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    免疫球蛋白G糖基化修飾的質(zhì)譜分析方法及其應(yīng)用

    2021-09-24 02:06:22賴治臻周巾煜李智立
    質(zhì)譜學(xué)報 2021年5期
    關(guān)鍵詞:重鏈糖鏈糖肽

    賴治臻,周巾煜,李智立

    (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院,北京 100005)

    免疫球蛋白(Ig)是一類與抗原特異性結(jié)合,具有免疫功能的糖蛋白。依據(jù)重鏈氨基酸序列的不同可分為IgG、IgM、IgA、IgD、IgE五類,其中,IgG是人體血液中含量最高的免疫球蛋白,約占免疫球蛋白總量的75%~80%[1]。當(dāng)人體受到非己成分入侵或自身細(xì)胞衰老、損傷、病變時,IgG不僅可以識別異常細(xì)胞,還可以通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)、補體依賴的細(xì)胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC)以及抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用 (antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP)等效應(yīng)功能發(fā)揮免疫效應(yīng)。在過去的幾十年間,國內(nèi)外學(xué)者利用IgG的分子結(jié)構(gòu)特征,監(jiān)測機體內(nèi)IgG在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的變化規(guī)律,探索其作為自身免疫性疾病和癌癥等疾病的生物標(biāo)志物的潛力,并設(shè)計了基于靶向IgG的治療藥物,為疾病的診療提供了新途徑[1]。

    與核酸和蛋白質(zhì)合成相比,糖鏈合成沒有固定的模板,并且糖鏈具有復(fù)雜的分支結(jié)構(gòu)、連接方式和空間構(gòu)型,這使得糖基化修飾分析成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表征中最具挑戰(zhàn)性的任務(wù)之一。隨著基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)和電噴霧電離(ESI)技術(shù)的發(fā)展,質(zhì)譜技術(shù)已成為蛋白質(zhì)糖基化修飾研究中廣泛應(yīng)用的分析手段。然而,糖蛋白的高動態(tài)范圍、糖基化修飾固有的低豐度、與無糖基化修飾肽段的共存等所導(dǎo)致的離子抑制以及糖鏈結(jié)構(gòu)的高度異質(zhì)性等因素,使得質(zhì)譜技術(shù)表征蛋白糖基化修飾面臨挑戰(zhàn)[2]。2019年,全球76個實驗室采用不同技術(shù)方法從完整糖蛋白、糖肽或糖鏈等不同層面對單克隆抗體蛋白NISTmAb的糖基化修飾進行鑒定,發(fā)現(xiàn)抗體高豐度聚糖的質(zhì)譜鑒定結(jié)果的重復(fù)性較好,而低豐度聚糖鑒定結(jié)果的重復(fù)性較差[3]。本文將綜述IgG糖鏈、糖肽和完整糖蛋白水平的質(zhì)譜分析方法,及其在疾病研究和藥物研發(fā)中的應(yīng)用。

    1 IgG的結(jié)構(gòu)

    1.1 IgG的合成

    Ig的多肽鏈由3個常染色體基因編碼,這3個基因簇分別被稱為H-、κ-和λ-基因家族,分別編碼所有亞類的重鏈、κ-輕鏈、λ-輕鏈。人類的H、κ、λ基因家族分別在14號、2號、22號染色體上。每個重鏈由4種不同類型的基因片段編碼,分別為可變區(qū)(VH)、多變區(qū)(D)、連接區(qū)(JH)和恒定區(qū)(CH)。Ig分子的輕鏈由VL、JL和CL 3個基因片段編碼,重鏈的可變區(qū)域由VH、D、JH段編碼。CH的基因片段決定重鏈的類別,而VH、D和JH區(qū)域決定免疫球蛋白分子的抗原識別部分。Ig根據(jù)其重鏈類型α、δ、ε、γ、μ可分為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五種類型。VH、D和JH基因片段共同編碼IgG重鏈的可變區(qū),Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4基因片段分別編碼IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定區(qū),編碼基因轉(zhuǎn)錄成mRNA后,在核糖體中分別翻譯成IgG輕鏈和重鏈分子,最后由2條相同的輕鏈(約25 kDa)和2條相同的重鏈(50~70 kDa)經(jīng)二硫鍵組裝為完整的IgG分子。二硫鍵位于CH1和CH2之間的鉸鏈區(qū),鉸鏈區(qū)不僅負(fù)責(zé)連接2條重鏈,還影響抗原結(jié)合片段(Fab)與結(jié)晶片段(Fc)間的靈活性。其中,F(xiàn)ab由VL、CL、VH、CH1組成,負(fù)責(zé)與抗原相結(jié)合;Fc由CH2和CH3組成,負(fù)責(zé)行使效應(yīng)功能,示于圖1。

