NF-κB信號通路在骨性關節(jié)炎軟骨損傷機制中的研究進展

田明月,彭程云，丁小芬,陳碧敏,周友龍

(1. 河南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，河南 鄭州 450046；2. 河南中醫(yī)藥大學國際教育學院，河南 鄭州 450046)

骨性關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是最常見的關節(jié)炎形式，是降低生活質(zhì)量并造成經(jīng)濟損失及致殘的主要原因[1]。當軟骨退化關節(jié)軟骨相互摩擦時，關節(jié)損傷就會加劇，導致OA病情的加重。由于人口老齡化和肥胖等因素的影響，OA的患病率將會不斷增加[2]。然而，大多數(shù)OA的藥物治療，如口服非甾體抗炎藥(NSAIDs)和氨基葡萄糖僅限于疼痛管理，而不是預防和治療，手術通常是治療OA的最后手段。事實上，目前還沒有獲得認可和推廣的用以改善疾病進展的藥物[3]，盡管已經(jīng)進行了許多使用關節(jié)內(nèi)(IA)給藥方法的臨床試驗，包括使用透明質(zhì)酸、糖皮質(zhì)激素、醫(yī)用臭氧水、針對促炎細胞因子的生物制劑以及使用組織植入物、細胞濃縮物或間充質(zhì)干細胞的細胞治療[4]。缺乏針對性治療疾病的藥物，部分歸因于對OA發(fā)病機制的不完全了解。因此，確定導致OA發(fā)生和發(fā)展的危險因素可能揭示這種疾病的生物標志物和治療靶點。

機械應激和促炎細胞因子的升高在破壞關節(jié)軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[5]。研究已經(jīng)確定NF-κB轉錄因子在OA中異常激活，并且是疾病的致病因子。NF-κB參與到諸多OA的發(fā)病環(huán)節(jié)，包括軟骨細胞分解代謝、軟骨細胞存活和滑膜炎癥。因此，NF-κB及其上游調(diào)節(jié)因子、輔助因子和下游效應物被認為是OA治療干預的潛在靶點[6]。本文回顧描述了NF-κB如何參與OA病理生理學和關節(jié)軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的文獻。概述了NF-κB信號轉導在OA疾病中的作用，強調(diào)其促進軟骨分解代謝作用。

1 OA發(fā)病機制

慢性機械應力，如關節(jié)損傷、超負荷或過度使用等，導致OA中關節(jié)軟骨、滑膜和軟骨下骨的改變，如軟骨變性、滑膜炎癥、軟骨下骨硬化和骨贅形成[7]。關節(jié)軟骨是關節(jié)中特有的的結締組織，由軟骨細胞及其產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)(ECM)組成，關節(jié)軟骨組織內(nèi)不僅缺乏血管或神經(jīng)，而且內(nèi)在修復能力有限，因此軟骨細胞的凋亡在OA進展過程中發(fā)揮著至關重要的作用[8]。軟骨細胞通過合成ECM來維持軟骨的穩(wěn)態(tài)，從而保持軟骨的結構和功能的完整性。然而，在OA的病理狀態(tài)下，軟骨細胞失去了保持軟骨完整性和自身生存的能力[9]。此外，病變的軟骨細胞還可能轉化為分泌基質(zhì)降解酶的分解代謝細胞，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和具有凝血酶反應蛋白基序的蛋白聚糖酶(ADAMTS)，其中包括分解代謝所必需的MMP-13和ADAMTS-5[10]。結果細胞外基質(zhì)的降解和保護失衡，最終導致軟骨退化。軟骨細胞分解代謝受到各種炎性細胞因子的刺激，包括白細胞介素(IL-1β)，腫瘤壞死因子(TNF-α)和IL-6，這些因子是通過旁分泌或自分泌機制從發(fā)炎的滑膜和受損的關節(jié)軟骨中衍生出來的[11]。被炎性細胞因子、過度機械應力和細胞外基質(zhì)降解產(chǎn)物等激活的NF-κB不僅誘導靶基因轉錄，而且還通過正反饋機制刺激炎癥介質(zhì)如IL-1β、TNF-α和IL-6等的分泌[12]。因此，本文的綜述重點是它在OA軟骨細胞代謝和關節(jié)軟骨退化中的作用。

