固相萃取聯合高效液相色譜-串聯質譜測定人血漿中肌苷濃度的方法學建立

金冠欽，孫 黎，夏玲紅，林厚文

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院藥學部，上海200127

肌苷是一種核苷，可由次黃嘌呤通過β-N9 糖苷鍵與核糖環(huán)（也稱為呋喃核糖）連接形成。作為ATP、輔酶A、RNA 及DNA 等物質的組成部分之一，肌苷在人體的物質代謝及能量代謝過程中起關鍵作用。在嘌呤從頭合成過程中，肌苷是腺苷酸和鳥苷酸的前體，通常存在于轉移RNA（transfer RNA，tRNA）中。肌苷能直接通過細胞膜進入體細胞，在核酸代謝、能量代謝和蛋白質合成中發(fā)揮作用。目前的研究［1］發(fā)現，嘌呤和嘧啶代謝有關的遺傳性疾病有多種臨床表現，包括貧血、腎結石、免疫缺陷、抽搐、智力低下、自閉癥和生長遲緩。急性心肌缺血患者血液中ATP 分解代謝產物的水平會升高，因此測定肌苷可以幫助對這一疾病的診斷［2-3］。肌苷作為輔酶類藥物，收錄于2020版《中國藥典》，用于白細胞減少癥、血小板減少癥、急性及慢性肝炎以及肝硬化等疾病的輔助治療。近年來，肌酐越來越多的藥理作用逐步被發(fā)現，包括修復外周組織損傷［4］及腦損傷［5-8］、抗抑郁［9］等。該藥在保護中樞神經系統(tǒng)方面［10］也具有廣闊的開發(fā)前景。

肌苷的測定在醫(yī)學診斷領域有著廣泛的應用。關于動物血清［11-13］或血漿［14］中的肌苷的檢測方法國內外均已有報道。近年來，質譜檢測也越來越多地運用于核苷和核苷酸類似物的定量分析［15-18］。但目前為止，這些方法均費時費力，且缺乏專門的檢測系統(tǒng)。本文建立了一種簡便、快速、選擇性高的固相萃取聯合高效液相色譜-串聯質譜（solid-phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry， SPE-LC-MS/MS）測定血漿中肌苷濃度的方法，并對2 名健康志愿者12 h血漿中的肌苷濃度進行了測定。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和材料

三重四級桿串聯質譜儀及Analyst 1.5.1 數據分析軟件（3200QTrap，美國AB Sciex 公司），高效液相色譜儀（LC-20AD，日本Shimadzu 公司），電子分析天平（AE240，美國Mettler-Toledo 公司），高速冷凍離心機（Avanti30，美國Beckman公司），渦旋混合器（XW-80A，上海醫(yī)科大學儀器廠），-70 ℃超低溫冰箱（MDF-382E，日本Sanyo 公司），SPE 裝置（Vac Elut SPS 24，美國Varian 公司），OasisTMHLB Cartridge SPE 小柱（美國Waters公司），微孔濾膜（0.22 μm，上海半島實業(yè)有限公司），Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 實驗藥品及試劑

肌苷對照品（純度99.1%，中國食品藥品檢定研究院，批號140669-201104），內標物拉米夫定（純度99.7%，中國食品藥品檢定研究院，批號101007-200701）。甲醇、磷酸、氨水、乙酸均為質譜純，均購自美國Merck公司；實驗用超純水（電阻率18.2 MΩ·cm） 由Milli-Q 純水儀制備。

1.3 研究對象

本研究所使用的血漿樣本來源于6 名健康志愿者（24～30歲）。生物樣本采集均已通過上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院倫理委員會的倫理審批。志愿者對研究內容知情同意并簽署知情同意書。最終納入2名志愿者，分別在0、3、8、10 h 采血，15 min 后清淡飲食。血漿樣本采集后儲存于-70 ℃冰箱，實驗前置于室溫解凍后即可進行樣品前處理。

1.4 檢測方法

1.4.1 HPLC 條件 色譜柱為Waters XBridge C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm），等度洗脫，流動相為甲醇?50 mmol/L 乙酸銨水溶液（1︰1），流速0.2 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量10 μL。采用高效液相色譜儀檢測。

1.4.2 MS 條件 采用電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI） 正離子模式和多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描方式，離子源溫度為700 ℃，離子噴霧電壓為5 000 V。在MRM模式下肌苷和內標物的定量離子對分別為m/z 269.1/137.1，m/z 230.2/112.2。去簇電壓為26 V，碰撞電壓為15 V。肌苷及拉米夫定結構裂解形式見圖1。

圖1 肌苷及拉米夫定結構裂解圖Fig 1 Chemical structures and fragmentations of inosine and lamivudine