    1.2 IgG亞類

    IgG重鏈恒定區(qū)的差異主要表現(xiàn)在鉸鏈區(qū)氨基酸數(shù)目、二硫鍵數(shù)目和氨基酸序列的不同,可分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四個亞類[4],示于圖2,從而導(dǎo)致IgG與protein A、protein G、補體分子(C1q)、Fcγ受體(FcγR)等蛋白的結(jié)合能力不同,列于表1。IgG亞類在人體免疫系統(tǒng)中分別承擔(dān)不同的功能。抗體對某些抗原反應(yīng)的刺激可導(dǎo)致某些IgG亞類的選擇性增加[5-6]。IgG1鉸鏈區(qū)域包含15個氨基酸殘基和2個鏈間二硫鍵,其Fab片段可繞其對稱軸旋轉(zhuǎn),IgG2鉸鏈區(qū)有12個氨基酸殘基和4個鏈間二硫鍵[7],IgG3鉸鏈區(qū)包含62個氨基酸殘基(21個脯氨酸和11個半胱氨酸)和11個鏈間二硫鍵,形成了1個多脯氨酸雙螺旋結(jié)構(gòu)[7],IgG4鉸鏈區(qū)包含12個氨基酸殘基和2個鏈間二硫鍵,其鉸鏈區(qū)柔性順序為IgG3>IgG1>IgG4>IgG2[8]。

    表1 IgG結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性Table 1 Structures and biological characteristics of IgG

    注:輕鏈:2號和3號染色體分別編碼κ和λ輕鏈,經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程,產(chǎn)生不同的輕鏈;重鏈:14號染色體上VH、D、JH基因片段共同編碼IgG重鏈的可變區(qū)(VH);Cγ1、Cγ2、Cγ3和 Cγ4基因片段經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程,分別產(chǎn)生IgG1、IgG2、IgG3和IgG4分子;此外,分別編碼IgM、IgD、IgA1、IgE和IgA2的基因片段Cμ、Cδ、Cα1、Cε和Cα2也位于14號染色體上圖1 IgG重鏈和輕鏈的合成過程Fig.1 Synthesis process of IgG heavy chain and light chain

    2 IgG糖基化修飾

    蛋白質(zhì)糖基化修飾可改變效應(yīng)蛋白的溶解度、半衰期以及與受體的相互作用等,從而影響其生理特性[9-11]。根據(jù)糖鏈與蛋白連接方式的不同,糖基化修飾主要分為N-連接和O-連接兩種:大多數(shù)IgG分子僅在重鏈CH2區(qū)的Asn297位點連接N-糖鏈,約10%~20%的IgG分子在Fab區(qū)有N-糖基化修飾;少數(shù)IgG分子有O-糖基化修飾。N-糖鏈結(jié)構(gòu)一般分為高甘露糖型、雜合型和復(fù)雜型3種類型。N-糖鏈均有1個共同的五糖(GlcNAc2Man3)核心結(jié)構(gòu)[12]。IgGN-糖鏈多為雙天線復(fù)雜型,常帶有核心巖藻糖殘基(Fuc)、平分型N-乙酰葡糖胺殘基(GlcNAc)、末端半乳糖殘基(Gal)或末端唾液酸殘基(Neu5Gc)修飾。

    3 IgG糖基化修飾的質(zhì)譜分析方法

    由于蛋白糖基化修飾具有高度的異質(zhì)性,且豐度較低,一般在質(zhì)譜鑒定前需要進行樣本的前處理。目前,對IgG糖基化修飾的分析主要從糖鏈、糖肽和完整糖蛋白3個不同視角解析糖基化修飾狀態(tài)和類型。

    3.1 IgG的分離純化方法

    為滿足基礎(chǔ)或臨床研究的需要,基于蛋白質(zhì)相互作用原理的protein A和protein G親和純化方法已逐漸取代了硫酸銨沉淀法[14],并成為目前從血液中分離IgG的常用方法。聚丙烯酰胺凝膠電泳也常用于IgG的分離,但存在回收蛋白較難、分離效率較低等問題。

