基于NADPH/ROS/ERK信號通路探討腎康降酸顆粒對高尿酸血癥大鼠腎小管上皮細胞損傷的作用機制

徐梅秀，薛丕良，黃 芳，伊世華，李麗琦

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

高尿酸血癥是指正常嘌呤飲食情況下血清尿酸水平超過正常閾值，通常定義為男性高于416 μmol/L(7 mg/dL)，女性高于357 μmol/L(6 mg/dL)。隨著經濟的快速發(fā)展和飲食結構的改變，我國高尿酸血癥發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。據(jù)流行病學調查結果顯示，我國高尿酸血癥的患病率在10%以上，其中東南沿海以及經濟發(fā)達地區(qū)高尿酸血癥患病率甚至高于20%，與歐美發(fā)達國家情況相接近[1-3]。腎康降酸顆粒為本院治療高尿酸血癥以及高尿酸血癥相關性腎病的臨床常用方，其主要活性成分黃芪多糖、大黃酸、姜黃素、丹參多酚酸鹽均能從多途徑、多靶點有效調控尿酸代謝和改善腎小管上皮細胞損傷[4-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)腎康降酸顆?？梢杂行Ы档湍I組織中TGF-β1、TNF-α的表達水平，從而抑制尿酸鹽在管小管沉積，改善腎組織損傷[7]。本研究通過觀察腎康降酸顆粒對高尿酸血癥大鼠NADPH/ROS/ERK信號通路的影響，旨在進一步研究腎康降酸顆粒對高尿酸血癥大鼠腎功能與腎小管上皮細胞的保護效應。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質量200～240 g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(黑)2013-004，使用許可證號：SYXK(黑)2013-012。飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學院動物實驗室，環(huán)境濕度(55±15)%，溫度20～24 ℃，給予大鼠晝夜各12 h的晝夜循環(huán)。

1.2藥品與試劑 腎康降酸顆粒由黑龍江省中醫(yī)藥科學院制劑室提供(組成：黃芪10 g、山藥6 g、大黃3 g、姜黃4 g、土茯苓6 g、威靈仙6 g、丹參6 g、澤蘭4 g、地龍6 g、白花蛇舌草6 g、薏苡仁6 g、牛膝4 g)，每袋10 g(含生藥67 g，批號：20180711)。別嘌呤醇由上海信宜萬象藥業(yè)有限公司生產(國藥準字H31020334，0.1 g/片，批號：181107)。大鼠尿酸、肌酐和尿素氮檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司(批號分別為20180125，20180627和20180530)；活性氧(ROS)測定試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號分別為20180315，20180122和20180611)；兔抗鼠ERK1、p-ERK1、β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗均購于沈陽萬類生物科技有限公司(批號分別為WL01770，WLP1512，WL01372和WLA023)；腺嘌呤與酵母粉購自Singma公司(批號分別為3204100和101498252)。

1.3儀器設備 光學顯微鏡(尼康株式會社，日本)；電泳儀、電泳槽及凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)；DNX-9620A洗板機(北京普朗醫(yī)療)；RT-610酶標儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)；BD FACSCalibur 流式細胞儀(BD，美國)。

1.4實驗方法 隨機取10只雄性SD大鼠作為空白組，其余30只大鼠采用腺嘌呤聯(lián)合酵母粉灌胃口服制備高尿酸血癥模型，方法參考文獻[8]：取適量腺嘌呤與酵母粉溶解于生理鹽水中，制備每毫升含有5 mg腺嘌呤與0.5 g酵母粉混合溶液，將對應劑量的酵母粉與腺嘌呤分2次灌胃，連續(xù)灌胃14 d?？瞻捉M大鼠每日給予2次等體積的生理鹽水灌胃，每次2 mL。造模結束后，眼眶取血檢測血清尿酸(≥110 μmol/ L)、肌酐和尿素氮水平判斷是否造模成功。將造模成功大鼠隨機分成模型組、別嘌呤醇組、腎康降酸顆粒組，每組10只。自造模結束后第2天起，別嘌呤醇組大鼠給予27 mg/(kg·d)別嘌呤醇水混液灌胃，腎康降酸顆粒組給予3.24 g/(kg·d)的腎康降酸顆粒溶液灌胃，空白組和模型組大鼠給予生理鹽水2 mL/d灌胃，均持續(xù)灌胃6周。

