基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)在體外藥物肝毒性評價中的研究進(jìn)展

李麗美，臧清策，張瑞萍，再帕爾·阿不力孜,2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050；2.中央民族大學(xué)生物成像與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京 100081)

藥物毒性評價是藥物研發(fā)的重要環(huán)節(jié)，肝臟作為藥物毒性反應(yīng)的主要靶器官，暴露于外源性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，容易引發(fā)損傷，導(dǎo)致肝功能不全或肝功能紊亂[1]。藥物誘導(dǎo)性肝損傷(drug-induced liver injury, DILI)是臨床試驗失敗、藥品上市后撤回和出現(xiàn)新黑匣子警告的主要原因之一[2-3]。據(jù)統(tǒng)計，由于DILI導(dǎo)致藥物研發(fā)項目在早期終止的比例高達(dá)12%～14%[4]。因此，建立可靠的藥物肝毒性評價方法，在研發(fā)早期對具有潛在DILI風(fēng)險的藥物進(jìn)行預(yù)測和評價，對于提高藥物研發(fā)成功率具有重要意義。

藥物暴露會影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，改變細(xì)胞代謝途徑中內(nèi)源性代謝物的轉(zhuǎn)化平衡，引起細(xì)胞對毒物或其他外源刺激的響應(yīng)，產(chǎn)生毒性反應(yīng)[5]，因此，細(xì)胞代謝表型變化可以作為直接反映藥物毒性效應(yīng)的評價指標(biāo)。代謝組學(xué)通過分析生物樣品中分子質(zhì)量在1 000 u以下的代謝物信息，可以確定毒性損傷程度，推測毒性機(jī)制，發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物[6-7]。細(xì)胞代謝組學(xué)具有實驗成本低、實驗條件易控、重復(fù)性好等優(yōu)勢，已成為藥物肝毒性體外評價的重要技術(shù)[8]。質(zhì)譜(mass spectrometry, MS)單次檢測可獲得大量的代謝物信息，如精確質(zhì)荷比、同位素分布、特征離子、峰強(qiáng)度、峰面積等。液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)聯(lián)用技術(shù)具有分離度好、靈敏度高和重現(xiàn)性好等特點，能夠?qū)崿F(xiàn)代謝組高靈敏、高覆蓋的定量分析，且廣泛的數(shù)據(jù)庫可用于代謝物鑒定[9]，是目前代謝組學(xué)研究常用的分析工具。質(zhì)譜成像(mass spectrometry imaging, MSI)技術(shù)作為一種新型的分子影像技術(shù)，能夠直接從細(xì)胞、組織、器官等生物樣品中獲得大量已知或未知的內(nèi)源性代謝物或外源性藥物的含量和空間分布信息?；谫|(zhì)譜成像技術(shù)的空間分辨代謝組學(xué)提供組織原位代謝物受藥物刺激后的時空變化信息，為藥物肝毒性研究提供了一種新穎的手段。

本文基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)分析方法及其在肝毒性研究中的應(yīng)用，從目前肝毒性研究中常用的細(xì)胞模型與培養(yǎng)方法進(jìn)行綜述，旨在為藥物體外肝毒性研究提供思路和途徑。

1 藥物肝毒性評價細(xì)胞模型

為準(zhǔn)確進(jìn)行體外藥物肝毒性評價，首先應(yīng)該選擇合適的肝細(xì)胞類型和培養(yǎng)方法。本文對藥物肝毒性研究中常用的幾種細(xì)胞類型進(jìn)行總結(jié)，并概括其優(yōu)勢和不足。

1.1 藥物肝毒性評價的主要細(xì)胞類型

1.1.1原代肝細(xì)胞(primary hepatocytes, PHHs) PHHs是直接從肝臟中分離獲得的，具有高水平的藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體，被認(rèn)為是外源性化合物代謝和肝毒性研究細(xì)胞模型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可用于代謝酶的誘導(dǎo)/抑制以及化合物篩選的研究。然而，在常規(guī)的二維單層培養(yǎng)模式下，隨著細(xì)胞從組織中剝離時間的延長，細(xì)胞肝特異性功能(如白蛋白生成和細(xì)胞色素P450(CYP450)表達(dá))會迅速下降，通常僅能夠維持24～72 h[10]。

