基于MAPKs 信號通路探討膝關節(jié)骨關節(jié)炎的研究進展

魏美娟,李 琴,羅林釗

（1.青海大學，青海 西寧 810000；2.青海省中醫(yī)院，青海 西寧 810000；3.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730030）

膝關節(jié)骨關節(jié)炎（Knee Osteoarthritis,KOA）在骨關節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）中最為常見，是一種常見的慢性炎癥性關節(jié)病，其特征是由不平衡的軟骨合成代謝和分解代謝引起的生化和形態(tài)學改變，是老年人群疼痛和殘疾的主要原因，約占OA 的78.5%[1]。隨著時間的延長，膝關節(jié)表面的軟骨出現(xiàn)退行性病變，易導致膝關節(jié)骨關節(jié)炎的發(fā)生，表現(xiàn)以膝關節(jié)軟骨變性破壞并伴有膝關節(jié)部位局限性或彌散性疼痛、晨僵、膝關節(jié)腫脹、行走時出現(xiàn)嵌頓等臨床癥狀，不僅對患者健康造成損傷，而且造成了嚴重的社會問題。其病理改變與病程發(fā)展與患者的年齡成正相關。在50～80 歲的人群中，女性發(fā)病率超過男性[2]。在40～60 歲的人群中，影像學顯示膝關節(jié)骨關節(jié)炎患者占30%左右，在60 歲以上的人群中，這一數(shù)值急劇上升，大約為85%[3]。并且其態(tài)勢愈發(fā)加重。MAPKs 信號通路與膝關節(jié)軟骨細胞凋亡和滑膜組織破壞存在密切關系，本研究就MAPKs 信號通路，以及此信號通路與膝關節(jié)骨關節(jié)炎的關系問題及研究進展做一綜述。

1 MAPKs 家族

MAPKs 介導的信號通路是從細胞表面到細胞核的主要信號通路。這些信號級聯(lián)控制復雜的程序，例如胚胎發(fā)生、分化、增殖和細胞死亡。哺乳動物中存在三大類MAPK，即細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-jun N-末端激酶（JNK）和p38。ERK 被有絲分裂原和生長因子激活，而JNK 和p38 MAPK被激活以響應炎性細胞因子TNFα 和IL-1 以及細胞應激，如熱應激、滲透應激、活性氧代謝物和紫外線輻照等[4]。

MAPKs 介導的信號通路為細胞損傷和應激反應的重要信號通路，MAPKs 家族的信號通路主要包括4 條：ERK1/2（Extracellular Signal-regulated Kinase1/2）蛋白激酶信號通路、JNK（c-Jun N-terminal in ase stress-activated protein Kinase）端激酶通路、p38 MAPK（p38 Mitogen Activated Protein Kinases）通路及ERK5 通路，以及三個非典型MAPK 亞組：ERK3/4、ERK7/8 和Nemo-Like 激酶（NLK），其中ERK1/2蛋白激酶信號通路、JNK 激酶信號通路及p38 MAPK激酶信號通路與膝關節(jié)骨關節(jié)炎存在密切關系[5]。

ERK1/2 蛋白激酶信號通路可以控制細胞的增殖、分化和凋亡[6]，ERK1/2 在細胞凋亡中存在兩副面孔，可進行雙向調(diào)節(jié)，Liu 等[7]認為ERK1/2 可通過轉(zhuǎn)錄及翻譯機制上下調(diào)節(jié)促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，從而達到抵抗細胞凋亡效果。Yue 等[8]發(fā)現(xiàn)ERK1/2 在細胞周期停滯和細胞周期重新進入均可激活誘導細胞凋亡，不同的損傷可通過激活ERK1/2 介導的信號通路，誘導細胞失活凋亡。JNK 信號通路可在多種炎性因子、細胞外刺激及應激反應的情況下通過生發(fā)激酶（GCK）、細胞凋亡調(diào)節(jié)激酶（ASK）從而進行誘導細胞凋亡[9]。Wagner 等[10]認為JNK 通過下調(diào)凋亡蛋白表達和相關DNA 轉(zhuǎn)錄的方式誘導細胞凋亡。