2 NF-κB的一般功能和調(diào)節(jié)作用

NF-κB是一種可誘導的轉錄因子，在免疫反應、炎癥反應、細胞分化以及正常和惡性細胞的生存中居于中心地位。由于NF-κB參與諸多反應，NF-κB信號通路的失調(diào)出現(xiàn)在許多疾病過程中，如關節(jié)炎、癌癥和自身免疫性疾病[13]。在哺乳動物中，NF-κB五個家族成員以同源和異源二聚體的形式組成，包括NF-κB1(p105/p50)、NF-κB2(p100/p52)、RelA(P65)、RelB和c-Rel。在NF-κB二聚體中，p65/p50異源二聚體是最經(jīng)典的存在形式。它存在于大多數(shù)類型的細胞中，并作為一種有效的轉錄因子，發(fā)揮最主要的作用。

在未受刺激的細胞中，NF-κB二聚體通過與抑制性IκB蛋白的結合形成的異三聚體而被滯留在細胞質(zhì)中。在各種因子刺激下，IκB被IκB激酶磷酸化并被蛋白酶體降解，允許游離的NF-κB復合物轉移到細胞核，與NF-κB反應元件結合，并反式激活數(shù)以百計的免疫調(diào)節(jié)蛋白、促炎細胞因子、趨化因子、黏附分子和生長因子的表達[14]。NF-κB還誘導IκBα，后者通過負反饋機制抑制NF-κB。除了動態(tài)的亞細胞易位，NF-κB的活性還受其翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，如磷酸化、乙?；⒓谆头核鼗痆15]。NF-κB的激活是由兩種特征明確的信號通路介導，即經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路。這些通路分別主要由促炎信號或參與發(fā)育的因子激活[16]。經(jīng)典通路涉及由p65、c-Rel和p50亞基組成的NF-κB二聚體，并需要IKK復合物(IKKα/β/γ)的參與，由于IκB依賴的負反饋機制，該通路是快速作用且可逆的。相反，非經(jīng)典通路主要通過IKKα激活p52和RelB[16]，與經(jīng)典通路相比，非經(jīng)典通路中NF-κB的激活速度更慢，持續(xù)時間更長。

3 NF-κB在OA發(fā)病中的意義

NF-κB通路是OA刺激(如炎癥和機械負荷)激活的主要信號通路之一，通過功能抑制途徑證實NF-κB在OA中的意義。在培養(yǎng)的軟骨細胞中，用NF-κB抑制劑處理降低IL-1β誘導的分解代謝基因表達[17]。在動物模型中，通過IA注射特異性siRNA[18]，降低了NF-κB p65表達，減輕了膝關節(jié)撞擊引起的軟骨損傷。同時，也觀察到滑液中IL-1β和TNF-α濃度的降低。毫不奇怪，IKK作為NF-κB激活機制中上游調(diào)節(jié)因子，也與軟骨細胞分解代謝和軟骨退化有關。例如，IA注射BMS-345541，一種選擇性IKKα/β抑制劑，不僅在OA手術誘導后2周阻止MMP-13和ADAMTS-5的誘導，而且在8周里減輕軟骨損傷[19]。

3.1NF-κB調(diào)節(jié)軟骨細胞分解代謝 了解NF-κB激活對于軟骨分解代謝途徑的分子機制可能會洞察OA潛在治療靶點。NF-κB直接或間接誘導MMPs和其他OA相關因子的表達，從而協(xié)調(diào)異常的軟骨分解代謝途徑。NF-κB通過位于MMP-1、MMP-9和ADAMTS-5基因啟動子中的NF-κB反應元件誘導分解代謝基因表達[20]，以及促進OA中主要促炎細胞因子等破壞性介質(zhì)的表達，包括環(huán)氧合酶-2(COX-2)，前列腺素E2(PGE2)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)[21]。特別是iNOS的降低似乎減輕了實驗性OA中的軟骨破壞。

NF-κB還能夠上調(diào)其他轉錄因子，如缺氧誘導因子-2α(HIF-2α)，ETS結構域包含蛋白-1(ELK1)和E74樣因子3(ELF3)，這些因子通過調(diào)節(jié)炎癥和分解代謝介質(zhì)而使OA疾病慢性化[22]?；罨腍IF-2α通過與分解代謝基因啟動子中的HIF-2α結合基序結合，促進基質(zhì)降解酶的表達[23]。此外，CCAAT/增強子結合蛋白-β(C/EBPβ)是一種HIF-2α靶基因，通過直接誘導MMP-13的表達而加劇OA的進展[24]。ELK1直接增加堿性成纖維細胞生長因子處理的軟骨細胞中的MMP-13的表達[25]。ELF3作為NF-κB的下游靶標和輔助因子以及NF-κB信號傳導的激活劑，驅動如COX-2、iNOS和MMP-13等基因的表達[26]。在一項關于小鼠內(nèi)側半月板手術(DMM)誘導的骨關節(jié)炎不穩(wěn)定的研究中，軟骨細胞中ELF3的遺傳消融改善了OA的發(fā)展并抑制了iNOS和MMP-13的表達[27]。OA中軟骨細胞肥大樣改變在OA的起始和進展中起了一定的作用，NF-κB在軟骨細胞肥大中的作用已經(jīng)被廣泛描述[28]。簡單地說，NF-κB主要通過SRY-box轉錄因子-9、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和HIF-2α來調(diào)節(jié)軟骨細胞的肥大。例如，HIF-2α不僅是軟骨細胞肥大分化所必需的，而且通過與缺氧反應元件結合而有效地誘導MMP-13和血管內(nèi)皮生長因子的啟動子活性[22]?？傊@些研究強調(diào)，NF-κB編排基因表達程序，通過協(xié)調(diào)多層信號網(wǎng)絡導致基質(zhì)降解酶、促炎細胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而促進OA的發(fā)生和發(fā)展。