1.1.2永生化肝細(xì)胞系 通常獲取永生化肝細(xì)胞系的方法有2種：一種是通過PHH進(jìn)行基因工程改造；另一種是從突變的肝腫瘤中分離得到永生化的肝腫瘤細(xì)胞[11]。永生化肝細(xì)胞系的主要優(yōu)點是具有幾乎無限的增殖能力和相對較低的培養(yǎng)成本。目前，HepaRG和HepG2細(xì)胞是研究藥物肝毒性最常用的肝腫瘤細(xì)胞系，它們?nèi)菀撰@得，且具有基因型穩(wěn)定表達(dá)和無限增殖的能力。此外，這2種細(xì)胞均可對典型的P450誘導(dǎo)劑產(chǎn)生反應(yīng)[12]，誘導(dǎo)后可增加CYP450酶的活性。這類細(xì)胞的缺點是肝功能標(biāo)志物的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于原代肝細(xì)胞的平均水平；其次是基因型單一，僅能代表單個供體的表型，不適合進(jìn)行人群異質(zhì)性研究，并且其腫瘤特征可能導(dǎo)致對毒性損傷的敏感性減弱[13]。

1.1.3肝細(xì)胞樣細(xì)胞(hepatocyte-like cells, HLCs) 隨著干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以及相關(guān)研究的突破，基于干細(xì)胞衍生的肝細(xì)胞系成為一種廣泛使用的肝細(xì)胞模型，其通常由誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(induced-pluripotent stem cell, iPSCs)和干細(xì)胞(stem cell)衍生，這些細(xì)胞模型常被用于肝毒性的相關(guān)研究[14]。然而，目前尚無干細(xì)胞能夠成功分化為完全成熟的肝細(xì)胞，這些具有肝細(xì)胞特征的干細(xì)胞衍生細(xì)胞通常被稱為HLCs[15]。在誘導(dǎo)干細(xì)胞重編程過程中可能會導(dǎo)致遺傳改變和分化異質(zhì)性，與成熟的人類肝細(xì)胞的表型相似性有限。這3種細(xì)胞類型的優(yōu)、缺點列于表1，可根據(jù)需要選擇細(xì)胞類型進(jìn)行體外肝毒性研究。

表1 肝毒性體外研究中常用肝細(xì)胞類型的比較[8]Table 1 Comparison of commonly used hepatocyte types in hepatotoxicity studies in vitro[8]

1.2 細(xì)胞模型的培養(yǎng)方式

與體內(nèi)肝組織相比，二維(two dimension, 2D)培養(yǎng)的肝細(xì)胞缺乏細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞間通訊和空間異質(zhì)性，難以長期維持肝臟結(jié)構(gòu)和功能，因此2D細(xì)胞培養(yǎng)模型的穩(wěn)定性差，不適用于藥物長期毒性測試[16]。三維(three dimension, 3D)細(xì)胞模型具有與體內(nèi)肝組織類似的細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞間相互作用，可以改善細(xì)胞表型的相關(guān)性，并延長現(xiàn)有模型的生存能力，所獲得的3D結(jié)構(gòu)能夠模擬藥物在體內(nèi)的滲透過程，在藥物肝毒性評價中更具準(zhǔn)確性。

一些新穎的培養(yǎng)方法可以構(gòu)建更具異質(zhì)性微環(huán)境的3D細(xì)胞模型，例如肝細(xì)胞球、肝芯片等[17]。肝細(xì)胞球模型分為基于支架的培養(yǎng)模型和非支架的培養(yǎng)模型，示于圖1。常見的基于支架的3D細(xì)胞球模型有水凝膠嵌入式培養(yǎng)、3D打印[18]等。非支架技術(shù)是將懸浮細(xì)胞在非粘附性基質(zhì)上培養(yǎng)，促使細(xì)胞聚集，也可將細(xì)胞在懸浮液中短暫離心形成球體，主要有靜態(tài)液體覆蓋技術(shù)及懸滴法[18]。在早期研究中，通常利用瓊脂糖在96孔板中凝固時形成的凹形表面培養(yǎng)細(xì)胞球[19]，目前高速發(fā)展的3D打印技術(shù)可以更精準(zhǔn)地構(gòu)建均一可控的瓊脂糖凹形微孔陣列模型[20]，并已開發(fā)出廣泛適用的超低吸附板和細(xì)胞懸滴板等商用產(chǎn)品[21]。3D肝細(xì)胞球模型可以促使細(xì)胞表達(dá)成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物，因此更具藥物敏感性。器官芯片也是一種體外3D細(xì)胞模型，通過微芯片制造方法創(chuàng)建微流控細(xì)胞模型，包含連續(xù)灌注的小室，以模擬組織和器官的生理環(huán)境。該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)不同類型的細(xì)胞以空間相關(guān)的方式共培養(yǎng)，模擬體內(nèi)細(xì)胞的微環(huán)境[22]。基于微流控技術(shù)構(gòu)建的肝芯片的肝臟特異性生理功能更強(qiáng)，可以用于評價多種肝毒性表型，包括肝細(xì)胞損傷、脂肪變性、膽汁淤積和肝纖維化等。與肝細(xì)胞球的對比研究表明，肝芯片的毒性反應(yīng)與肝細(xì)胞球相似[23]，兩者結(jié)合可以更好地模擬體內(nèi)肝組織。

