理論模擬和實驗對照研究幅值掃描ac對離子阱質(zhì)譜性能的影響

王偉民，靳留雨，徐福興，丁傳凡

(寧波大學(xué)，浙江省先進質(zhì)譜技術(shù)與分子檢測重點實驗室，質(zhì)譜技術(shù)與應(yīng)用研究院，材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

離子阱質(zhì)譜因優(yōu)異的靈敏度，相對較高的操作氣壓，可以進行時間上的串級質(zhì)譜分析，并且具有易于小型化等優(yōu)點，成為質(zhì)譜大家族中極具特色的質(zhì)量分析器，廣泛應(yīng)用于科研、軍工、航天、生命科學(xué)等領(lǐng)域。離子阱質(zhì)譜的發(fā)展可以分為4個階段：第1階段為質(zhì)量選擇性檢測(mass-selective detection)。1953年，Paul和Dehmelt教授[1]首次提出利用三維雙曲面離子阱囚禁帶電粒子，并因此獲得了1989年的諾貝爾物理學(xué)獎。第2階段為質(zhì)量選擇存儲(mass-selective storage)，Dawson和Whetten等[2]通過在阱的端蓋電壓上加載周期性的脈沖電壓實現(xiàn)離子的激發(fā)出阱，離子阱開始發(fā)展成為真正意義上的質(zhì)譜儀，但是該離子阱質(zhì)譜需要確保只有單個質(zhì)量離子進入阱中分析。第3階段為質(zhì)量選擇激發(fā)(mass-selective ejection)。George Stafford，Kelly等[3-4]發(fā)展了質(zhì)量選擇不穩(wěn)定檢測模式，通過掃描射頻電壓，離子從阱中按照質(zhì)量順序從低到高激發(fā)出阱，質(zhì)量對離子信號強度形成了質(zhì)譜圖。第4階段為離子阱質(zhì)譜的小型化(miniaturization)。Cooks教授課題組[5]發(fā)展了圓柱離子阱、矩形離子阱質(zhì)量分析器等；Austin教授[6]發(fā)展了環(huán)形離子阱；Schwartz等[7]發(fā)展了雙曲面線性離子阱；Ding等[8-9]發(fā)展了PCB離子阱、三角離子阱等，這一系列性能優(yōu)異的小型化離子阱質(zhì)量分析器，不僅克服了傳統(tǒng)三維離子阱分析器難以加工的缺點，而且進一步降低了成本、簡化了操作，實現(xiàn)了小型化。

通過在離子阱的徑向或軸向上加載偶極ac(alternating current)電壓，是實現(xiàn)離子阱質(zhì)量選擇不穩(wěn)定檢測模式的重要途徑。根據(jù)經(jīng)典的馬修方程，當(dāng)設(shè)定離子阱環(huán)電極上浮直流DC為0(U=au=0)時，所有離子的馬修坐標(biāo)被固定在穩(wěn)定性圖的q軸上，接著，利用主射頻幅值或者頻率掃描來實現(xiàn)操縱離子的q值在橫軸上移動，并且當(dāng)q值達到激發(fā)點時，如q=0.908(三維離子阱質(zhì)量分析器)，阱中離子按照質(zhì)量從小到大的順序依次激發(fā)出阱。共振激發(fā)也具有類似的檢測模式，但其是通過外加微弱的偶極ac實現(xiàn)在穩(wěn)定性圖的橫軸上設(shè)定特殊的qeject，當(dāng)離子的q值接近qeject時，相應(yīng)方向上離子的久期頻率ω與ac的共振頻率ωac發(fā)生諧振，同時，離子的動能劇烈升高，從而共振激發(fā)彈出離子阱。研究表明，離子阱質(zhì)譜使用共振激發(fā)彈出有利于提高離子阱質(zhì)譜的質(zhì)量范圍和靈敏度，尤其可以提高離子阱質(zhì)譜的分辨率[10]。