3.2通過直接相互作用調(diào)節(jié)NF-κB活性的因子NF-κB在軟骨細胞中的分解代謝作用由幾種NF-κB結合蛋白激活。與NF-κB亞基結合的刺激因子包括IκBζ、轉錄因子4(TCF4)、核糖核酸結合蛋白(SAM68)和核粘蛋白α2(KPNA2)。與健康軟骨相比，OA軟骨過度表達這些蛋白質(zhì)[29]。最近，我們發(fā)現(xiàn)IκBζ抑制可能是OA中NF-κB抑制的另一種治療方法。在軟骨細胞中，升高的IκBζ與NF-κBp65、p50和p52亞基響應IL-1β，并顯著激活NF-κB依賴的轉錄反應，包括分解代謝基因[30]。詳細的分析顯示，軟骨細胞中IκBζ的失活減輕了DMM手術引起的軟骨破壞，但對滑膜炎癥幾乎沒有影響。因此，IκBζ似乎是NF-κB正確激活OA軟骨細胞中基因轉錄程序所必需的。

TCF4是Wnt信號通路的下游效應器[31]。軟骨細胞中TCF4的過度表達通過直接與NF-κBp65結合，誘導MMPs的表達和NF-κB的激活，從而與NF-κB的內(nèi)源性抑制劑IκBα競爭。SAM68可以調(diào)節(jié)幾種細胞類型中NF-κB的活性[32]。在TNF-α處理的軟骨細胞中，SAM68介導NF-κB的激活和分解代謝基因的表達。雖然觀察到SAM68和NF-κB p65之間的物理相互作用，但這種結合如何促進NF-κB激活的分子機制尚不清楚。KPNA2是進口蛋白β家族的一員，調(diào)節(jié)p65核轉位。在IL-1β處理的軟骨細胞中，KPNA2促進p65核轉運，從而加速軟骨細胞分解代謝。因此，通過靶向這些因素干擾NF-κB信號傳導可能為OA治療提供了寶貴的機會。

3.3在OA條件下激活NF-κB的因子 研究結果表明，通過多種信號途徑增加NF-κB活性與增強軟骨破壞呈正相關。例如，將MAPK激酶信號轉導至NF-κB激活的MAPK3激酶轉化生長因子活化激酶1(TAK1)與OA發(fā)病機制有關[33]。IA注射TAK1抑制劑5Z-7導致大鼠DMM模型中NF-κB活化、分解代謝因子表達減少OA發(fā)展減慢，IA注射TAK1編碼腺病毒引起OA樣軟骨損傷。越來越多的證據(jù)顯示OA關節(jié)滑液和關節(jié)軟骨中分泌的蛋白質(zhì)或肽異常堆積，部分蛋白質(zhì)可能成為有效的治療靶點，并起生物標志物的作用。最近，Chang等[34]確定gremlin-1，一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)的細胞外拮抗劑，作為過度機械負荷誘導OA發(fā)展的關鍵調(diào)節(jié)因子。以前的研究表明，過多的機械負荷會導致NF-κB激活和OA的發(fā)展，而生理負荷可以防止軟骨丟失，并在多個水平上通過抑制TAK1和IKKβ從而抑制NF-κB的激活[35]。研究者認為，過度機械負荷激活的Rac1-Ros-NF-κB途徑誘導Gremlin-1，分泌的Gremlin-1進一步激活NF-κB依賴的軟骨細胞分解代謝，而抑制BMPs依賴的軟骨細胞的合成代謝。