注：a.水凝膠嵌入式培養(yǎng)；b.3D生物打印技術(shù)；c.靜態(tài)液體覆蓋技術(shù)；d.懸滴法；e.器官芯片培養(yǎng)圖1 3D細(xì)胞模型培養(yǎng)方式[22-23]Fig.1 3D cell model culture methods[22-23]

2 基于質(zhì)譜技術(shù)的細(xì)胞代謝組學(xué)分析方法

2.1 基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的細(xì)胞代謝組學(xué)研究

細(xì)胞代謝組學(xué)LC-MS分析流程主要包括：細(xì)胞培養(yǎng)、樣本收集與制備、質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理[9-10]，示于圖2。

2.1.1樣品制備 與血漿、尿液和組織等生物樣本的代謝組學(xué)研究相比，細(xì)胞樣本的前處理過程相對復(fù)雜，涉及到細(xì)胞收集、代謝淬滅、細(xì)胞破碎和代謝物提取等多個步驟[24-25]。建立合理有效的細(xì)胞樣本前處理方法，確保細(xì)胞內(nèi)代謝物的真實性和穩(wěn)定性，是利用細(xì)胞代謝組學(xué)研究生理生化機(jī)制的重要前提。本課題組[26]前期利用LC-MS技術(shù)對細(xì)胞代謝組學(xué)樣品前處理過程的關(guān)鍵步驟進(jìn)行了系統(tǒng)考察和優(yōu)化，最終確定細(xì)胞代謝組研究的最佳樣本前處理方法為PBS清洗細(xì)胞樣本2次后，采用-40 ℃，60%甲醇(含0.85%(w/V)NH4HCO3)在5 min內(nèi)完成細(xì)胞代謝淬滅，然后采用80%甲醇通過3個液氮凍融循環(huán)提取細(xì)胞代謝物。此外，發(fā)現(xiàn)不同批次收集和長時間的液氮凍存均會對胞內(nèi)代謝物產(chǎn)生較大影響，因此在細(xì)胞代謝組學(xué)研究中應(yīng)盡量對新鮮制備的同一培養(yǎng)條件下、同批次的細(xì)胞樣本開展代謝組學(xué)研究。

注：a.細(xì)胞培養(yǎng)；b.分析樣本制備；c.基于質(zhì)譜的代謝譜采集；d.數(shù)據(jù)處理圖2 細(xì)胞代謝組學(xué)工作流程Fig.2 Workflow of cell metabolomics

2.1.2分析技術(shù)與方法 代謝組學(xué)樣品分析中最常用的是色譜與質(zhì)譜技術(shù)。氣相色譜和液相色譜是生物樣本代謝物分離常用的色譜系統(tǒng)。與液相色譜相比，氣相色譜在一定程度上可以降低基質(zhì)效應(yīng)和共洗脫化合物的離子抑制，在色譜分離的分辨率和重復(fù)性方面具有優(yōu)勢[27]，適合低分子質(zhì)量揮發(fā)性化合物的分析，對于極性、非揮發(fā)性化合物則需要溶劑萃取、干燥、衍生化等多步制備樣品[28]。相比之下，液相色譜技術(shù)對極性代謝物具有更好的相容性，使其成為代謝組學(xué)首選的分離工具[29]。通常LC-MS可以通過選擇2個互補(bǔ)柱：反相柱和親水作用色譜柱來分析小極性和極性代謝物[30-31]。為了解決單一的分離技術(shù)不能檢測所有內(nèi)源性代謝物的難題，二維液相色譜利用2種不同分離機(jī)制的色譜模式或使用相同模式下具有一定正交性的不同色譜柱進(jìn)行樣品分離[32]，可以提高單次樣本分析的分辨率和代謝物的覆蓋范圍。