目前，離子阱中的共振激發(fā)方法主要有兩種：一種是通過偶極激活的方法(dipolar resonance excitation)，即在離子阱的1對電極上施加輔助的交變電壓；另一種是通過四極共振激發(fā)的方法(quadrupolar resonance excitation)，即在離子阱的2對電極上施加反相的輔助交變電壓[11]。徐偉等[12]結(jié)合四極激發(fā)和偶極激發(fā)，提高了小型化線性離子阱質(zhì)譜中的離子碎裂效率，質(zhì)量分辨率和靈敏度提高了2倍以上，并且解決了阱中心位置零電勢難以有效激活離子的問題。傳統(tǒng)的共振激活所用的交變電場都是固定頻率掃描，Synder等[13]發(fā)展了久期頻率掃描型激發(fā)方式，即通過使用ac頻率的掃描調(diào)整qeject值，從而代替?zhèn)鹘y(tǒng)的主射頻掃描，簡化了儀器的電源結(jié)構(gòu)，拓寬了離子阱質(zhì)譜的質(zhì)量范圍。對于以上這兩種激發(fā)方式，ac幅值一般設(shè)定為1個很小的恒定值(1 V0-p)，或者1個很小的掃描范圍。離子阱共振激發(fā)過程的理論模擬和實驗驗證對深入研究提高離子阱質(zhì)譜性能具有重要的基石作用。然而，鮮有人對比研究過ac的幅值掃描設(shè)定對離子阱質(zhì)譜分辨率等相關(guān)性能的影響，也尚未有人將該實驗結(jié)果用理論模擬的方式進行研究。

本工作擬基于自行搭建的小型連續(xù)進樣接口離子阱質(zhì)譜平臺，利用納升電噴霧電離源，以利血平為研究對象，通過理論模擬和實驗對照研究掃描共振激發(fā)對離子阱質(zhì)譜性能的影響。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

實驗室自行搭建的小型化連續(xù)進樣離子阱質(zhì)譜儀的整體示意圖示于圖1a，主要包括納升電噴霧離子源(nano-ESI)、實驗室自行設(shè)計的小型離子漏斗、線性離子阱質(zhì)量分析器、電子倍增器(Detector Technology, Inc., Palmer, MA，Model 397)和真空系統(tǒng)；微量注射泵(Harvard HA 3000I，Harvard Apparatus公司)用于向電噴霧毛細管進樣。線性離子阱質(zhì)量分析器(x0=5.0 mm，y0=4.0 mm，z0=50.2 mm)徑向橫截面的上下電極加載有線性掃描的主射頻電壓，頻率為1.1 MHz；左右電極上加載有反向的輔助共振ac電壓，頻率為346 kHz，示于圖1b；后端蓋電極上加載有恒定的正電壓；前端蓋電極上加載有脈沖的正電壓，用于離子的門控電壓，主射頻電壓的掃描速度約為50 V/ms。電子倍增器位于離子阱的徑向，加載有恒定的負高壓，約為-1 100 V，用于接收離子阱中按照質(zhì)量順序彈出的正離子。儀器的總電壓時序圖示于圖1c。質(zhì)譜的真空系統(tǒng)由4 L/s的單相異步電動機(VALUE)和80 L/s的分子泵(Pfeier Vacuum Inc., Nashua, NH, Pfeier HiPace 30)組成，將真空腔體抽至0.05 Pa。小型離子漏斗由30片電極板組成，每片電極厚度0.33 mm，離子阱漏斗電極的中心有隨軸向半徑遞減的圓孔，每片電極之間通過陶瓷電極片絕緣，厚度皆為1.0 mm，離子漏斗的總長度為35.0 mm。每片電極上串聯(lián)10 MΩ電阻，用于將直流電壓分壓，從而在漏斗的軸向上形成梯度電壓。將幅值相等相位相反的射頻電壓加載到相鄰的2片電極上，主要的儀器參數(shù)列于表1。

表1 小型化連續(xù)進樣離子阱質(zhì)譜儀的主要儀器參數(shù)Table 1 Main instrument parameters of miniaturized ion trap mass spectrometer with continuous atmospheric pressure interface