1.5 溶液配制

1.5.1 標準血漿及質控樣品的配制 取肌苷標準品適量，用流動相溶液（甲醇︰50 mmol/L 乙酸銨水溶液=1︰1）溶解后得到肌苷儲備液。分別取適量儲備液，用空白血漿（室溫放置3 d）稀釋至標準曲線所需濃度，其中肌苷的質量濃度分別為28.5、57.0、114.0、228.0、456.0、

912.0 ng/mL。

1.5.2 內標溶液的配制 取拉米夫定適量，用甲醇稀釋得到質量濃度為1 μg/mL的內標溶液，備用。

1.5.3 血漿樣品的配制 全血取出后置于肝素化試管中，立即4 ℃冰浴，待樣品收集完畢后，1 123×g離心15 min，取 上 清 液250 μL，加 入 內 標 溶 液25 μL 及250 μL 的4.25%磷酸溶液，渦旋30 s，混勻后在HLB SPE 柱上樣。先后使用1 mL 水及1 mL 甲醇洗脫除雜，最后使用1 mL流動相溶液收集，36 670×g 離心10 min，取上清液100 μL，按“1.4”項下條件檢測。

1.6 方法學驗證

1.6.1 色譜柱及流動相選擇 使用制備的質控樣品，對檢測過程使用的色譜柱（Waters XBridge C18柱及Zorbax SB-C18柱）及流動相（有機相：甲醇及乙腈。水相：10 mmol/L 及50 mmol/L 乙酸銨水溶液）進行選擇，其他步驟按“1.4”項下條件進行。根據肌苷及內標物的峰形、出峰時間以及信號響應強弱進行選擇。

1.6.2 樣品前處理方法的選擇 血漿樣品的前處理過程中，分別用5 種SPE 小柱（Waters Oasis HLB、Oasis MCX、Oasis MAX、Oasis WCX、Oasis WAX）進行考察與比較，其他步驟按“1.5.3”項下條件進行樣品處理。根據肌苷的信號響應強弱進行選擇。

1.6.3 專屬性考察 分別取6 名健康志愿者的空白血漿樣本，不加入內標物標準液及肌苷標準液。另取3份空白血漿樣本，分別僅加入內標物標準液、僅加入肌苷標準液和同時加入內標物及肌苷標準液，按照“1.5.3”項下方法處理后進樣分析。

1.6.4 血漿樣品標準曲線及定量下限考察 取“1.5.1”項下肌苷標準血漿樣品，按“1.5.3”項下方法處理，即得體內標準曲線樣品。以肌苷與內標物峰面積比值（x）對濃度（y）進行線性回歸，加權最小二乘法作回歸運算，得到回歸方程。

1.6.5 準確度和精密度考察 按照“1.5.1”項下方法制備定量下限及低、中、高質量濃度（28.5、57.0、228.0、912.0 ng/mL）的肌苷質控樣品各6 份，再按“1.5.3”項下方法處理后，連續(xù)3 d 進樣分析測定。根據當日標準曲線計算各質控樣品的實測濃度，考察本方法的準確度以及日內和日間精密度。

1.6.6 提取回收率及基質效應考察 分別配制含肌苷的低、中、高質量濃度（57.0、228.0、912.0 ng/mL）的質控樣品，按“1.5.3”項下方法操作，每個濃度取6 份樣品進樣分析；取人空白血漿按“1.5.3”項下方法操作后，取上清液分別加入適量的低、中、高質量濃度的肌苷標準溶液及內標溶液，渦旋混合后離心，每個濃度平行測定6 個樣本；在250 μL 流動相中分別加入25 μL 低、中、高濃度的肌苷質控樣品，25 μL 內標溶液，按照“1.5.3”項下方法處理，每個濃度取6 份樣品進樣分析。肌苷或內標物的基質效應=經過前處理的空白基質制備的樣本的峰面積/溶劑配制的樣本的峰面積×100%；肌苷或內標物的回收率=血清制備的樣本的峰面積/經過前處理的空白基質配制的樣本的峰面積×100%。

1.6.7 穩(wěn)定性考察 配制肌苷低、中、高3 個質量濃度的質控樣品，按“1.5.3”項下方法處理，進樣測定峰面積。分別考察樣品室溫放置4 h、反復凍融3 次、-70 ℃放置7 d 和處理后自動進樣器（4 ℃） 放置24 h 的穩(wěn)定性。

1.7 健康志愿者12 h血漿濃度測定

采用本方法測定2 例健康志愿者血漿中肌苷的濃度。分別于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3.5、4、5、6、8、10、12 h 抽取血漿，按“1.5.3”項下方法測定其中肌苷濃度。