p38 MAPK 信號通路是細胞內(nèi)重要的傳遞者，由p38（α、β、γ、δ）四部分組成[11]。p38 MAPK 信號通路的介導在上端激酶和半胱天冬酶-3 蛋白參與進行。p38 MAPK 的激活導致由維甲酸、順鉑和其他化療劑引發(fā)的癌細胞凋亡。人的大隱靜脈中的機械拉伸誘導p38 MAPK 的激活，這與細胞凋亡有關。氧化應激誘導的p38 MAPK 磷酸化與多巴胺能神經(jīng)元中半胱天冬酶9 介導的凋亡途徑的激活有關。p38 MAPK 抑制劑可減少凋亡細胞的數(shù)量并防止少突膠質(zhì)細胞受損區(qū)域的延遲進行性退化[12]。此外，Pelletier 等[13]報道，實驗性骨關節(jié)炎中的軟骨細胞死亡是由p38 MAPK 通路介導的。p38 MAPK 信號轉(zhuǎn)導通路也被認為是一氧化氮誘導的兔關節(jié)軟骨細胞凋亡的關鍵因素。p38 MAPK 在應激誘導的關節(jié)軟骨細胞凋亡中起重要作用，而p38 MAPK 的下調(diào)可能有助于軟骨細胞凋亡的減少。

p38 MAPK 激酶信號通路因細胞外刺激（炎性因子、生物力學方面等）因素得到激活，產(chǎn)生磷酸化反應，其在膝關節(jié)骨關節(jié)炎軟骨細胞中活化，可對p38 MAPK 信號通路活性進行抑制，達到抵抗膝關節(jié)軟骨細胞凋亡與退變的作用，被評價為OA 病變程度的特異性指標。Rossenzweig 等[14]增加發(fā)現(xiàn)通過對p38 MAPK 激酶信號通路的抑制，可促使軟骨細胞活化再生，改善關節(jié)軟骨的退變。除此之外，p38 MAPK 激酶信號通路對軟骨細胞的去分化可起到促進作用，抑制其成纖維化。

2 MAPKs 信號通路與膝關節(jié)骨關節(jié)炎

MAPKs 介導的信號通路在細胞內(nèi)通過磷酸化得到激活，隨后ERK1/2 蛋白激酶信號通路在雙磷酸化的作用下得到激活[15]。ERK1/2 蛋白激酶信號通路也是MAPKs 家族中最早被發(fā)現(xiàn)的，JNK 激酶信號通路及p38 MAPK 激酶信號通路認為是在應激作用下進行介導。Attur 等[16]和Fernandes 等[17]發(fā)現(xiàn)在膝關節(jié)骨關節(jié)炎的病程中，其軟骨細胞和滑膜組織中白介素1 和腫瘤壞死因子α 等炎性因子在對膝關節(jié)軟骨細胞的破壞以及修復細胞失衡的過程中起決定作用，并通過對關節(jié)軟骨細胞中金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metal loproteinases,MMPs）活化上調(diào)，進一步抑制蛋白多糖的合成，加快基質(zhì)降解。在此過程中ERK1/2 蛋白激酶信號通路、JNK 激酶信號通路及p38 MAPK 激酶信號通路均參與了此病理改變的介導，由此可知MAPKs 信號通路與膝關節(jié)骨關節(jié)炎存在密切關系，但上述3 種信號通路存在時相差異，說明其介導機制存在個體化差異。