    注:IgG根據(jù)氨基酸序列不同可分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4;IgG糖基化修飾N-連接的三種糖鏈類型:除由2個N-乙酰葡萄糖胺和3個甘露糖組成的五糖核心外,因單糖的種類和連接方式的不同N-糖鏈可分為高甘露糖型、復(fù)雜型和雜合型;O-連接的8種核心型糖鏈:O-糖鏈通過N-乙酰半乳糖胺與肽鏈相連,按N-乙酰半乳糖胺3位或6位上β連接的半乳糖、β連接的N-乙酰葡萄糖胺和α連接的N-乙酰半乳糖胺可分為8種核心型圖2 IgG亞類結(jié)構(gòu)及糖基化修飾的異同F(xiàn)ig.2 Similarities and differences of glycosylation of IgG subclass structures

    3.2 糖鏈的分析

    3.2.1糖鏈釋放方法 糖鏈釋放可采用生物酶解和化學(xué)水解的方法。N-糖苷酶F(PNGase F)[15]、N-糖苷酶A(PNGase A)[16]、糖苷內(nèi)切酶H(Endo H)[17]和糖苷內(nèi)切酶S(Endo S)[18]是常用的從蛋白質(zhì)氨基酸鏈上酶解糖鏈的糖苷酶。PNGase F可用于糖肽或完整蛋白上連接的糖鏈釋放[15];Endo H僅可酶解高甘露糖型寡糖鏈[19]。肼解法[20]、高碘酸氧化-β消除法[21]、三氟乙酸法[22]、三氟甲磺酸法[23]等是常用的化學(xué)水解法,其中肼解法可實現(xiàn)對肽段上N-糖鏈和O-糖鏈的同時釋放[24-25]。

    3.2.2糖鏈衍生方法 為提高檢測糖鏈的靈敏度,通常利用熒光標(biāo)記試劑(如2-氨基苯甲酰胺(2-AB)[26]、2-氨基苯甲酸(2-AA)[27]和2-氨基吡啶(PA)[28])衍生,隨后采用液相色譜分離,紫外光譜分析。研究發(fā)現(xiàn),HPLC-MS分析2-AA標(biāo)記的糖鏈靈敏度高于2-AB標(biāo)記[29]。利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生糖鏈結(jié)合離子遷移質(zhì)譜,可實現(xiàn)對糖鏈異構(gòu)體的分離[30]。利用8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(APTS)標(biāo)記結(jié)合離子對輔助萃取(IPAE)與親水作用色譜(HILIC),可實現(xiàn)對糖鏈的分離純化[31]。

    3.2.3糖鏈純化方法 純化標(biāo)記糖鏈的主要策略有固相萃取(SPE)[29]、凝膠色譜[32-34]和熒光標(biāo)記法[35]。固相萃取利用分析物在固定相中的吸附能力不同純化糖鏈,常用的固定相有反相(RP)填料、多孔石墨化碳(PGC)、HILIC和高效陰離子交換色譜(HPACE) 填料等,各分離方法的特點列于表2。利用HILIC-SPE可富集糖樣本[36],PGC-LC-ESI MS聯(lián)用技術(shù)可同時對糖蛋白中的N-糖鏈和O-糖鏈混合物進行分離鑒定[37-38]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展,已開發(fā)出不同策略的IgG糖鏈純化方法[39-41]。

    表2 常用的糖鏈分離純化方法Table 2 Typical methods for glycan chain separation and purification

    3.2.4糖鏈的質(zhì)譜分析 糖鏈質(zhì)譜分析常用的離子化技術(shù)為MALDI和ESI,二者均為軟電離技術(shù),具有很強的互補性,并兼具高通量、高分辨率、高靈敏度等特點,但由于離子化可能引起唾液酸殘基等不穩(wěn)定糖苷鍵的斷裂,分析前需要對糖鏈進行(全)甲基化衍生或?qū)ν僖核釟埢M行衍生保護[49]。其中,MALDI是一種快速、簡單的糖鏈離子化方法,對鹽等干擾物的耐受力強,因電離產(chǎn)生的離子多為單電荷而便于解析;ESI-MS與液相色譜聯(lián)用可實現(xiàn)對復(fù)雜糖鏈混合物的在線分離。此外,結(jié)合各種離子碎裂技術(shù)可利用串聯(lián)質(zhì)譜對糖鏈結(jié)構(gòu)進行鑒定。