1.5樣本采集 末次灌胃結束后，大鼠常規(guī)禁食不禁水12 h，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血5 mL，3 000 r/min離心15 min分離出血清并于-80 ℃保存。游離大鼠雙腎，剝離腎周纖維組織并沖洗，左腎上1/2置于10%福爾馬林溶液常溫固定，用于組織病理檢查；左腎下1/2于液氮中保存，用于Western blot檢測。取右腎分離腎皮質，棄髓質，將皮質剪碎至1 mm×1 mm，PBS反復沖洗以洗清殘余血液成分，0.1%的Ⅱ型膠原酶震蕩消化，收集消化液。PBS洗滌剪碎后的組織，收集洗滌液。將洗滌液和消化液混勻，濾網過濾后離心收集沉淀。PBS清洗2次，DMEM/F12懸浮，離心管中加入Percoll分離液后加入上述混懸液，離心、純化腎小管節(jié)段。腎小管節(jié)段于培養(yǎng)皿中接種培養(yǎng)，制備腎小管上皮細胞懸液，光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，免疫組化染色檢測CK18蛋白的表達，以CK18陽性表達鑒定為成功分離腎小管上皮細胞。隨后調整細胞濃度為109/L用于檢測。

1.6檢測指標及方法

1.6.1血肌酐、尿素氮、尿酸水平檢測 取血清，按照試劑盒說明書，采用ELISA法檢測各組大鼠血肌酐、尿素氮、尿酸水平。

1.6.2組織病理學觀察 腎組織固定后，流水沖洗過夜，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成3 μm厚切片，按試劑說明進行HE染色后，脫水，透明，中性樹膠封片。分別于100，200和400倍光學顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)。參照文獻[9]方法對腎小管上皮細胞的損傷情況進行評分，根據(jù)萎縮、壞死和炎癥細胞浸潤的程度分為正常、輕度、中度和重度，并分別記0～3分，最高12分，分數(shù)越高損傷程度越重。

1.6.3腎小管上皮細胞凋亡率檢測 采用Annexin-V-PI雙染法流式細胞技術檢測腎小管上皮細胞凋亡情況。取腎小管上皮細胞懸液，加入5 μL的 Annexin-V混勻后避光孵育15 min，后加入10 μL的PI混勻，室溫避光反應5 min，加入適量Binding Buffer混勻后上機檢測。以早期凋亡細胞數(shù)量與晚期凋亡細胞數(shù)量計算細胞總體凋亡率。

1.6.4腎小管上皮細胞中NADPH氧化酶活性及ROS水平檢測 取腎小管上皮細胞懸液，按照試劑盒說明書，分別采用比色法和ELISA法檢測各組腎小管上皮細胞中NADPH氧化酶活性和ROS水平。

1.6.5腎組織中ERK1及其磷酸化水平免疫組化檢測 組織切片脫蠟，PBS洗3次，每次5 min；3%過氧化氫封閉15 min；PBS洗3次，每次5 min；10%正常山羊血清封閉30 min；封閉后不洗，加一抗孵育，4 ℃過夜；室溫平衡30 min；PBS洗3次，每次5 min；二抗孵育，37 ℃，1 h；PBS洗3次，每次5 min；DAB顯色完畢后置于蒸餾水，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察、拍照，采用Image J軟件計算ERK1及其磷酸化蛋白陽性區(qū)域的面積(每張切片取3個陽性區(qū)域進行定量分析，取均值)。