此外，有報道采用無需分離的質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)研究。直接注入質(zhì)譜(direct inject mass spectrometry, DIMS)能夠靈敏、高通量地采集代謝指紋圖譜，其優(yōu)點是數(shù)據(jù)采集速度快，但會存在嚴(yán)重的離子抑制效應(yīng)，且難以區(qū)分同分異構(gòu)體。納升電噴霧可以降低離子抑制效應(yīng)，提高DIMS離子的電離效率，結(jié)合高分辨質(zhì)譜，能夠滿足高通量、少量樣本的代謝組分析。除了納升電噴霧源外，利用四極桿將掃描區(qū)間分割成連續(xù)質(zhì)荷比(m/z)間隔，并依據(jù)m/z信號的分布將掃描間隔進(jìn)行優(yōu)化的采集策略[33]，能夠顯著降低質(zhì)譜的離子過載，有助于進(jìn)一步提高代謝組的分析通量。

2.1.3數(shù)據(jù)采集 細(xì)胞代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集包括靶向和非靶向分析。非靶向代謝組學(xué)是對樣品中所有可測量代謝物的綜合分析，有利于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物，但是數(shù)據(jù)處理與代謝物鑒定的工作量大；靶向代謝組學(xué)則側(cè)重于測定已知的代謝物組[34]。除以上2種數(shù)據(jù)采集方法外，中國科學(xué)院大連化物所許國旺研究員課題組提出了一種將非靶向與靶向分析方法相結(jié)合的擬靶向代謝組學(xué)分析策略[35]，其通過非靶向分析的高通量、無偏向代謝物信息的獲取、特征離子對的挑選和靶向方法的高特異性檢測和準(zhǔn)確定量[36]，實現(xiàn)對待測樣本中已知及未知代謝物的同時靶向檢測[37]，具有更好的重復(fù)性和更寬的線性范圍，且不需要復(fù)雜的峰對齊等數(shù)據(jù)處理過程。

2.1.4數(shù)據(jù)處理與分析 代謝組學(xué)分析會產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，首先需要進(jìn)行噪聲過濾、峰提取、峰解卷積和保留時間對齊等，將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成1個包括每個樣本檢測到的離子及其對應(yīng)的峰面積或強(qiáng)度的矩陣[12]。然后將數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計分析，根據(jù)其代謝譜實現(xiàn)樣本聚類。同時，采用一些新的算法和統(tǒng)計方法進(jìn)一步優(yōu)化模型，包括機(jī)器學(xué)習(xí)，如隨機(jī)森林、支持向量機(jī)(support vector machine, SVM)和自組織映射(self-organization map, SOM)等[38]，最終獲得對分組貢獻(xiàn)較大的差異變量。計算機(jī)模型作為臨床前和臨床研究的補(bǔ)充，也可進(jìn)一步用于評估風(fēng)險，了解單個機(jī)制對毒性的貢獻(xiàn)，在預(yù)測DILI風(fēng)險方面具有較好的準(zhǔn)確性[39]。此外，代謝物結(jié)構(gòu)鑒定非常關(guān)鍵，通常需要根據(jù)MS/MS譜數(shù)據(jù)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索(如HMDB、METLIN等)分析推斷可能的結(jié)構(gòu)，并與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間、MS譜和MS/MS譜進(jìn)行比對分析與確認(rèn)。此外，許多軟件(如Met Frag、MS Finder等)可以基于理論裂解規(guī)律對代謝物進(jìn)行分析，中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所朱正江研究員課題組[40]開發(fā)的MetDNA分析策略可根據(jù)已知代謝物對可能發(fā)生生物轉(zhuǎn)化的代謝物進(jìn)行進(jìn)一步注釋，實現(xiàn)了更多代謝物的鑒定。

2.2 基于質(zhì)譜成像技術(shù)體外細(xì)胞模型的研究

基于質(zhì)譜成像技術(shù)的空間分辨代謝組學(xué)可以保留代謝物在異質(zhì)性生物組織中的空間位置信息，將代謝信息擴(kuò)展至二維乃至三維水平，以探究復(fù)雜的生物代謝。目前，最常用的質(zhì)譜成像技術(shù)主要包括：二次離子質(zhì)譜(secondary ion mass spectrometry, SIMS)、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)和解吸電噴霧電離質(zhì)譜(desorption electrospray ionization, DESI)等。