1.2 主要材料與試劑

利血平：上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；精氨酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；芬太尼、那可汀、可卡因標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 g/L)：北京芬格爾安有限公司產(chǎn)品；甲醇、甲酸：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；超純水：使用Milli-Q凈水系統(tǒng)制備，美國Millipore公司產(chǎn)品。

用甲醇溶解利血平、精氨酸和芬太尼固體，配制成1 000 mg/L的母液，存儲；然后通過體積比稀釋至所需濃度，制成工作溶液。

1.3 實驗過程

樣品的整個檢測過程是：首先將待測樣品通過移液槍注入電噴霧石英毛細管，然后將安裝好的納升電噴霧電離源的針尖以30°朝向連續(xù)進樣離子阱質(zhì)譜的進樣口，接著在離子源上加載高壓(3 000 V)，使待測物在離子源尖端產(chǎn)生噴霧，形成帶電粒子，由于離子源和質(zhì)譜儀的金屬毛細管形成電勢差，使得帶正電的粒子進入質(zhì)譜金屬毛細管，經(jīng)由離子漏斗傳輸至離子阱質(zhì)量分析器。儀器的整個時序示于圖1c。離子漏斗傳輸?shù)碾x子在離子阱的前端蓋電壓脈沖下降的一段時間(Ⅰ)內(nèi)進入阱中，并在射頻電壓的作用下存儲一段時間，其后電子倍增器在時序(Ⅱ)中提前開啟，離子阱上的射頻電壓和輔助共振電壓將在時序(Ⅲ)內(nèi)激發(fā)彈出阱內(nèi)的離子，帶電粒子進入電子倍增器中進行檢測，并由計算機經(jīng)過傅里葉變換將時域信號轉(zhuǎn)換為頻域信號，形成檢測物的質(zhì)譜圖，最后清空阱內(nèi)的離子(Ⅳ)。需要注意的是，對于固定頻率共振ac電壓的設(shè)定通常有掃描幅值型ac和恒定幅值型ac兩種，雖然它們都可以將離子阱中的離子通過共振激發(fā)彈出，但是對于質(zhì)譜分辨率等性能的影響，尚未用實驗或者理論模擬的方法進行對比研究。

注：在時序Ⅲ中，虛線表示掃描幅值型ac的電壓變化，實線表示恒定幅值型ac的電壓變化圖1 小型化連續(xù)進樣離子阱質(zhì)譜儀的整體示意圖(a)；離子阱質(zhì)量分析器上的電壓加載示意圖(b)；離子阱質(zhì)譜儀的工作時序圖(c)Fig.1 Schematic of miniaturized ion trap mass spectrometry with continuous atmospheric pressure interface (a); schematic diagram of voltage loading on ion trap mass analyzer (b); timing sequence of ion trap mass spectrometry (c)

1.4 建立理論模擬方法

為了研究離子阱內(nèi)離子的運動軌跡和共振激發(fā)變化，并產(chǎn)生相應(yīng)的質(zhì)譜圖，選擇Simion軟件計算離子的運動時間和位置，總體的方法流程示于圖2a。簡單介紹如下：1) 啟動Simion 8.1軟件；2) 建立離子阱三維模型；3) 利用Simion軟件計算出離子阱電場中每一點的電勢；4) 設(shè)定離子初始狀態(tài)；5) 編寫Lua文件控制離子阱電極上電壓變化和數(shù)據(jù)采集、處理等內(nèi)容；6) 模擬飛行離子，分析模擬結(jié)果。本研究中，離子阱的工作模式為射頻幅值掃描型離子阱，射頻的頻率設(shè)定為0.936 MHz，幅值掃描范圍為300～1 000 V0-p，所加的ac頻率為335 kHz，約為主射頻的1/3。當(dāng)離子的運動頻率與共振激發(fā)ac頻率接近時發(fā)生共振運動，離子阱內(nèi)離子的振幅增大，以致被逐出離子阱并被安置在離子阱外的靶板捕捉和記錄，形成質(zhì)譜信號。模擬過程中，通過線性增加RF幅值實現(xiàn)質(zhì)量從小到大依次共振。