與脂肪因子功能、能量穩(wěn)態(tài)和脂肪組織炎癥相關的細胞外因子在OA病理中也起著關鍵作用[36]。許多脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素和抵抗素，對軟骨破壞有刺激作用。這些脂肪因子不僅在OA中表達上調(diào)，還通過涉及NF-κB的機制誘導軟骨細胞中基質(zhì)降解酶和/或促炎介質(zhì)的表達。骨橋蛋白(OPN)和骨膜蛋白是參與脂肪組織炎癥和骨重塑的分泌因子[37]，也與OA有關。OPN通過激活軟骨細胞中的NF-κB來促進MMP-13的表達。然而，也有報道稱OPN可以抑制軟骨細胞中HIF-2α的表達[38]。此外，OPN 基因敲除小鼠表現(xiàn)出由衰老和不穩(wěn)定引起的OA進展增強[39]?？紤]到這些相互矛盾的發(fā)現(xiàn)，可能需要更詳細更深入的研究來澄清這些問題。與OPN一樣，骨膜蛋白也在人類OA軟骨中的表達上調(diào)，在人類軟骨細胞中用骨膜蛋白處理激活NF-κB依賴的分解代謝基因和炎性細胞因子的表達。

OA滑膜或受損軟骨中的炎性細胞因子通過激活NF-κB導致軟骨細胞中分解代謝基因表達增加。IL-6，一個眾所周知的NF-κB靶基因，也在OA進展中起致病作用[21]。最近，IL-36α、IL-1細胞因子亞家族成員被認為是一種強有力的OA誘導因子[40]，在炎癥關節(jié)中高度表達。最近，轉化生長因子(TGF)-β-IL-36α軸被認為是OA病理中的關鍵信號通路。在正常關節(jié)中，TGF-β信號傳導在維持軟骨細胞中起保護作用。Li等[41]發(fā)現(xiàn)關節(jié)損傷引起的TGF-MAPK2型受體(TGFBR2)失活觸發(fā)IL-36α的誘導，導致NF-κB-MAPK依賴的MMP-13激活，最終導致OA軟骨破壞。本研究還揭示了內(nèi)源性IL-36受體拮抗劑作為潛在的治療靶點。另一種炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種染色質(zhì)蛋白，具有核因子和細胞外因子的雙重功能，也可以激活軟骨細胞中的NF-κB信號通路。除了在風濕性關節(jié)炎(RA)和OA滑膜中作為炎癥介質(zhì)發(fā)揮主要作用外，HMGB1還可以調(diào)節(jié)IL-1β誘導的NF-κB的激活和軟骨細胞中分解代謝基因的表達。

一些藥理抑制劑已被證明在OA模型中有效，其中一些通過NF-κB抑制來執(zhí)行其功能。已報道的抑制劑是蛋白激酶C zeta、嘌呤能P2X7受體(P2X7R)、特異性蛋白1(SP1)和受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)。與藥理PKC zeta抑制劑的抗分解作用相似，使用分子途徑抑制PKC zeta，如siRNA介導的KD和顯性陰性PKC zeta的過度表達，也抑制了炎性細胞因子處理的軟骨細胞中ECM的降解[42]。相反，SP1抑制劑普卡霉素A通過主要抑制NF-κB-HIF-2α軸而不是靶向SP1來顯示軟骨細胞中的抗分解代謝作用，因為SP1KD對IL-1β處理的軟骨細胞中分解代謝基因表達的影響最小?？傊?，這些研究確定了NF-κB抑制的潛在信號通路和靶點。

3.4在OA條件下抑制NF-κB的因子 當NF-κB受到維持軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)所需的因素抑制時，通常會觀察到OA嚴重程度降低。這些在軟骨細胞分解代謝中降低NF-κB活性的抑制因子包括是相關蛋白1(YAP1)、皮質(zhì)抑素(CST)、胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF-2)、Serpin家族E成員2(serpine2)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)和細胞因子信號轉導-1抑制子(SOCS1)。最近，Deng等[43]確定YAP1是OA中NF-κB活性的關鍵負性調(diào)節(jié)因子。從機制上講，炎性細胞因子誘導河馬信號傳導激活和依賴于TAK1的YAP1降解，導致IKKα/β-NF-κB級聯(lián)激活。作者還表明，YAP1的軟骨特異性KO通過增強軟骨細胞分解代謝來加劇實驗性OA。此外，OA的發(fā)展通過抑制MST1/2而減輕，MST1/2是河馬信號通路中YAP1的上游抑制激酶。CST(一種神經(jīng)肽)通過直接與腫瘤壞死因子受體結合而拮抗TNF-α功能，從而抑制軟骨細胞中NF-κB的激活[44]。對自發(fā)和手術誘導的OA模型的研究表明，CST缺乏導致加速的OA樣表型，而外源性CST在體內(nèi)減弱OA的發(fā)展。IGF-Ⅱ是一種胰島素樣生長因子，在人類OA軟骨中被發(fā)現(xiàn)下調(diào)[45]。在軟骨細胞或小鼠膝關節(jié)中過度表達IGF-Ⅱ會降低IL-1β誘導的NF-κB激活或實驗性OA進展。Serpine2、LRP1和SOCS1的研究僅限于體外軟骨細胞，但這些蛋白被證明負調(diào)節(jié)炎癥細胞因子誘導的NF-κB的激活和軟骨細胞中分解代謝因子的表達[46]。這些抑制因子可能有助于減輕NF-κB激活導致的軟骨破壞。