1.6.6腎組織中ERK1及其磷酸化水平Western blot法檢測 提取腎組織總蛋白并測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白marker位置切下目的蛋白所在的PAGE膠；將蛋白轉至PVDF膜后，TBS洗膜3次，每次5 min。室溫下二抗孵育1 h，化學發(fā)光成像儀中顯影。目的蛋白與內參照β-actin吸光度值之比為該蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1各組大鼠血尿酸與腎功能比較 各造模組大鼠血尿酸、肌酐、尿素氮水平均明顯高于空白組(P均<0.05)。干預6周后，模型組大鼠血尿酸、肌酐、尿素氮水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，別嘌呤醇組和腎康降酸顆粒組大鼠血尿酸、肌酐、尿素氮水平均明顯低于模型組及同組造模后(P均<0.05)，且腎康降酸顆粒組均明顯低于別嘌呤醇組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血尿酸和腎功能指標水平比較

2.2各組大鼠腎組織形態(tài)學比較 HE染色可見模型組大鼠腎小管嚴重受損，小管上皮細胞變性、壞死、脫落，局部呈裸基底膜樣改變，部分視野可見腎小球以及腎小管細胞壞死，間質可見輕重不等的纖維結締組織增生與炎癥細胞浸潤，少許腎小管內可見由嗜酸性蛋白形成的蛋白管型，并堵塞腎小管，未壞死區(qū)域可見腎小管重度擴張，上皮細胞腫脹與刷狀緣脫落，別嘌呤醇組和腎康降酸顆粒組大鼠腎小球與腎小管的損傷較輕，見圖1?？瞻捉M、模型組、別嘌呤醇組和腎康降酸顆粒組腎小管上皮細胞損傷評分分別為(1.00±0.30)分、(4.30±0.80)分、(3.40±0.80)分和(1.70±0.40)分，模型組明顯高于空白組(P<0.05)，別嘌呤醇組和腎康降酸顆粒組均明顯低于模型組(P均<0.05)，并且腎康降酸顆粒組明顯低于別嘌呤醇組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài) HE染色表現(xiàn)

2.3各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況比較 空白組、模型組、別嘌呤醇組和腎康降酸顆粒組腎小管上皮細胞凋亡率分別為(4.50±0.34)%、(12.50±1.27)%、(8.02±0.85)%、(6.52±0.47)%， 模型組明顯高于空白組(P<0.05)，別嘌呤醇組和腎康降酸顆粒組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且腎康降酸顆粒組明顯低于別嘌呤醇組(P<0.05)。各組流式細胞術檢測情況見圖2。

圖2 流式細胞術檢測各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況

2.4各組大鼠腎小管上皮細胞中NADPH氧化酶活性、ROS水平比較 模型組大鼠腎小管上皮細胞中NADPH氧化酶活性和ROS水平均明顯高于空白組(P均<0.05),別嘌呤醇組和腎康降酸顆粒組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且腎康降酸顆粒組均明顯低于別嘌呤醇組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腎小管上皮細胞中NADPH氧化酶活性、ROS水平比較

2.5各組大鼠腎組織中ERK1及其磷酸化水平比較 各組大鼠腎組織中ERK1總體表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；模型組大鼠腎組織中p-ERK1陽性表達面積、p-ERK1相對表達量與p-ERK1/ERK1比值均明顯高于空白組(P均<0.05)，別嘌呤醇組和腎康降酸顆粒組上述各指標均明顯低于模型組(P均<0.05)，且腎康降酸顆粒組均明顯低于別嘌呤醇組(P均<0.05)。見圖3、圖4和表3、表4。

圖3 各組腎組織中p-ERK1與ERK1蛋白表達免疫組化染色表現(xiàn)