離子在離子阱中的初始狀態(tài)為：離子與氣體的碰撞過程采用簡化的硬球碰撞模型，碰撞氣為氦氣，氣壓0.798 MPa，氣體溫度300 K。選擇m/z609離子作為檢測物，離子碰撞截面為2.8 nm2。在模擬質(zhì)譜分析過程中，每種離子取200個用于離子冷卻和質(zhì)量分析過程的模擬計算，不考慮空間電荷效應(yīng)的影響，離子的初始位置為高斯分布，以離子阱x=0，y=z=0為中心，x、y、z方向分布半徑均為0.1 mm。根據(jù)圖1c中離子阱質(zhì)譜的整個運動時序，可以編寫相應(yīng)的Lua控制文件，在冷卻時間內(nèi)，離子的運動軌跡示于圖2b，而在離子共振激發(fā)彈出阱時的軌跡示于圖2c。最后，通過統(tǒng)計分析靶板上所有離子的激發(fā)時間和數(shù)量可以得到相應(yīng)的質(zhì)譜圖。

圖2 Simion理論模擬研究離子阱內(nèi)離子運動的方法流程圖(a)；離子在阱中穩(wěn)定存儲時的運動軌跡圖(b)；離子在共振激發(fā)時的運動軌跡圖(c)Fig.2 Flow chart of Simion simulation method for ion movement in ion trap (a); trajectories of ions stored in a trap (b); trajectories of ions excited by resonance (c)

2 結(jié)果與討論

2.1 ac幅值掃描方式對離子阱質(zhì)譜性能的影響

為了研究ac掃描方式對離子阱質(zhì)譜性能的影響，需要固定相關(guān)參數(shù)，包括主射頻電源的掃描幅值范圍、主射頻的頻率、共振ac的頻率、各個時序的工作時間，列于表1。使用穩(wěn)定的納升電噴霧作為電離源，并以分子質(zhì)量和靈敏度適中的100 mg/L利血平為研究對象，使用利血平分子離子峰m/z609[M+H]+的半高峰寬(FHMW)和峰強度計算分辨率和信號強度。值得一提的是，使用(m/FHMW)計算分辨率[14]。

本實驗優(yōu)化了ac的起始電壓值，即在不同的恒定共振ac電壓值時，離子阱質(zhì)譜分辨率和靈敏度的變化示于圖3a?？梢杂^察到，ac的設(shè)定值對離子阱質(zhì)譜的分辨率和信號強度均有影響。當(dāng)ac電壓的設(shè)定值小于0.6 V時，質(zhì)譜的分辨率只能達到100左右，信號強度也只能達到50以下，這可能是離子從低真空離子阱中彈出需要越過離子阱的勢阱深度，過低的ac共振電壓無法提供足夠的動能使離子掙脫勢阱而從阱中彈出[15]；當(dāng)ac電壓高于0.6 V，隨著ac幅值的增大，質(zhì)譜的分辨率呈先升高后降低的趨勢，并且在ac=1.2 V附近出現(xiàn)最大值，約為350，然而對樣品信號強度的后續(xù)影響并不十分明顯，可能是當(dāng)ac幅值過大時，導(dǎo)致離子共振激發(fā)時間提前，偏離了真正的共振激發(fā)點[16]，對阱中離子的彈出效率并沒有影響。