SIMS能夠提供亞微米甚至納米級的空間分辨率，可以進(jìn)行單細(xì)胞乃至亞細(xì)胞水平的質(zhì)譜研究[41]。Meliss等[42]采用SIMS技術(shù)實現(xiàn)了在單個細(xì)胞中胺碘酮及其代謝產(chǎn)物的3D可視化，但采用高能離子束轟擊樣本會產(chǎn)生大量碎片離子，因此利用SIMS難以對內(nèi)源性代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，且對于分子質(zhì)量大于1 000 u的化合物檢測靈敏度較低[43]。

MALDI-MSI的分辨率一般在50～100 μm之間，最高可達(dá)幾微米，能夠?qū)崿F(xiàn)較寬質(zhì)量范圍的分析。MALDI在小體積生物組織樣本的質(zhì)譜成像分析中具有明顯優(yōu)勢，能夠?qū)χ睆絻H約1 μm的多細(xì)胞腫瘤球(multicellular tumor spheroid, MCTS)中哌立福新和西妥昔單抗等藥物的滲透及代謝過程進(jìn)行表征[44-45]。此外，MALDI-MSI結(jié)合免疫熒光技術(shù)可以精準(zhǔn)識別MCTS的乏氧、增殖和壞死等微區(qū)結(jié)構(gòu)，有助于研究MCTS由藥物引起的空間代謝變化，準(zhǔn)確評估藥物的毒性效應(yīng)、發(fā)現(xiàn)潛在的毒性機(jī)制，示于圖3。香港浸會大學(xué)蔡宗葦教授課題組[46]建立了適合MCTS質(zhì)譜成像的冰凍切片制備方法，并利用MALDI-MSI考察了雙酚S(bisphenol S, BPS)暴露后，結(jié)腸癌MCTS中代謝組的變化，發(fā)現(xiàn)ATP等能量相關(guān)的代謝物在細(xì)胞球外周區(qū)發(fā)生顯著上調(diào)，推測BPS可能通過升高能量代謝水平誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖反應(yīng)[47]。本課題組[48]采用MALDI-MSI方法繪制了食管癌MCTS的代謝特征，對食管癌腫瘤球體內(nèi)不同增殖微區(qū)內(nèi)源代謝物的異質(zhì)性空間特征進(jìn)行表征，并研究代謝物隨培養(yǎng)時間的空間動態(tài)變化。然而，MALDI-MSI低質(zhì)量區(qū)的信號容易受所選基質(zhì)和溶劑的影響，此外，基質(zhì)的噴涂可能會引起分子空間位移。

圖3 MALDI-MSI技術(shù)結(jié)合熒光免疫組化表征MCTS中哌立福新的滲透與空間代謝改變[44]Fig.3 MALDI-MSI technology combined with fluorescence immunohistochemistry to characterize the penetration of perifosine and the spatial metabolic changes of MCTS[44]

DESI-MSI是一種敞開式質(zhì)譜成像技術(shù)，操作方便，且樣本分析過程不依賴噴涂基質(zhì)，對低質(zhì)量區(qū)物質(zhì)的檢測靈敏度高、代謝物覆蓋范圍寬。Lucy等[49]利用DESI-MSI技術(shù)可視化多種內(nèi)源性分子的空間分布，表征腫瘤異質(zhì)性區(qū)域和缺氧微環(huán)境，確定了MCTS的核心壞死區(qū)與外周增殖區(qū)，但DESI-MSI的空間分辨率在100 μm左右，使其在表征體外3D細(xì)胞球的微區(qū)代謝差異上存在一定的局限。

上述研究結(jié)果表明，質(zhì)譜成像技術(shù)與3D細(xì)胞模型相結(jié)合，可以在體外對藥物滲透、代謝等動力學(xué)過程進(jìn)行原位表征。通過對與細(xì)胞活性密切相關(guān)的代謝物進(jìn)行質(zhì)譜成像分析，可以直觀地呈現(xiàn)藥物作用后細(xì)胞球的活性變化，實現(xiàn)藥物毒性評價的可視化。將藥物的空間分布與空間分辨代謝組的改變進(jìn)行匹配，可以更精準(zhǔn)地發(fā)現(xiàn)藥物相關(guān)的作用靶點及潛在的毒性機(jī)制。此外，通過分析不同毒性機(jī)制藥物引起的細(xì)胞代謝表型，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)等算法構(gòu)建模型，將有望對未知藥物的毒性進(jìn)行評價與機(jī)制預(yù)測。質(zhì)譜成像結(jié)合3D肝細(xì)胞培養(yǎng)模型為體外藥物肝毒性評價提供了一種新策略。