4 NF-κB調(diào)控的軟骨細胞凋亡

由于軟骨細胞是唯一存在于軟骨中的細胞類型，因此軟骨細胞存活的失調(diào)可能導致細胞外基質(zhì)丟失和軟骨破壞。許多研究已經(jīng)證明了軟骨細胞凋亡與OA嚴重程度的相關性。雖然目前尚不清楚軟骨細胞凋亡是軟骨變性的誘導者還是軟骨破壞的副產(chǎn)物，但軟骨細胞凋亡是OA發(fā)病機制的一個重要方面。NF-κB在軟骨細胞存活和凋亡中具有雙相作用。NF-κB可以防止TNF-α誘導的細胞死亡，并且這種作用與抗凋亡基因的誘導有關。在軟骨細胞中，TNF-α誘導的凋亡也通過NF-κB抑制而減少。相反，NF-κB也可能具有促凋亡的功能，這取決于刺激和細胞環(huán)境。激活NF-κB的幾個因子，如TCF4、SAM68和RIPK1[47]，被發(fā)現(xiàn)增強誘導的軟骨細胞的凋亡。此外，HIF-2α作為一種NF-κB靶基因，可加速OA軟骨中Fas介導的軟骨細胞凋亡。靶向NF-κBp50亞基的MIR-9促進軟骨細胞存活。Ding 等[48]還發(fā)現(xiàn)miR-93通過靶向TLR4抑制NF-κB途徑，可以抑制脂多糖處理的初級軟骨細胞和內(nèi)側半月板切除撕裂手術模型中的軟骨細胞凋亡。

通過使用軟骨特異性p65KO模型成年小鼠,Kobayashi等[49]研究顯示軟骨細胞中p65水平?jīng)Q定軟骨是經(jīng)歷內(nèi)穩(wěn)態(tài)還是破壞。具體地說，成人軟骨細胞中p65的雜合KO或低劑量的IKK抑制劑在不影響細胞存活的情況下對OA的發(fā)育和軟骨細胞的分解代謝都顯示出可預測的抑制作用，而使用homo-KO完全抑制p65通過促進軟骨細胞凋亡來加速OA。為了支持這一發(fā)現(xiàn)，同一小組后來報道，較高劑量的IKK抑制劑并沒有緩解OA的發(fā)展，而是促進了軟骨細胞的凋亡。考慮到這些報道以及NF-κB在許多細胞過程中的作用，例如細胞存活，開發(fā)抑制OA-響應性NF-κB信號通路而不是生理p65功能的策略可能很重要。值得注意的是，軟骨細胞中IκBζ的同型KO并不影響正常骨骼發(fā)育或軟骨細胞存活，但顯著抑制NF-κB依賴的軟骨細胞分解代謝。因此，IκBζ抑制可能是OA中NF-κB抑制的一種有用的治療方法。

5 結 語

最近許多藥物嘗試治療OA相關的疼痛和功能障礙,其中一些藥物被證明可以減緩OA的進展，但經(jīng)常被觀察到安慰劑效應和極大的不良反應。使用針對特定基因的生物制劑的臨床試驗研究側重于阻斷滑膜和關節(jié)軟骨細胞內(nèi)的炎癥反應，但這種方式在OA治療中并沒有顯示出令人滿意的效果[50]。NF-κB信號通路為靶向治療OA提供了多種途徑，因為許多引起OA的信號通路都是與NF-κB互連的。因此，在這篇綜述中，我們總結了關于NF-κB對OA發(fā)病的影響及其在OA軟骨中的調(diào)控作用。NF-κB與新識別的基因或途徑之間的互聯(lián)可能揭示許多用于減緩或逆轉OA進展的藥物治療的潛在靶點。然而，重要的是如何選擇性地抑制NF-κB中OA的特異性功能而不是生理反應，這需要進一步研究以避免這種非危及生命的疾病的不良反應。因此，需要更詳細地了解NF-κB及其信號通路，以便更好地了解OA的臨床特征并進行有效的臨床治療。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。