為了去除ac初始電壓這一變量，設(shè)定ac起始電壓為0.6 V。在固定ac起始電壓時，不同掃描速率離子阱質(zhì)譜的分辨率和靈敏度變化示于圖3b?？梢园l(fā)現(xiàn)，當(dāng)掃描速率為0，即ac電壓保持0.6 V不變時，質(zhì)譜的分辨率較差；當(dāng)掃描速率不斷升高，分辨率和靈敏度存在最佳值，此時的掃描速率約為0.003 mV/ms。這一現(xiàn)象與不同恒定共振ac電壓時共振激發(fā)離子分辨率和靈敏度變化的原因類似?？偟膩碚f，當(dāng)離子阱的共振ac頻率設(shè)定后，離子的共振激發(fā)點qeject也隨之確定[17]。為了更有效地將離子從阱中共振彈出，一方面要克服阱中心的贗勢，另一方面要減小在共振激發(fā)前ac對離子阱中四極場的干擾，避免影響離子的運動軌跡。下面將通過理論模擬實驗對照方式證明以上的實驗結(jié)果。

圖3 不同的恒定起始共振ac電壓值時，離子阱質(zhì)譜分辨率和靈敏度的變化(a)；固定ac電壓起始掃描點，不同掃描速率時離子阱質(zhì)譜分辨率和靈敏度的變化(b)Fig.3 Variation of resolution and sensitivity of ion trap mass spectrometry with different constant initial resonant ac voltages (a); variation of resolution and sensitivity of ion trap mass spectrometry with different scanning rates at fixed initial point of ac resonant voltage (b)

2.2 理論模擬研究ac幅值掃描方式對離子阱質(zhì)譜性能的影響

利用經(jīng)典的離子光學(xué)模擬軟件Simion對離子阱中離子的運動軌跡進行模擬，相關(guān)的理論模擬方法和流程示于圖2，仍然以利血平母離子m/z609為研究對象。利用Lua語言在Simion中進行電壓施加，值得一提的是，對于線性離子阱徑向上下2個電極通過程序代碼“floatDC +Urf*sin(theta+ion_time_of_flight*omegarf)”加載，左右2片電極則分別為“floatDC+Uac*sin(theta+ion_time_of_flight*omegaac)-Urf*sin(theta+ion_time_of_flight*omegarf)”和“floatDC-Uac*sin(theta+ion_time_of_flight*omegaac)-Urf * sin(theta+ion_time_of_flight*omegarf)”，從而實現(xiàn)在離子阱穩(wěn)定性圖上設(shè)定特殊的共振qeject，以達到將阱中離子共振激發(fā)彈出的目的。

Simion固定ac電壓起始掃描點，不同掃描速率時，離子阱質(zhì)譜分辨率和統(tǒng)計離子個數(shù)的變化示于圖4。圖中橫軸是掃描速度的變化，已知主射頻的掃描速度可以線性轉(zhuǎn)換為離子的質(zhì)量，縱軸是在設(shè)定的采集速度下Simion統(tǒng)計的檢測器上離子個數(shù)。通過對每個采集點得到的質(zhì)譜圖進行擬合計算，可以求得峰高和半峰寬，進而求得所需的分辨率數(shù)值。可以發(fā)現(xiàn)，該譜圖中掃描速度的設(shè)定同樣存在最佳值，與圖3的實驗結(jié)果相似，但其所需的掃描速度更大，約為0.02 mV/ms，可能是Simion對于低真空下的運動狀態(tài)存在仿真誤差。在圖4a中選取3個掃描速度下的離子運動軌跡進行對比，它們具有不同的質(zhì)譜分辨率，即掃描速率為0 mV/ms，質(zhì)量分辨率<100(i)；掃描速率為0.02 mV/ms，質(zhì)量分辨率>500(ii)；掃描速率為0.045 mV/ms，質(zhì)量分辨率<100(iii)的離子運動軌跡，示于圖4b?？梢园l(fā)現(xiàn)，使用不同的掃描速率時，離子從阱中共振激發(fā)的時間點是不同的，對于iii，離子可以提前激發(fā)，而對于i，由于共振ac的掃描速率過低，導(dǎo)致離子延遲激發(fā)，離子會在阱中心弛豫一段時間，進而降低離子阱質(zhì)譜的分辨率[18]。綜合以上實驗和理論模擬對照，使用掃描ac共振激發(fā)有利于提高離子阱質(zhì)譜的分辨率，然而，具體提高的程度需要結(jié)合多個樣品的檢測結(jié)果進行量化。理論模擬還發(fā)現(xiàn)，達到最佳ac共振激發(fā)條件后，繼續(xù)增大ac的掃描速度對離子阱質(zhì)譜的信號靈敏度沒有顯著影響。