    3.3 糖肽水平的質(zhì)譜分析

    3.3.1IgG糖肽的制備 糖鏈水平的分析不能提供其連接位點的信息,而在IgG糖肽水平上的分析不僅可獲得糖型信息,還可獲得糖基化修飾位點的信息[50]。用胰蛋白酶[51]、谷氨酸蛋白酶(Glu-C)[52]、賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(Lys-C)[53-54]和木瓜蛋白酶[55-56]、胃蛋白酶[57]、鏈球菌IgG降解酶(IdeS)[58-59]和鏈霉蛋白酶[60]等可獲得特異性或非特性的IgG糖肽。

    3.3.2糖肽的富集 凝集素親和法:凝集素是一類糖結(jié)合蛋白,能專一地識別某一特殊結(jié)構(gòu)的單糖或聚糖中特定的糖基序列,并與之發(fā)生非共價且可逆的結(jié)合[61]。一種凝集素僅能富集某一特殊結(jié)構(gòu)的糖鏈,很難實現(xiàn)對不同種類糖鏈結(jié)構(gòu)的同時分析[62]?;瘜W(xué)反應(yīng)法:糖鏈具有特殊的多羥基、醛基等結(jié)構(gòu),可與化學(xué)材料分子的特殊官能團發(fā)生反應(yīng),形成較穩(wěn)定的共價或非共價加合產(chǎn)物,從而實現(xiàn)對糖肽的分離富集,如硼酸化學(xué)反應(yīng)法[63]和酰肼化學(xué)反應(yīng)法[64]等。前者在堿性環(huán)境下,硼酸與糖殘基的順式1,2-二羥基之間可形成穩(wěn)定、可逆的硼酸酯共價鍵,將糖肽結(jié)合到固相載體上;而在酸性環(huán)境下,酯鍵可發(fā)生水解反應(yīng)釋放糖肽,從而實現(xiàn)糖肽與非糖肽的分離。后者基于氧化后糖鏈中生成的醛基,與酰肼形成共價鍵實現(xiàn)糖肽的富集分離,其缺點是易破壞糖鏈結(jié)構(gòu)。親水/疏水相互作用法:基于親水或疏水相互作用開發(fā)的多種糖肽富集材料已廣泛用于糖肽的分離富集,如C18[65]、二氧化鈦(TiO2)[66-67]、g-C3N4[68]、功能化磁性納米材料[69-71]和天然固相萃取材料(棉花固相萃取柱[72]、楊絮和木棉[73]等)。其中,HILIC的原理主要是糖肽中糖鏈結(jié)構(gòu)的親水基團(如羥基和羧基等)與上述材料中的官能團形成較穩(wěn)定的氫鍵,然后在酸或堿環(huán)境下破壞氫鍵獲得糖肽。目前,基于HILIC原理開發(fā)的磁性納米材料在糖肽富集策略中不僅具有較強的糖肽富集選擇性,而且具有通量高、操作簡便、經(jīng)濟環(huán)保等優(yōu)點[2,74],受到研究者的青睞。

    3.3.3糖肽的質(zhì)譜分析 在質(zhì)譜分析過程中,糖肽因結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子質(zhì)量大、離子化效率低、殘留多肽干擾而較糖鏈分析更加困難。目前報道的糖肽分析方法主要有一級質(zhì)譜(full scan mass spectrometry, MS1)和串聯(lián)質(zhì)譜(trandem mass spectrometry, MS2)。MS1水平的糖肽分析:糖肽在MS1水平的直接鑒定依賴于高分辨質(zhì)譜儀采集糖肽精確分子質(zhì)量的同位素分布數(shù)據(jù)。在多肽中,其主要組成元素為C、H、N 等(同位素間均只有1 u差異)。然而,糖肽中含有較多的氧元素,自然界中16O與18O之間存在2 u差異。因此,其特征性的同位素峰型在理論上可以用于糖肽的識別和鑒定,但對質(zhì)譜儀的性能要求較高。MS2水平的糖肽分析:糖肽的鑒定一般通過串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索進行確定。常見的串聯(lián)質(zhì)譜碎裂方式有碰撞誘導(dǎo)解離(collision induced dissociation, CID)、高能碰撞解離(higher energy collisional dissociation, HCD)、電子轉(zhuǎn)移解離(electron transfer dissociation, ETD)、電子捕獲解離(electron capture dissociation, ECD),以及組合型EThcD(electron-transfer/higher-energy collision dissociation)和 CID+HCD等。CID碎裂技術(shù)能量較高,糖肽裂解作用于肽鏈上的聚糖,產(chǎn)生一系列與聚糖裂解有關(guān)的碎片離子[75]。然而,因糖肽的分子質(zhì)量較大,CID-MS2圖譜無法檢測到氧鎓離子信號,不利于糖肽MS2譜圖的解析。ECD和ETD可選擇性地裂解肽段主鏈,通過產(chǎn)生的肽碎片離子和由連接的聚糖產(chǎn)生的質(zhì)量位移確定肽序列和N-糖鏈連接的位點[76]。隨著質(zhì)譜儀的發(fā)展,特別是質(zhì)譜的碎裂技術(shù),將糖肽分析的主要瓶頸轉(zhuǎn)移到高通量、高可信度的譜圖解析所需的軟件解決方案上[77]。