圖4 各組腎組織中p-ERK1與ERK1蛋白表達灰度圖

表3 各組大鼠腎組織中p-ERK1與ERK1陽性表達面積比較

表4 各組大鼠腎組織中p-ERK1與ERK1蛋白相對表達量比較

3 討 論

高尿酸血癥是臨床常見的代謝性疾病之一，其發(fā)生通常與高嘌呤飲食、過量飲酒、高血壓、高血糖、高血脂癥以及肥胖等因素密切相關[10]。高尿酸血癥不僅可以累及骨和關節(jié)引起痛風，此外長期的尿酸代謝紊亂促使尿酸在腎組織中沉積，進而導致腎臟損害[11]。作為臨床慢性腎臟疾病發(fā)生和進展的獨立危險因素，尿酸水平的升高可通過激活氧化應激、炎癥反應等途徑引起腎損傷[12-13]。故此，降低血尿酸水平對于保護高尿酸血癥患者腎臟功能以及延緩高尿酸血癥合并慢性腎病患者的病情發(fā)展具有重要意義。

通常情況下人體內ROS的清除和產生處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦出現(xiàn)氧化應激反應，組織內氧自由基的產生與清除系統(tǒng)失衡，導致ROS蓄積而引起DNA氧化損傷和蛋白表達異常。越來越多的證據(jù)表明，高濃度尿酸可以誘導腎小管上皮細胞發(fā)生氧化應激反應，是高尿酸血癥導致腎臟損傷的常見原因[14-15]。NADPH氧化酶是促活性氧生成的主要酶類之一，作為ROS產生的最主要來源，其參與機體的多種生理過程[16]。激活的NADPH氧化酶能產生過多活性氧，介導氧化應激損傷。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度尿酸能夠通過上調腎小管上皮細胞內NADPH酶蛋白水平，進而促進氧化應激[17]。ERK信號通路是絲分裂原蛋白激酶(MAPK)中的一個成員，在細胞存活方面發(fā)揮重要作用。研究證實ROS可以通過活化ERK信號通路促進炎癥反應，誘導細胞損傷[18]。此外，ERK的磷酸化水平也與氧化應激相關，而抑制ERK可以延緩高尿酸血癥性腎病的發(fā)展[19]。綜合以上各項研究結果，提示NADPH/ROS/ERK信號通路與高尿酸血癥導致腎損害密切相關。

腎康降酸顆粒是隋淑梅教授在多年的臨床和實驗研究以及對古籍的整理認識基礎上，經過理論確立、藥味精心篩選而擬成的經驗方，能夠有效降低高尿酸血癥患者血清尿酸水平和改善患者臨床癥狀[20-21]。該方由12味藥組成，其中黃芪、山藥益氣健脾、補腎固精以治本而共為君藥，使脾腎得補而氣血得調。姜黃破血除瘀，與大黃共用則祛瘀之功更增；土茯苓利水滲濕解毒，威靈仙祛風通絡止痛，二者合力則可使?jié)駶嵊尚”愣?；上四味為臣，以活血化瘀除濕濁而治標。佐使藥丹參、牛膝、地龍、澤蘭可助臣藥活血之力，而白花蛇舌草與薏苡仁可利濕祛濁、清熱解毒，以消瘀久化熱之虞。全方針對高尿酸血癥脾腎兩虛、濁毒瘀結之基礎病因病機，以“補益脾腎、除濕祛瘀”為法，補虛不留瘀，攻邪而不傷正，可以從根本上延緩高尿酸血癥以及高尿酸血癥導致的腎臟損傷的發(fā)生與發(fā)展。

本實驗采用腺嘌呤聯(lián)合酵母粉灌胃制備高尿酸血癥大鼠模型進行研究，發(fā)現(xiàn)腎康降酸顆粒能夠顯著降低血尿酸水平，改善高尿酸血癥大鼠腎功能，可顯著減輕腎組織壞死、炎癥細胞浸潤，抑制腎小管上皮細胞凋亡，尤其可顯著降低腎組織中NADPH氧化酶活性、ROS水平以及ERK1磷酸化水平。提示腎康降酸顆粒可以通過調控NADPH/ROS/ERK信號通路，進而降低高尿酸血癥大鼠尿酸水平，減輕腎組織損傷，保護腎小管上皮細胞，進一步為該藥的臨床應用提供了理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。