3 體外藥物肝毒性評價研究進(jìn)展

肝毒性作為藥物毒理學(xué)研究的重要內(nèi)容，是國內(nèi)外許多學(xué)者研究的焦點，我國學(xué)者在體外藥物肝毒性評價方面做了許多重要工作。例如，解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肖小河與王伽伯研究員團(tuán)隊[50]基于體外3D HepG2細(xì)胞模型，準(zhǔn)確地預(yù)測了何首烏易感物質(zhì)順式與反式二苯乙烯苷的肝毒性。中國食品藥品檢定研究院馬雙成研究員課題組[51]利用3D肝細(xì)胞模型結(jié)合彗星實驗評價了大黃單蒽酮的體外肝毒性。蘇州大學(xué)張樂帥教授團(tuán)隊[18]對3D細(xì)胞模型構(gòu)建方法進(jìn)行創(chuàng)新，設(shè)計了基于模具與倒模技術(shù)的瓊脂糖壓印方法，能夠在單孔內(nèi)獲得大量的微組織，足以進(jìn)行qPCR，Western Blot等研究，顯著降低了培養(yǎng)成本。此外，沈陽藥科大學(xué)陳曉輝教授團(tuán)隊[52]通過將細(xì)胞代謝組學(xué)與血清藥理學(xué)相結(jié)合，確定了與芫花密切相關(guān)的9種顯著改變的差異代謝物與信號分子，揭示了芫花肝毒性的可能機(jī)制。具體來講，細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)在體外肝毒性的研究主要包括以下兩方面內(nèi)容。

3.1 研究肝毒性藥物的生物活化過程

常見的具有肝毒性藥物主要包括非甾體抗炎藥(NSAID)、抗感染藥(包括抗結(jié)核藥)、抗癌藥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥、心血管系統(tǒng)藥、用于代謝紊亂藥物、激素藥物及中藥[53]。通常認(rèn)為，藥物在肝臟經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化生成反應(yīng)性代謝產(chǎn)物，其可能會通過多種途徑引起細(xì)胞應(yīng)激。例如，細(xì)胞防御系統(tǒng)的消耗，以及與酶、脂質(zhì)、核酸和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)的結(jié)合，或直接抑制線粒體呼吸鏈，導(dǎo)致腺苷三磷酸(adenosime-triphosphate, ATP)耗竭、活性氧產(chǎn)生增加等，被認(rèn)為是導(dǎo)致肝毒的機(jī)制之一。因此，了解藥物的生物活化過程可以準(zhǔn)確地將化學(xué)與生物學(xué)相聯(lián)系，為了解藥物的肝毒性分子機(jī)制提供物質(zhì)基礎(chǔ)。Kim等[54]采用非靶向代謝組學(xué)方法鑒定伊曲康唑(ITZ)在人肝細(xì)胞與微粒體中的代謝產(chǎn)物，共發(fā)現(xiàn)10種ITZ代謝產(chǎn)物，其中包括7種新的代謝產(chǎn)物，但并未發(fā)現(xiàn)ITZ及其代謝產(chǎn)物與谷胱甘肽等發(fā)生加合，從藥物代謝角度證明了ITZ的安全性。Zhang等[55]使用非靶向高分辨質(zhì)譜技術(shù)研究了HepG2細(xì)胞中PCB11代謝和相關(guān)的代謝組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)30種不同的PBC11代謝產(chǎn)物，其中鄰苯二酚代謝物可能具有反應(yīng)性和毒性。Sascha等[56]基于HepaRG細(xì)胞研究了α-PBP和α-PEP兩種精神活性物的毒物代謝組學(xué)，結(jié)果顯示，兩種物質(zhì)均與氨基酸加合生成亞胺，可能與其毒性機(jī)制密切相關(guān)。

3.2 揭示藥物肝毒性機(jī)制與發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物

代謝組學(xué)可通過檢測已知或未知的與肝毒性機(jī)制相關(guān)的代謝途徑和代謝物，將代謝表型變化與毒性機(jī)制關(guān)聯(lián)起來[7,57]，有助于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物，以改進(jìn)DILI的診斷和治療。近10年來，基于質(zhì)譜技術(shù)的細(xì)胞代謝組學(xué)研究藥物肝毒性情況列于表2。結(jié)果顯示，藥物誘導(dǎo)肝毒性的主要原因是由于藥物或其活性代謝產(chǎn)物對細(xì)胞造成直接損害，此外藥物及其代謝產(chǎn)物可能與蛋白質(zhì)偶聯(lián)形成半抗原，引起免疫反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞受損。藥物肝毒性引起細(xì)胞代謝水平的變化主要包括脂質(zhì)代謝紊亂、磷脂病變、氧化應(yīng)激和膽汁積聚等。