    3.4 完整蛋白水平的分析

    在完整蛋白水平分析IgG糖基化修飾的優(yōu)勢在于能夠最大程度地簡化樣本制備過程,同時,這種分析策略可以獲得整個IgG分子上的糖基化修飾信息,可用于研究2條重鏈上不對稱的糖型分布[78]。完整蛋白水平上糖型分析的手段之一是凝集素。根據(jù)凝集素能夠與不同糖型特異性結(jié)合的性質(zhì),通過與熒光標(biāo)記、酶聯(lián)反應(yīng)或質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用,可以實現(xiàn)完整蛋白糖基化修飾的定性和定量分析[78-79]。為解決IgG蛋白分子在進行質(zhì)譜檢測時由于分子質(zhì)量過大而導(dǎo)致的分析困難,多數(shù)研究采用木瓜蛋白酶[55-56]、胃蛋白酶[57]、無花果蛋白酶[80]或鏈球菌IgG降解酶(IdeS)[58-59]等將IgG酶解為Fab和Fc相關(guān)片段,示于圖3,或者采用直接打開二硫鍵的方式將IgG分解成輕鏈和重鏈[51,81],以減小待分析物的分子質(zhì)量,降低質(zhì)譜分析難度,提供更精確的糖型信息。

    3.4.1IgG Fab和Fc的分析 質(zhì)譜分析一般只提供Fc糖基化修飾的信息,結(jié)合超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)可獲得Fc和Fab結(jié)構(gòu)域糖基化修飾的信息。IgG Fab結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與體細(xì)胞的突變密切相關(guān),因此,F(xiàn)ab糖基化修飾分析非常復(fù)雜。利用IdeS酶對IgG酶解,產(chǎn)生F(ab’)2和2個Fc片段,可實現(xiàn)Fab和Fc片段的分析,示于圖3。Fc片段可以與protein G結(jié)合,糖基化的F(ab’)2碎片隨后在PNGase F酶作用下進行多糖釋放。PNGase F多糖釋放和唾液酸乙基酯化或2-AA多糖標(biāo)記已成功用于Fab和Fc特異性糖基化修飾分析[82]。通過改變離子導(dǎo)向裝置電壓參數(shù),開發(fā)了一種用于IgG Fab和Fc片段表征的N端Top-down測序方法[83]。應(yīng)用傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜對人IgG1進行Top-down和Middle-down MS的深度表征,獲得了詳細(xì)的序列數(shù)據(jù)[84]。

    注:IdeS將IgG酶解后產(chǎn)生1個F(ab’)2和2個Fc片段;木瓜蛋白酶將IgG酶解后產(chǎn)生2個Fab和1個Fc片段;胃蛋白酶將IgG酶解后產(chǎn)生1個F(ab’)2和Fc碎片肽段,酶解時間延長,F(xiàn)(ab)2進一步裂解產(chǎn)生2個Fab片段;無花果蛋白酶在4 mmol/L半胱氨酸溶液中酶解IgG產(chǎn)生1個F(ab’)2和碎片化的Fc肽段,在25 mmol/L半胱氨酸溶液中酶解產(chǎn)生2個Fab和碎片化的Fc肽段圖3 完整IgG質(zhì)譜分析酶解示意圖Fig.3 Enzymatic hydrolysis schematic of complete IgG mass spectrometric analysis