2.1 MAPKs 信號通路導致軟骨細胞的凋亡

楊豐建等[18]發(fā)現(xiàn)OA 動物模型中，4 周組、8 周組、12 周組的家兔關節(jié)軟骨破壞程度與病變時間成正比例上升；磷酸化的ERK1/2 信號通路激酶水平病程初期就得到快速活化，并迅速上升，維持較高的基礎水平，說明ERK1/2 信號通路在關節(jié)軟骨細胞的破壞與正常生長中有著不可或缺的作用。應激激活的JNK 激酶信號通路和p38 MAPK 激酶信號通路在細胞外和細胞內(nèi)應激的平衡細胞存活和死亡中起關鍵作用，這兩者均可介導促凋亡過程。從Yoon等[19]實驗中得知，膝關節(jié)軟骨細胞在經(jīng)MAPK 磷酸化處理后，被激活的JNK 激酶信號通路在生長因子的誘導下，其活性時長增加，并導致關節(jié)軟骨細胞凋亡。

Liu 等[20]通過建立OA 的大鼠模型。此外，向OA大鼠注射不同劑量的重組CTRP9 蛋白（rCTRP9），并評估膝關節(jié)軟骨損傷。最后通過蛋白質(zhì)印跡和酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測p38 的磷酸化和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的分泌。結果顯示，CTRP9 在脂肪組織中表達高度。其次是骨骼肌和軟骨組織，在肝臟，腎臟和肺部表達較少。此外，碘乙酸單鈉（MIA）組在膝關節(jié)軟骨和膝關節(jié)滑液中CTRP9 的表達顯著降低，膝關節(jié)滑液中白細胞介素-1β（IL-1β）和IL-6的含量顯著增加。此外，rCTRP9 以劑量依賴性方式緩解了MIA 誘導的炎癥，氧化應激和膝關節(jié)軟骨損傷。此外，rCTRP9 可以減弱p38MAPK 和p-p38 的表達，抑制核因子-kappa B（NF-κB），p65 和MMPs的表達。研究結果表明，CTRP9 通過停用大鼠p38 MAPK 和NF-κB 信號通路來緩解MIA 誘導的OA的炎癥。

2.2 MAPKs 信號通路促進成骨細胞的分化

Liu 等[20]使用永生化小鼠成牙骨質(zhì)細胞系OCCM-30。通過qRT-PCR 評估用礦物誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞中的成牙骨質(zhì)分化標志物和PGC-1α，通過茜素紅染色評估成牙骨質(zhì)礦化，通過qRT-PCR 或蛋白質(zhì)印跡分析評估鳶尾素刺激下的分化標志物和p38 MAPK 途徑的活性。p38 MAPK 通路抑制劑SB203580 或p38 siRNA 用于進一步鑒定調(diào)控機制，用CCK-8 法檢測鳶尾素處理的細胞增殖情況。在礦物質(zhì)誘導下，Runx2、osterix、ALP 和PGC-1α 的表達持續(xù)上調(diào)。鳶尾素增加了礦化結節(jié)的形成。發(fā)現(xiàn)Runx2,osterix,鳶尾素刺激下ALP 和骨鈣素明顯上調(diào)，p38 MAPK 通路活性明顯升高。在鳶尾素刺激前用SB203580 或p38 siRNA 預處理時，鳶尾素誘導的分化明顯受到抑制。長期高劑量鳶尾素處理OCCM-30 細胞增殖增強。說明鳶尾素可通過p38 MAPK 通路促進成牙骨質(zhì)細胞的分化。

張鳳等[21]通過構建大鼠OA 模型，治療組選用鳶尾素，檢測出四個實驗組中組白細胞介素1 和白細胞介素6 水平以及軟骨組織中p38 蛋白磷酸化水平均低于其他三個治療組，說明鳶尾素可以通過調(diào)控TDP-43/p38 MAPK 抑制炎性反應，從而緩解軟骨損傷。