2 結果

2.1 方法學驗證

在進行色譜柱及流動相選擇過程中，確定使用Waters XBridge C18柱時，肌苷及內標物的峰形較好，出峰時間也較快。流動相的組成對肌苷和內標物的電離程度有較大影響。有機相中，甲醇較乙腈可產生較高的信噪比且縮短了樣品的出峰時間；水相中，乙酸銨水溶液濃度為50 mmol/L 時相比濃度為10 mmol/L 時可產生更強的信號響應。使用的SPE小柱以Oasis HLB可獲得更高的回收率。

專屬性考察結果見圖2。6 名健康受試者的空白血漿樣本均無內源性物質干擾。在28.5～912.0 ng/mL 的范圍內，肌苷的線性關系良好（R2＞0.999，表1）。肌苷在各濃度水平的日內精密度相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在3.1%～9.7%之間，日間精密度RSD在0.2%～7.0%之間，日內和日間RSD 均小于10%；準確度在96.9%～103.8%之間（表2）。準確度和精密度符合生物樣品測定要求。提取回收率為98.9%～102.3%（表3）。在室溫放置4 h、反復凍融3 次、?70 ℃放置7 d 和處理后自動進樣器（4 ℃）放置24 h的情況下，肌苷的穩(wěn)定性變化率均小于15%（表4）。肌苷和內標物的保留時間分別為2.5 min，分析運行時間僅為4 min。

圖2 不同血漿樣品肌苷及拉米夫定MRM色譜圖Fig 2 Representative MRM chromatograms of inosine and lamivudine in different plasma samples

表1 線性關系與定量下限考察結果Tab 1 Results of linear relations and quantitative lower limits

表2 精密度和準確度結果Tab 2 Results of precision and accuracy test

表3 提取回收率和基質效應Tab 3 Results of matrix effect and recovery test

表4 不同條件下穩(wěn)定性考察結果Tab 4 Results of stability test under different conditions

2.2 健康志愿者12 h血漿濃度測定

2 例健康志愿者血漿肌苷濃度的藥時曲線趨勢相似，均存在多個峰（圖3）。

圖3 2名健康志愿者的血漿中肌苷藥時曲線Fig 3 Observed concentration-time curves of inosine in plasma of two healthy volunteers

3 討論

目前，血漿樣品的前處理過程中較為常用的有蛋白沉淀法、液液萃取法和SPE 法。蛋白沉淀法和使用乙酸乙酯的液液萃取法均可導致肌苷的回收率和靈敏度處于較低的水平。而HPLC-MS/MS 法與SPE 法結合用于生物樣品的定量［19］在國外已被運用。使用SPE 法，可以在滿足定量準確度的同時，提高樣品的提取回收率。在分別考察了5 種SPE 小柱（Waters Oasis HLB、Oasis MCX、Oasis MAX、Oasis WCX、Oasis WAX） 后證實Waters Oasis HLB 小柱處理后的樣品，可獲得更好的回收率，并具有較低的基質效應。原因是Waters Oasis HLB小柱使用較平衡的親水和親脂性反相吸附劑，而肌苷作為一種親水親脂相對適中的化合物，可通過疏水作用與HLB 反相吸附劑相互作用，從而達到過濾和純化樣品的作用。

肌苷在血漿中不穩(wěn)定，為了確保樣品在處理及進樣過程中的穩(wěn)定性，本方法將血漿樣品儲存在-70 ℃的超低溫冰箱中。經過實驗發(fā)現，血漿中的肌苷放置在室溫條件下，3 d 內降解至初始濃度的3.5%，遠低于定量下限（28.5 ng/mL），可視為已降解完全。故本方法所使用的空白血漿即使用此方法獲得。

由藥時曲線可推測，進餐可能是影響人體血漿中肌苷濃度的重要因素之一。此外，肌苷的代謝途徑復雜多樣。作為人體嘌呤代謝的中間代謝產物，肌苷可由腺苷、次黃嘌呤核苷酸和次黃嘌呤產生，亦可以被代謝為次黃嘌呤以及次黃嘌呤核苷酸。由于代償性反應，人體會進行自我調節(jié)增加或減少包括肌苷在內的內源性物質。其中，飲食、晝夜規(guī)律和生理周期會影響血漿中肌苷的濃度。而肌苷作為人體血漿中的內源性物質，它的代償反應機制至今仍尚未被發(fā)現。

本研究建立的測定人血漿中肌苷的SPE-HPLC-MS/MS 方法準確、靈敏、簡便。通過測定血漿中肌苷的濃度，可為臨床肌苷檢測提供有力依據，并且也可為后續(xù)的藥代動力學研究提供支持。