    3.4.2單克隆抗體藥物的分析 由于多克隆抗體(如血清IgG)的可變區(qū)存在極大的序列異質(zhì)性,質(zhì)譜技術(shù)在完整IgG分子水平分析糖基化修飾的應(yīng)用大多集中在單克隆抗體上[85]。因IgG Fc區(qū)糖基化修飾對治療性抗體的安全性和臨床療效有著深遠的影響,因此,高效的糖蛋白定量分析技術(shù)對治療性抗體的開發(fā)和質(zhì)量控制起著重要作用,其中IgG Fc的糖譜被認(rèn)為是藥物療效的關(guān)鍵。Top-down MS已成為蛋白質(zhì)鑒定的一種可行選擇,尤其在治療性抗體藥物結(jié)構(gòu)表征上有著迫切的需求[86]。結(jié)合多種碎裂技術(shù)(如,ETD、ECD和基質(zhì)輔助激光解吸電離源衰變(MALDI-ISD))的Top-down和Middle-down MS分析已用于表征單克隆抗體 IgG1和融合IgG蛋白[87],可提供有關(guān)糖基化位點和不同組合蛋白種類的信息。

    4 IgG糖基化修飾與生理、病理狀態(tài)的關(guān)系

    4.1 IgG Fc N-糖基化修飾與生理狀態(tài)的關(guān)系

    血清IgG的糖型組成與機體的生理狀態(tài)相關(guān),其糖基化修飾水平與年齡密切相關(guān)[88],尤其在57歲以下人群中差異更為明顯[89],其相關(guān)性并非單一的正負(fù)關(guān)系[51]。在25歲時,IgG半乳糖基化修飾約為20%~30%;70歲時約為40%[90-91]。隨著年齡增長,F(xiàn)c段的核心巖藻糖基化修飾水平呈下降趨勢,而平分型N-乙酰葡糖胺修飾水平則表現(xiàn)為上升趨勢[92-93]。除與年齡相關(guān)外,IgG糖鏈組成還與性別相關(guān),在60歲以下人群中的差異尤為顯著[94]。與男性相比,女性血清IgG的半乳糖基化水平顯著高于同年齡組男性,并且隨著年齡增加而下降的趨勢變得更為明顯[51,94]。這可能是IgG半乳糖基化修飾在一定程度上受雌激素濃度的影響,如妊娠期水平升高[95],絕經(jīng)后水平降低[96]。此外,雌激素在女性體內(nèi)作為IgG半乳糖基化修飾的調(diào)節(jié)劑,揭示了一種與性別相關(guān)的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)機制[97]。

    4.2 IgG Fc N-糖基化修飾與病理狀態(tài)的關(guān)系

    IgG糖基化修飾在病理狀態(tài)下將發(fā)生顯著改變。自身免疫性疾病(如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者)與健康人IgG糖鏈有著顯著差異[98-100]。血清中的IgG不僅包含與疾病密切相關(guān)的IgG,還包含健康人體固有的自身抗體和穩(wěn)態(tài)抗體。與疾病不相關(guān)的IgG糖基化修飾會干擾與疾病密切相關(guān)的IgG糖基化修飾的檢測,甚至可能掩蓋與疾病密切相關(guān)的IgG糖基化修飾變化趨勢。因此,為更精準(zhǔn)地研究疾病對IgG FcN-糖基化修飾的影響,需要關(guān)注對疾病特異IgG(DSIgG)的研究。采用Native-PAGE可分離出與疾病相關(guān)的免疫炎癥蛋白復(fù)合物,再結(jié)合SDS-PAGE分離技術(shù),可以從人血液中分離得到DSIgG,可對IgG Fc段糖基化修飾進行深入研究[81]。

    IgG Fc糖基化修飾在不同慢性疾病,如甲狀腺癌[51]、肺癌[101]、非小細(xì)胞肺癌[102]、胰腺癌[103]及胃癌[81]等中均發(fā)現(xiàn)了異常變化。利用基質(zhì)輔助激光解吸電離-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜分析了IgG2 Fc 6種巖藻糖基化修飾(如G0F、G1F、G2F、G0FN、G1FN和G2FN),可用作胰腺疾病診斷的潛在標(biāo)志物。肺癌患者的IgG1 Fc半乳糖基化修飾呈下降趨勢[101],且IgG Fc糖基化修飾形式可作為區(qū)分非小細(xì)胞肺癌和肺部良性疾病的潛在個體化標(biāo)志物[102]。研究還發(fā)現(xiàn),半乳糖基化修飾、唾液酸化修飾及N-乙酰葡糖胺基化修飾(GlcNAc)與這2種病理狀態(tài)密切相關(guān)[81]。IgG糖基化修飾的改變極大地改變了其生物學(xué)功能,并與個體的年齡、性別和疾病狀態(tài)相關(guān)[51,89,93,104]。其中,核心巖藻糖基化修飾、唾液酸化修飾、半乳糖基化修飾、平分型N-乙酰葡糖胺基化修飾和高甘露糖基化修飾[105]對IgG的物理化學(xué)特性有著重要影響。近年來的研究表明,IgG糖鏈結(jié)構(gòu)變化與疾病狀態(tài)密切相關(guān),IgG糖鏈結(jié)構(gòu)變化可為自身免疫性疾病和腫瘤的診斷與監(jiān)測提供新的策略。