2.3 MAPKs 信號通路可調(diào)節(jié)microRNA

Zhang 等[21]進行逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應和蛋白質(zhì)印跡以確定miR-27a-3p 和聚集蛋白聚糖酶2 (ADAMTS5）在OA 患者和健康對照的軟骨組織中的表達，以及在白細胞介素(IL）中的表達。結果顯示，與正常對照相比，OA 軟骨組織中miR-27a-3p 的水平降低。此外，在用IL-1β 處理的軟骨細胞中，以時間和劑量依賴性方式觀察到miR-27a-3p降低和ADAMTS5 表達增加。此外，miR-27a-3p 的過表達抑制了IL-1β 誘導的人軟骨細胞中ADAMTS5 的表達。miR-27a-3p 過表達也降低了野生型 ADAMTS5 報告質(zhì)粒的熒光素酶活性。ADAMTS5 mRNA 3'-非翻譯區(qū)中miR-27a-3p 結合位點的突變消除了miR-27a-3p 介導的報告活性抑制。此外，特異性抑制劑的使用表明IL-1β 可通過軟骨細胞中的 NF-κB 和MAPK 信號通路調(diào)節(jié)miR-27a-3p 的表達。本研究得出結論，miR-27a-3p 在人類OA 中下調(diào)并被IL-1β 抑制，并且在OA軟骨細胞中作為ADAMTS5 的關鍵調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。此外，IL-1β 介導的miR-27a-3p 活性抑制可能通過MAPK 和NF-κB 途徑發(fā)生。為臨床治療由miR-27a-3p 上調(diào)引起的OA 提供一種新策略。

2.4 MAPKs 信號通路可抑制破骨細胞增殖

MAPKs 信號通路與破骨細胞的過度增殖或分化有關。Zhang 等[22]原兒茶酸（PCA）對前交叉韌帶橫斷（ACLT）誘導的OA 的影響以及該效應背后的潛在作用機制。在大鼠上進行ACLT，然后用或不用PCA 進行治療。通過ELISA 在膝關節(jié)蛋白提取物中測試I 型膠原（CTX-I）和CTX-II 的C 端特洛肽。使用Safranin-O/ Fast Green 染色評估軟骨損傷。通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR 和蛋白質(zhì)印跡評估破骨細胞相關基因和蛋白表達。使用RAW264.7 小鼠巨噬細胞進行酒石酸耐酸磷酸酶（TRAP）染色和功能性骨吸收坑測定，以確定PCA 對破骨細胞形成和體外功能的影響，通過蛋白質(zhì)印跡評估了破骨細胞發(fā)生相關信號通路的活性。CTX-II 水平相對降低，Safranin-O/快速綠色染色表明PCA 治療組的關節(jié)軟骨變化較輕。PCA 下調(diào)破骨細胞特異性標志物和抑制核因子-κB 配體的受體激活劑誘導的TRAP 陽性多核細胞的形成，骨吸收和凹坑形成。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Akt 信號傳導以及下游因子被PCA 下調(diào)。研究表明，PCA 通過抑制MAPK，ATK 和NF-κB信號通路來抑制破骨細胞生成，從而減弱ACLT 誘導的OA。

3 研究意義與展望

膝關節(jié)骨關節(jié)炎患者人數(shù)隨社會的發(fā)展日益增多，對膝關節(jié)骨關節(jié)炎的防治已然成為醫(yī)學界焦點問題。通過上述對MAPKs 信號通路家族介紹可知，對MAPKs 信號通路的抑制，可以達到抑制或延緩膝關節(jié)軟骨細胞凋亡與滑膜組織破壞進程，以及促進軟骨細胞修復的效果。MAPKs 信號通路可導致軟骨細胞的凋亡，促進成骨細胞的分化，可抑制破骨細胞增殖，可調(diào)節(jié)microRNA 等功能。

臨床上目前有鳶尾素、原兒茶酸、黃芩素、姜黃素、HDAC 抑制劑等通過抑制MAPKs 中某一項信號通路，對膝關節(jié)骨關節(jié)炎進行相關防治[23]，但僅通過某一項信號通路介導，作用于單個靶點，對抑制膝關節(jié)骨關節(jié)炎的發(fā)展并未能達到預期效果[24]，因為在其病理改變過程中有多條信號通路積極參與其中，另外黃芩素、姜黃素、HDAC 抑制劑中存在有相關靶點與療效的可靠性尚未明確問題，對膝關節(jié)骨關節(jié)炎的防治仍然任重道遠。