表2 細(xì)胞代謝組學(xué)在體外藥物肝毒性評價中的應(yīng)用研究Table 2 Application of cell metabolomics technology in the study of in vitro liver toxicity

3.2.1脂肪變性與磷脂病變 脂肪變性和磷脂病變是2種不同的肝臟毒性效應(yīng)，其結(jié)果是不同類別的脂質(zhì)在肝臟中過度積累。Garcia-Canaveras等[7]通過HepG2細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，脂肪病變型肝損傷引起的代謝變化主要是三?；视王?triglyceride, TG)、二?；视王?diacylglyceride, DG)、磷脂(phospholipid, PL)和溶血磷脂(lysophospholipid, LysoPL)水平升高，脂肪酸(fatty acid, FA)水平降低；磷脂病變藥物主要引起PL、不飽和FA代謝紊亂。Garcia-Canaveras等[69]利用油酸和棕櫚酸等游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞研究藥物誘導(dǎo)肝脂肪變性和磷脂病變性，由于棕櫚酸和油酸可以加速脂質(zhì)的積累，且參與不同的脂質(zhì)代謝過程，從而能夠更好地鑒別2種脂代謝紊亂。結(jié)果表明，磷脂病變的藥物會顯著增加磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇的水平，而脂肪變性藥物主要誘導(dǎo)FA氧化和TG合成途徑代謝水平的改變，造成FFA、?；鈮A、單酰基甘油、DG及TG的變化。大量研究表明，F(xiàn)A可通過增加氧化應(yīng)激和激活炎癥途徑直接引起毒性[70]，其在體內(nèi)可以酯化生成TG并儲存在脂滴中，因此，TG的積累可能是一種保護(hù)機(jī)制，防止脂肪酸特別是不飽和脂肪酸的毒性作用[71]。FA、PL等水平發(fā)生改變會進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞活性氧產(chǎn)生，造成氧化應(yīng)激。與脂肪變性與磷脂病變肝損傷相關(guān)的常用藥物包括胺碘酮、丙戊酸、他莫昔芬、甲氨蝶呤，以及一些化療藥物和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。

3.2.2氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激是許多藥物引起肝毒性的常見原因，其中還原型谷胱甘肽與氧化谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)是細(xì)胞內(nèi)的主要氧化還原緩沖體系[72]，該比值的變化與早期線粒體氧化損傷相關(guān)[73]。此外，與黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenosine dinucleotide, FAD)、ATP、煙酰胺二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)等氧化還原相關(guān)的代謝通常與三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循環(huán)、嘌呤代謝途徑偶聯(lián)，也常表現(xiàn)對外源刺激的刺激敏感性。普遍認(rèn)為，對乙酰氨基酚(APAP)在高劑量暴露下產(chǎn)生肝毒性代謝產(chǎn)物N-乙酰-苯醌亞胺(NAPQI)，其會消耗細(xì)胞中的GSH，造成細(xì)胞氧化還原狀態(tài)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激。Zhang等[60]通過整合代謝組學(xué)與脂質(zhì)組學(xué)分析了三氯生給肝細(xì)胞帶來的代謝擾動，結(jié)果表明，在正常肝細(xì)胞中，三氯生會誘導(dǎo)嘌呤代謝和氨基酸代謝上調(diào)，脂質(zhì)蓄積，并增加活性氧(ROS)的產(chǎn)生，造成細(xì)胞氧化應(yīng)激。Garcia-Canaveras等[7]研究顯示，氧化應(yīng)激型肝毒性藥物會導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的谷氨酸、谷胱甘肽、氮、谷氨酰胺等代謝途徑發(fā)生改變，此外，包括FA、TG和PL代謝在內(nèi)的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)也發(fā)生了改變。但是，細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)在其他幾乎所有藥物暴露或者應(yīng)激過程中都會觀察到，不是肝毒性的特異性生物標(biāo)志物。