    4.2.1核心巖藻糖基化修飾 IgG FcN-糖鏈結(jié)構(gòu)變化可通過影響與Fc結(jié)合的各種受體的能力來調(diào)節(jié)抗體效應(yīng)功能。核心巖藻糖基化修飾的寡糖是在高爾基體中通過巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT8從GDP-Fuc上轉(zhuǎn)運來的巖藻糖殘基合成而來。IgG Fc核心巖藻糖會影響與FcγRIIIa的結(jié)合,且表現(xiàn)為非巖藻糖基化修飾的抗體與FcγRIIIa的結(jié)合最強[106]。體外實驗表明,采用化學(xué)酶法生成的IgG1糖苷,去除核心巖藻糖對IgG與FcγRIIIa的結(jié)合和抗體的ADCC作用有著顯著的增強作用,且唾液酸在核心巖藻糖修飾下可對ADCC產(chǎn)生不利的影響[107]。相對于缺乏巖藻糖的IgG,糖鏈結(jié)構(gòu)中的核心巖藻糖降低了IgG抗體與IgG FcγRIIIa的結(jié)合,導(dǎo)致ADCC活性降低。胃癌患者中Fc核心巖藻糖基化修飾水平在疾病的Ⅱ期和Ⅲ期階段表現(xiàn)出較明顯的升高,表明核心巖藻糖基化修飾可能與胃癌的進展相關(guān)[108]。在卵巢癌患者的核心巖藻糖基化修飾研究中也觀察到類似的現(xiàn)象[109]。

    4.2.2唾液酸化修飾 唾液酸修飾作為糖鏈末端唯一帶電荷的糖殘基,對抗體Fc結(jié)構(gòu)的影響最大[110]。單唾液酸化修飾的IgG約占10%左右[111-112],雙唾液酸化修飾的IgG約占1%[113]。Fc高唾液酸化修飾會降低IgG與FcγRIIIA受體,以及其與細(xì)胞表面抗原結(jié)合的親和性,導(dǎo)致ADCC作用減弱,IgG的功能由促炎轉(zhuǎn)為抗炎作用[114]。在癌癥患者中,單唾液酸化修飾的IgG呈下降趨勢,而雙唾液酸化修飾的IgG呈上升趨勢[115]。

    4.2.3半乳糖基化修飾 IgG半乳糖基化修飾是唾液酸化轉(zhuǎn)移酶的底物,其唾液酸化修飾水平通常伴隨著半乳糖基化修飾水平的升高而上調(diào)。免疫系統(tǒng)的變化會導(dǎo)致人類抗原特異性IgG半乳糖基化修飾水平的瞬時增加,而對IgG的總半乳糖基化修飾水平?jīng)]有顯著影響,表明無半乳糖基化修飾的IgG更具致病性,即IgG半乳糖基化修飾具有抗炎活性[96]。根據(jù)IgG Fc糖鏈末端半乳糖基化殘基的數(shù)量,可以將IgG糖型分為無半乳糖基化修飾(G0)、二天線糖鏈中的一分支發(fā)生半乳糖基化修飾(G1)以及二天線糖鏈的兩分支均發(fā)生半乳糖基化修飾(G2)3種類型。近年來的研究主要集中于IgG Fc半乳糖糖基化修飾與腫瘤之間的關(guān)系。在多發(fā)性骨髓瘤[116-117]、胃癌[81,108,118-120]、胰腺癌[103,121]、結(jié)直腸癌[70,122-124]、肺癌[102,125]、前列腺癌[115,126-127]、卵巢癌[128-129]、乳腺癌[130-131]患者的血清中發(fā)現(xiàn)IgG G0水平較健康對照組高,而IgG G2水平顯著降低。

