高效液相色譜法測(cè)定苦荬菜中木犀草苷和菊苣酸的含量

曾文輝，龔千鋒，廖寶源

1.江西省藥品檢查員中心贛南藥品檢查所，江西 贛州 341000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330000；3.贛州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 贛州 341000

苦荬菜Ixeris chinensis（Thunb.）Nakai 為菊科植物山苦荬、抱莖小苦荬的新鮮或干燥全草，主要分布在浙江、江蘇、廣西、貴州、福建、湖南、江西、安徽等地，具有清熱解毒，消腫排膿，涼血止血，生津止渴等功效。在《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2009 版）》《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》均有收載苦荬菜，但缺少含量測(cè)定項(xiàng)，不足以控制其藥材質(zhì)量。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［1-3］，苦荬菜主要含有黃酮類、木質(zhì)素類、萜類，此外還有有機(jī)酸類、甾醇類、苯丙素類等。相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)表明，苦荬菜具有抗菌、抗炎保肝、抗腫瘤、降脂、降糖的功效［4-10］?？噍げ朔植紡V泛，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，化學(xué)成分較復(fù)雜，生理活性和藥理活性較高，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景［11-14］。但目前缺乏有效的質(zhì)量控制，對(duì)苦荬菜的應(yīng)用開(kāi)發(fā)具有的一定的限制，因此，本研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)［15-16］基礎(chǔ)上，首次建立了高效液相色譜測(cè)量苦荬菜中木犀草苷和菊苣酸含量的方法，該方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，可以為苦荬菜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 材料與儀器

島津LC-20AT 型高效液相色譜儀，AUW220D型電子天平（十萬(wàn)分之一，日本島津公司）；BS224S型電子天平（萬(wàn)分之一，Sartorius）；KQ250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；KQ5200 型水浴鍋（昆山市超聲儀器有限公司）。

木犀草苷對(duì)照品（批號(hào)：111720-201810，中國(guó)食品藥品檢定研究院），菊苣酸對(duì)照品（批號(hào)：111752-201703，中國(guó)食品藥品檢定研究院），甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

本實(shí)驗(yàn)收集到不同批次的苦荬菜樣品共14 批，樣品信息見(jiàn)表1，樣品經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授鑒定為苦荬菜Ixeris chinensis（Thunb.）Nakai。

表1 不同批次的苦荬菜樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 苦荬菜藥材供試品溶液

精密稱取苦荬菜藥材粉末（過(guò)5 號(hào)篩）0.3 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱重，回流提取30 min，稱重補(bǔ)重，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取木犀草苷、菊苣酸對(duì)照品適量，分別加甲醇制成每1 mL 含木犀草苷0.092 mg、菊苣酸0.043 mg 的溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：COSMOSIL C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%磷酸溶液（18∶82）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；體積流量：1.0 mL/min，柱溫40 ℃。理論塔板數(shù)按木犀草苷計(jì)算不低于8 000，菊苣酸不低于6 000。如圖1 中A、B 圖，苦荬菜藥材供試品溶液中木犀草苷、菊苣酸分離度良好。

圖1 混合對(duì)照品（A）和苦荬菜供試品（B）色譜圖

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn)

分別精密吸取木犀草苷、菊苣酸對(duì)照品溶液按按1、3、7、10、15、20 μL 注入液相色譜儀中，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)對(duì)照品峰面積，將進(jìn)樣量與峰面積進(jìn)行回歸處理，回歸方程為：木犀草苷為：Y=1 574 808.465 5X-38 375.035 7，r=0.999 7（n=6），木犀草苷對(duì)照品在0.092～1.84 μg 范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系；菊苣酸為：Y=2 318 633.009 0X-7 358.214 3，r=0.999 9（n=6），菊苣酸對(duì)照品在0.043～0.86 μg 范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取木犀草苷、菊苣酸對(duì)照品溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定木犀草苷和菊苣酸峰面積值，結(jié)果顯示木犀草苷RSD 為0.13 %，菊苣酸RSD 為0.32 %。表明儀器的精密性較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，按一定的間隔時(shí)間進(jìn)樣，測(cè)定供試品溶液中木犀草苷和菊苣酸峰面積值，結(jié)果顯示在24 h 內(nèi)木犀草苷的RSD 為0.27 %，菊苣酸的RSD 為1.35 %。表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取已知含量苦荬菜藥材約0.3 g，共六份，照“2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法制成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算藥材中木犀草苷和菊苣酸的含量，結(jié)果顯示，木犀草苷平均含量為7.082 3 mg/g（RSD 為0.62 %）；菊苣酸平均含量為2.522 1 mg/g（RSD 為1.45 %）。表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 平均加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的樣品約0.15 g 六份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按100 %加入木犀草苷和菊苣酸對(duì)照品適量，按照“2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法制成供試品溶液，測(cè)定溶液中木犀草苷和菊苣酸的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 樣品的含量測(cè)定

取10 批不同苦荬菜藥材，分別照“2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每份進(jìn)樣3 次，計(jì)算木犀草苷和菊苣酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 木犀草苷和菊苣酸的加樣回收率

表3 木犀草苷和菊苣酸含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 討論

苦荬菜已有相關(guān)的研究表明乃是藥食兩用的藥材，對(duì)保肝、抗氧化都具有一定的作用。所測(cè)成分木犀草苷和菊苣酸分屬于黃酮和酚酸類，都具有抗氧化等作用，且預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)含量較高，因而本實(shí)驗(yàn)選取此兩個(gè)成分進(jìn)行定量分析。在考察不同溶劑的提取以及不同的提取方法時(shí)發(fā)現(xiàn)70%甲醇為最佳提取溶劑，提取方式選擇回流。在流動(dòng)相的選擇上，比較了乙腈-水，乙腈-冰醋酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水溶液對(duì)色譜峰的分離效果好。

由表3 中數(shù)據(jù)可知，木犀草苷的含量至少在3 mg/g 以上，對(duì)比不同產(chǎn)地的苦荬菜中的菊苣酸含量，整體上低于木犀草苷。在已報(bào)道文獻(xiàn)中，苦荬菜的含量測(cè)定大多數(shù)是對(duì)木犀草苷進(jìn)行限量考察［15］；同時(shí)，不同產(chǎn)地中，木犀草苷和菊苣酸含量亦有差異，地域差異可能是導(dǎo)致含量異同的主要因素。因此，在臨床用藥上，為選擇藥材的來(lái)源地提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。