圖4 Simion固定ac電壓起始掃描點，不同掃描速率時離子阱質(zhì)譜分辨率和離子個數(shù)的變化(a)；Simion模擬的不同掃描ac共振電壓時離子的運動軌跡(b)Fig.4 Simion simulated the variation of resolution and sensitivity of ion trap mass spectrometry with different scanning rates at fixed initial point of ac resonant voltage (a); Simion simulated the ion trajectories of voltage-scanning ac (b)

2.3 進一步實驗測試應(yīng)用

為了進一步證明以上實驗和理論模擬的研究成果，選擇了更多的研究對象進行測試，從而盡量覆蓋離子阱質(zhì)譜的質(zhì)量范圍。選擇芬太尼(m/z336.37)和那可汀(m/z413.42)為研究對象，用甲醇-水溶液(1∶1，V/V)配制100 mg/L的工作溶液，使用0.6～1.2 V掃描共振ac激發(fā)電壓，示于圖5a、5b，使用恒定的1.2 V共振ac激發(fā)電壓，示于圖5c、5d。圖中m/z337是芬太尼結(jié)合1個質(zhì)子的分子離子峰[M+H]+，m/z359是結(jié)合1個Na+的質(zhì)譜峰，m/z414是那可汀的分子離子峰[M+H]+，m/z437是結(jié)合1個Na+的質(zhì)譜峰。圖5a～5d中分別內(nèi)嵌了分子離子峰的放大圖，并標(biāo)記出對應(yīng)的半峰寬，可以觀察到使用掃描共振ac激發(fā)電壓時，芬太尼和那可汀的分子離子峰的半峰寬分別為1.05和1.14；而使用恒定的共振ac激發(fā)電壓時，分子離子峰的半峰寬分別為1.57和1.33。通過以上對比可以證明，使用掃描ac共振激發(fā)有利于提高離子阱質(zhì)譜的分辨率，相比于恒定掃描ac共振激發(fā)可以減小半峰寬約30%左右，然而對靈敏度的變化幾乎沒有太大影響。

注：a.掃描共振ac激發(fā)得到的芬太尼質(zhì)譜圖；b.掃描共振ac激發(fā)得到的那可汀質(zhì)譜圖；c.恒定共振ac激發(fā)得到的芬太尼質(zhì)譜圖；d.恒定共振ac激發(fā)得到的那可汀質(zhì)譜圖圖5 不同共振ac激發(fā)方式下，兩種不同目標(biāo)物的離子阱質(zhì)譜圖Fig.5 Ion trap mass spectra of two different targets under different resonant ac ejection modes

3 結(jié)論

本研究基于自行搭建的小型連續(xù)進樣接口離子阱質(zhì)譜平臺，利用納升電噴霧電離源，以利血平為研究對象，首先研究了恒定ac共振激發(fā)和掃描ac共振激發(fā)對離子阱質(zhì)譜分辨率和靈敏度的影響。結(jié)果表明，使用掃描共振ac激發(fā)有利于提高離子阱質(zhì)譜的分辨率和靈敏度，隨后，通過利用Simion離子光學(xué)證明了掃描共振激發(fā)ac相比于恒定共振激發(fā)ac可以防止離子過于提前激發(fā)，并且減小對阱中四極場的干擾。進一步的應(yīng)用實驗表明，利用掃描ac共振激發(fā)相比于恒定ac共振激發(fā)可將分辨率提高2倍以上，靈敏度的影響則沒有顯著改善。然而，實驗中所使用的線性離子阱分辨率還不夠高，未來將使用實驗室自行設(shè)計的高分辨三角離子阱進行測試。同時，將研究掃描共振ac相比于恒定共振ac時，離子阱中時間串聯(lián)時，碰撞誘導(dǎo)解離效率的變化。