)了基于DIA的新方法——SWATHMS[103]，結(jié)合高分辨質(zhì)譜儀和優(yōu)化的采集方案，實現(xiàn)了大樣本隊列的快速高通量分析。近年來，也提出并驗證了Direct DIA(direct data-independent acquisition)方法[104]用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾蛋白質(zhì)組分析，在降低成本提高效率的同時也保留了DIA可重復(fù)定量的優(yōu)勢。

2.2 蛋白質(zhì)組絕對定量技術(shù)

絕對定量(aqua)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究最早使用的方法之一，可通過在樣本中加入內(nèi)標(biāo)或基于非內(nèi)標(biāo)技術(shù)，結(jié)合高精度的MS測定蛋白質(zhì)的絕對豐度。目前，已經(jīng)發(fā)展了多種應(yīng)用于多肽和蛋白質(zhì)絕對定量的策略。例如，張惠萍等[105]提出一種基于LC-MS的細(xì)胞外泌體組學(xué)分析方法，引入同位素內(nèi)標(biāo)，對細(xì)胞外泌體樣本進(jìn)行高覆蓋度的絕對定量分析。常乘等[84]從蛋白和肽段層面對質(zhì)譜原始信號強(qiáng)度進(jìn)行校正，從而提出了一種更準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)無標(biāo)絕對定量方法模型。絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)對質(zhì)譜檢測的重復(fù)性、靈敏度以及檢測效率都有很高的要求，常使用多重反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)和平行反應(yīng)監(jiān)測(parallel reaction monitoring, PRM)2種靶向質(zhì)譜定量技術(shù)。

2.2.1多重反應(yīng)監(jiān)測技術(shù) 多重反應(yīng)監(jiān)測早期也稱為選擇性反應(yīng)監(jiān)測(selected reaction monitoring, SRM)。它作為一種高效質(zhì)譜掃描模式，在掌握擬定量肽段的保留時間和子離子質(zhì)荷比等信息的前提下，一次分析可對數(shù)百個目標(biāo)肽段進(jìn)行定量，完全可以取代ELISA和Western blotting等基于抗體的定量技術(shù)，廣泛用于組學(xué)定量檢測領(lǐng)域[106]。MRM掃描方式常用于三重四極桿質(zhì)譜儀，其檢測過程是在第1個四極桿中選擇特定前體母離子，在第2個四極桿中將其碎裂，然后在第3個四極桿中檢測選定的肽段子離子。此過程保證了肽段定量的特異性，可顯著提高檢測靈敏度并有效地降低化學(xué)噪聲，常用于生物標(biāo)志物蛋白的高通量檢測。例如，Gerber等[107]利用MRM技術(shù)對人分離酶蛋白(human separase protein)進(jìn)行絕對定量；Shivangi等[108]利用液相色譜多反應(yīng)監(jiān)測(LC-MRM)方法，對肺腺癌表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)敏感性的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行定量研究；Huang等[109]則在傳統(tǒng)MRM方法的基礎(chǔ)上，建立并驗證了一種基于LC/MRM-MS結(jié)合免疫親和沉淀的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法，用于富集和定量人體體液中低豐度高度同源的趨化蛋白亞型。

2.2.2平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù) 平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)是在MRM的基礎(chǔ)上衍生而來的質(zhì)譜掃描方法。由于PRM可以選擇性指定前體離子和碎片離子，與MRM相比具有更高的選擇性及可信度，因此是一種更為方便的分析方法[110]。PRM掃描方法常用于Q-Exactive、Q-Exactive Plus或Q-Exactive HF等高分辨質(zhì)譜儀上。例如，Michael等[111]提出了一種特異的PRM方法，結(jié)合ETD質(zhì)譜裂解技術(shù)，定量表征了組蛋白修飾酶藥物(如組蛋白去乙?；敢种苿?HDAC))對組蛋白翻譯后修飾的影響。而PRM技術(shù)也有一定的缺陷，即分析肽段數(shù)過多時，為了保證定量精度，需要及時調(diào)整質(zhì)譜采集參數(shù)。據(jù)此，Gallien等[110]以PRM為基礎(chǔ)，研發(fā)了一種內(nèi)標(biāo)觸發(fā)平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)(internal standard triggered-parallel reaction monitoring, IS-PRM)，通過添加內(nèi)標(biāo)并且實時調(diào)整采集參數(shù)來定量內(nèi)源肽段，保證了大量肽段數(shù)據(jù)分析時的結(jié)果準(zhǔn)確度。隨著PRM技術(shù)的不斷成熟以及不同類型實驗參數(shù)的收集建庫，它將在未來獲得更廣泛的應(yīng)用。

3 總結(jié)與展望

質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展正在不斷提升蛋白質(zhì)組學(xué)研究的能力，促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)方法應(yīng)用的深度和廣度。特別是快速、深度覆蓋的蛋白質(zhì)組分析技術(shù)、單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)以及新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾技術(shù)的發(fā)展，使得蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代的主要驅(qū)動力。這對蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)提出了更高的要求，促使發(fā)展高通量、大隊列蛋白質(zhì)組一站式分析平臺，包括標(biāo)準(zhǔn)化、多模式、自動化的樣本制備方法，高通量、高質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化的深度覆蓋分析和質(zhì)控方法，以及一站式數(shù)據(jù)處理方法，這些方法的應(yīng)用必將對今后生命科學(xué)和醫(yī)療健康產(chǎn)生重大影響，也將進(jìn)一步促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)方法取得新進(jìn)展。