活血潛陽祛痰方對肥胖高血壓大鼠心肌氧化應(yīng)激及炎癥的影響*

蘆 波 謝 君 符德玉 陳曉喆 趙銘一 桂明泰 周訓杰 姚 磊 李建華

（上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437）

近年來，肥胖和嚴重肥胖的患病率持續(xù)增長，2017年至2018年成人肥胖率為42.4%［1］，我國肥胖人數(shù)高居全球第一［2］，與此同時，高血壓的流行程度也與日俱增［3］。肥胖是心血管疾病的獨立危險因素，可加劇高血壓靶器官損害及其心血管并發(fā)癥的病理進程，肥胖高血壓（OBH）相關(guān)的心肌重構(gòu)是亟待解決的衛(wèi)生問題。本研究觀察活血潛陽祛痰方對OBH大鼠心肌重構(gòu)的影響，并初步探討該方藥治療OBH的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5周齡SPF級雄性SHR78只，實驗動物合格證號：1100111911038390，雄性WKY6只，實驗動物合格證號：1100111911038391，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。

1.2 實驗藥物

活血潛陽祛痰方由丹參、石決明、川芎、鉤藤、桑寄生、山楂和玉米須組成。按照課題組前期研究，大鼠用量為臨床用量的18倍，委托南京軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科制備浸膏備用，生藥濃度5.98 g/mg。纈沙坦，由諾華制藥公司（北京）生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：X2637。

1.3 試劑與儀器

1）試劑：MDA（貨號：A003-1-2）和Mn-SOD生化試劑盒（貨號：A001-2-2）均由南京建成生物工程研究所提供。AngⅡ酶聯(lián)免疫試劑盒，上海信裕生物科技有限公司，貨號：xy-E12947；NOX4抗體，abcam公司，貨號：ab133303；NF-κb p65抗體，abcam公司，貨號：ab16502；ERK1/2抗體，CST公司，貨號：4695T；p-ERK1/2抗體，CST公司，貨號：4370T。2）儀器：BIORAD公司電泳儀（型號mini protean 3 cell），大連競邁科技有限公司電轉(zhuǎn)儀（PS-9），Tanon-5200成像系統(tǒng)，多功能酶標儀（Bio Tek），臺式高速冷凍離心機（Eppen?dorf），芬蘭雷勃MK3型酶標儀，吉爾森Pipetman型移液器，LeicaHI1210型水浴鍋，美國Revco ULT2586-4-V型超低溫冰箱，美國Baker SG403TX/603TX型生物安全柜，德國Leica正置顯微鏡（DM2000），超聲診斷儀（Super Sonic Aixplorer）。

1.4 模型制備

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)SHR體質(zhì)量隨機篩選出6只繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料（SHR組），余喂養(yǎng)高脂飼料（配方參考文獻［4］改進：普通繁殖飼料60%，豬油12.5%，蔗糖10%，蛋黃粉10%，奶粉5%，膽固醇2%，膽鹽0.5%；委托江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司制作）。10周后，將高脂飼料喂養(yǎng)的SHR中體質(zhì)量位于上游前1/3的大鼠（n=24）選為OBH大鼠［5］。

1.5 分組與給藥

24只OBH大鼠隨機分為4組，每組6只，藥物干預10周。WKY組予普通飼料+飲用水灌胃；OBH組予高脂飼料+飲用水灌胃；中藥低劑量組予高脂飼料+中藥19.35 g/（kg·d）灌胃；中藥高劑量組予高脂飼料+中藥38.7 g/（kg·d）灌胃；纈沙坦組予高脂飼料+30 mg/（kg·d）纈沙坦灌胃；SHR組予普通飼料+飲用水灌胃。

1.6 觀察指標

1.6.1 心臟超聲 給藥結(jié)束后大鼠行脫毛處理，異氟烷吸入麻醉，采用高分辨率小動物超聲儀檢查心臟超聲：左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、室間隔厚度（IVSd）、左心室后壁厚度（LVPWd），每只大鼠取3個心動周期進行測量，取平均值，自動計算LVM-cor。每組檢測3只。

1.6.2 血液標本取材 給藥結(jié)束后大鼠禁食不禁水12 h后取材。稱重并記錄其體質(zhì)量（BW），2%的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射后固定，胸腹部脫毛，75%酒精消毒皮膚，暴露腹腔，以一次性采血針腹主動脈取血8～10 mL，離心，吸取上層血清，分裝置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 心臟重構(gòu)指標檢測 腹主動脈取血后，迅速開胸取出心臟，用預冷的生理鹽水沖洗干凈殘余血液，濾紙吸干水分后，用微型電子天平稱取心臟質(zhì)量（HW）和左心室質(zhì)量（LVM），心臟質(zhì)量指數(shù)=HW/BW和左室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）=LVM/BW。