    4.2.4平分型N-乙酰葡糖胺修飾 末端N-乙酰葡糖胺可以通過MBL途徑激活補體,N-乙酰葡糖胺的增加會阻礙C1q與抗體的結(jié)合[132],表現(xiàn)為抗炎作用。在所有IgG Fc糖鏈中,只有約10%含有平分型GlcNAc[133]。平分型GlcNAc的升高可以通過提高IgG與FcγRIII的親和力來強化ADCC作用[95]。但也有研究表明,平分型GlcNAc對結(jié)合FcγR或C1q沒有顯著影響[134]。在胃癌患者中,平分型GlcNAc水平降低[135],這可能歸因于胃癌患者體內(nèi)平分型聚糖殘基N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶3(MGAT3)的酶活性下降,平分型GlcNAc修飾的IgG水平降低,導(dǎo)致IgG與FcγRIIIA的親和性隨之下降,使ADCC作用減弱,腫瘤侵襲性增強。

    4.2.5高甘露糖基化修飾 目前,對高甘露糖基化修飾的研究主要集中在治療性重組IgG,重組抗體中高甘露聚糖修飾水平可從1%提高至20%,而內(nèi)源性人體IgG中只含有微量水平(<0.1%)的高甘露糖基化修飾[136]。采用高分辨質(zhì)譜測定糖鏈譜隨時間的變化,發(fā)現(xiàn)高甘露糖基化修飾的相對水平隨著時間的增加而下降,其他糖鏈則幾乎保持不變,說明含有Fc高甘露糖糖鏈的治療性IgG在人體內(nèi)比其他糖鏈形式清除得更快[137-138]。治療性單克隆抗體的N-糖基化修飾是藥物安全性和有效性的一個重要產(chǎn)品質(zhì)量屬性,在生物仿制藥的開發(fā)過程中需要增加高甘露糖基化修飾的百分比以提高藥物的療效[139]。

    4.3 IgG Fab糖基化修飾與病理狀態(tài)的關(guān)系

    IgG Fab糖鏈在病理狀態(tài)下也會發(fā)生顯著改變。研究發(fā)現(xiàn),IgG可能通過Fab片段上的糖鏈與抗原結(jié)合的IgG分子和巨噬細(xì)胞結(jié)合,影響抗原-抗體結(jié)合和巨噬細(xì)胞極化,有助于腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視[140]。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中,IgG Fab的核心巖藻糖基化修飾和平分型N-乙酰葡糖胺修飾水平在患病組略有下降[141],還有研究表明,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的IgG Fab糖基化修飾總體水平有所上升[142]。在骨髓瘤患者中,F(xiàn)ab段唾液酸化修飾、核心巖藻糖基化修飾和N-乙酰葡糖胺基化修飾的水平升高[143]。在濾泡性淋巴瘤、彌漫性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤患者中,F(xiàn)ab互補決定區(qū)的糖基化位點顯著增多,而非功能區(qū)糖基化位點則無明顯變化[144-145]。在惡性黑色素細(xì)胞瘤患者中發(fā)現(xiàn)了抗GRP78的自身抗體Fab段糖基化修飾的改變,其可影響惡性黑色素細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[146]。

    5 總結(jié)與展望

    IgG的生物學(xué)功能與其糖基化修飾狀態(tài)密切相關(guān),質(zhì)譜技術(shù)在研究IgG糖基化修飾中發(fā)揮著重要作用。隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展,研究人員分別在IgG的糖鏈水平、糖肽水平和完整蛋白水平開發(fā)了各種質(zhì)譜分析方法,且揭示了IgG糖基化修飾狀態(tài)與某些疾病之間的關(guān)系。然而,對IgG糖基化修飾狀態(tài)的鑒定仍面臨一些挑戰(zhàn)。首先,在糖鏈分析中,一般先將其從肽段上釋放,再通過酰胺化衍生或烷基酯化穩(wěn)定糖鏈結(jié)構(gòu),以提高質(zhì)譜檢測的靈敏度,但衍生化處理使得樣本更加復(fù)雜化,且在一定程度上破壞了糖鏈結(jié)構(gòu)。其次,在糖肽分析中普遍存在肽信號對糖肽信號的抑制作用,如何高效地將肽和糖肽分離是亟待解決的問題。最后,在完整蛋白糖基化修飾分析中對質(zhì)譜儀性能及人員的要求較高,較難大范圍地推廣。

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