3.2.3膽汁積聚 膽汁酸(bile acids, BAs)在肝臟中由膽固醇合成，通過膽鹽輸出泵(bile salt export pump, BSEP)轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外。BSEP是主要的膽小管外排的轉(zhuǎn)運體，藥物介導(dǎo)的BSEP抑制可能是導(dǎo)致藥物膽汁淤積型肝損傷的機(jī)制之一[74]。BAs對細(xì)胞膜的溶解和破壞作用曾被認(rèn)為是BAs介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的主要機(jī)制[75]。有研究結(jié)果表明，細(xì)胞中的BAs含量不能造成顯著的膜溶解作用，而其毒性機(jī)制可能是由于BAs增加了胞質(zhì)的游離鈣，引起線粒體損傷，或通過控制炎癥因子的釋放、中性粒細(xì)胞募集等炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[76]。膽汁淤積型藥物肝損傷在體內(nèi)通常表現(xiàn)為肝臟和血清膽汁酸升高。Sharanek等[77]首次證明了一種膽汁淤積藥物可以誘導(dǎo)人HepaRG肝細(xì)胞內(nèi)BAs的積累，但是這種效應(yīng)是短暫的，由于體外膽汁淤積研究復(fù)雜，細(xì)胞可能仍然可以通過它們的基底外側(cè)轉(zhuǎn)運體排出積聚的胞內(nèi)BAs，因此體外代謝組學(xué)結(jié)果常顯示膽汁酸水平降低[78]。能夠影響B(tài)SEP活性的藥物可能會造成膽汁淤積型的肝損傷，包括環(huán)孢素A、利福平、奈法唑酮、格列本脲、曲格列酮和波生坦[79]等。

4 總結(jié)與展望

利用人源細(xì)胞開展藥物體外肝毒性評價具有許多優(yōu)點，如實驗可控性高、周期短、重復(fù)性高、可以減少動物的使用數(shù)量、飼養(yǎng)和護(hù)理成本等。肝細(xì)胞的選擇和培養(yǎng)方式在藥物體外肝毒性評價中非常關(guān)鍵，3D細(xì)胞培養(yǎng)模型顯著改善了細(xì)胞模型的性能，可以更好地維持肝臟的特異功能，提高預(yù)測毒副反應(yīng)的準(zhǔn)確性。單一細(xì)胞模型難以完全概括體內(nèi)肝細(xì)胞的形態(tài)、表型和功能，因此開發(fā)可靠、快速、高通量的細(xì)胞毒性評價模型仍然十分重要。

基于質(zhì)譜的細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)與多種生物學(xué)分析技術(shù)相互補(bǔ)充，已成為一種新型的發(fā)現(xiàn)毒理學(xué)評價生物標(biāo)志物與毒性機(jī)制的有效手段。目前的分析技術(shù)仍然存在許多挑戰(zhàn)，如單次分析代謝物的覆蓋度需要進(jìn)一步提高，代謝物鑒定與定量分析的難度大，以及樣本檢測的通量低等。二維液相色譜分離技術(shù)在改善單次分析過程中代謝物分辨率及覆蓋度方面具有優(yōu)勢，結(jié)合擬靶向分析策略可進(jìn)一步提高代謝物的檢測靈敏度與分析效率。納升電噴霧技術(shù)與基于掃描范圍拆分采集模式的流動注射質(zhì)譜降低了代謝組學(xué)分析的樣品用量及分析時間，有利于代謝組學(xué)的高通量分析。基于代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)對代謝物進(jìn)行注釋的MetDNA算法，可以改善標(biāo)準(zhǔn)品二級譜圖庫不足的問題，提高未知代謝物的注釋效率。此外，隨著質(zhì)譜成像技術(shù)的興起，可以在空間水平上直觀地反映藥物滲透、代謝等藥物代謝動力學(xué)信息，實現(xiàn)細(xì)胞代謝組的時空變化分析，將藥物、藥物代謝產(chǎn)物分布與細(xì)胞代謝水平同時定位和可視化，有助于更好地理解藥物毒性及其作用模式。

將細(xì)胞代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)的藥物肝毒性生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床用藥安全性評價的有效性仍需要深入驗證。代謝組學(xué)與計算機(jī)模型相結(jié)合的風(fēng)險評估策略有助于對所獲得的代謝信息進(jìn)行有效的挖掘和應(yīng)用，將藥物與毒性相關(guān)的代謝改變相關(guān)聯(lián)，從而實現(xiàn)藥物肝毒性的風(fēng)險預(yù)測。將細(xì)胞模型結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行肝毒性評價，能夠改善臨床前藥物肝毒性的預(yù)測，在化學(xué)藥與中藥肝毒性研究中已顯現(xiàn)出潛在應(yīng)用價值，基于3D細(xì)胞模型開發(fā)的具有體內(nèi)微環(huán)境的肝毒性評價系統(tǒng)，有望為生物制品的藥物毒理學(xué)研究提供新的思路和方法。