1.6.4 心肌組織病理觀察 取心尖部組織固定在10%甲醛溶液中，經(jīng)石蠟包埋后制成厚度約4 μm的切片，進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察。

1.6.5 血清和心肌AngⅡ檢測 按上海信裕生物科技有限公司提供的試劑盒說明書檢測血清和心肌AngⅡ水平。

1.6.6 心肌Mn-SOD和MDA檢測 按試劑盒說明書測定心肌組織中Mn-SOD和MDA含量。

1.6.7 Western blotting檢測 每100 mg心肌組織置于培養(yǎng)皿中，手術(shù)剪剪碎成4 mm×4 mm左右的小塊，加入冷裂解液0.5～1 mL，玻璃勻漿器上下手動勻漿，勻漿液在4℃，以3 000 r/min離心5 min，取上清轉(zhuǎn)移測蛋白濃度；GAPDH作為內(nèi)參，取待測蛋白樣品經(jīng)SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜上，將NC膜放入平皿中，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，洗膜3次。放入含NOX4、NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2一抗的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜。吸棄一抗，用5%脫脂奶粉封閉液稀釋半抗兔HRP標記二抗，室溫搖床振蕩反應(yīng)1～2 h。洗膜后顯影、定像。使用軟件對結(jié)果進行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布及方差齊性時以（±s）表示，多樣本均數(shù)比較采用One-Way ANOVA及SNK多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌HE染色結(jié)果

見圖1。WKY組心肌細胞體積正常，排列整齊，心肌各層均勻，結(jié)構(gòu)清晰；SHR組心肌細胞腫脹變性，心肌纖維排列紊亂，心肌成纖維細胞增殖（見箭頭）；OBH組心肌細胞變性，心肌纖維排列紊亂成波浪狀（見箭頭），核固縮，成纖維細胞增殖明顯；中藥低劑量組心肌輕度水腫，心肌纖維排列紊亂，或見個別成纖維細胞浸潤；中藥高劑量組心肌輕度水腫，細胞核形態(tài)趨于正常的圓形或橢圓形，心肌纖維排列趨于整齊，或見個別成纖維細胞浸潤；纈沙坦組心肌細胞輕度變性，心肌纖維輕度波浪狀。

圖1 各組大鼠心肌細胞形態(tài)觀察（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠心臟重構(gòu)指標比較

見表1。結(jié)果顯示OBH組心臟質(zhì)量指數(shù)高于WKY組（P＜0.05），中藥高劑量組和纈沙坦組均可顯著降低大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)（P＜0.05）；OBH組LVMI高于SHR組和WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可顯著降低大鼠LVMI（P＜0.05），中藥低劑量組和中藥高劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義。

表1 各組大鼠心臟重構(gòu)指標比較（±s）

表1 各組大鼠心臟重構(gòu)指標比較（±s）

注：與WKY組比較，*P＜0.05；與SHR組比較，#P＜0.05；與OBH組比較，◇P＜0.05；與中藥低劑量組比較，※P＜0.05；與中藥高劑量組比較，△P＜0.05。下同。

LVMI（mg/g）2.60±0.13 2.99±0.15*3.26±0.27*#2.91±0.08*◇2.71±0.12#◇2.46±0.13#◇※組別WKY組SHR組OBH組中藥低劑量組中藥高劑量組纈沙坦組n 6 6 6 6 6 6心臟質(zhì)量指數(shù)（mg/g）3.23±0.21 3.72±0.22*3.69±0.22*3.49±0.12*#3.25±0.11#◇※3.09±0.13#◇※

2.3 各組大鼠心臟超聲指標比較

見表2。結(jié)果顯示OBH組LVM-cor高于WKY組（P＜0.05），中藥高劑量組和纈沙坦組均可降低LVM-cor（P＜0.05）；各組間LVIDd、IVSd、LVPWd比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠心臟超聲指標比較（±s）

表2 各組大鼠心臟超聲指標比較（±s）

組別WKY組SHR組OBH組中藥低劑量組中藥高劑量組纈沙坦組n 3 3 3 3 3 3 LVM-cor（mg）832.91±100.00 983.07±72.56 1 129.66±50.28*1 044.93±149.78*952.93±28.70◇923.73±101.16◇LVIDd（mm）7.01±1.01 7.38±0.84 7.40±0.78 6.86±0.83 7.18±0.64 7.19±0.23 IVSd（mm）2.12±0.25 2.17±0.18 2.59±0.22 2.54±0.45 2.20±0.28 2.13±0.21 LVPWd（mm）1.90±0.49 2.08±0.45 2.06±0.29 2.21±0.55 2.07±0.05 2.03±0.18

2.4 各組大鼠血清和心肌AngⅡ水平比較

見表3。結(jié)果顯示OBH組血清AngⅡ高于SHR組和WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可下降血清AngⅡ（P＜0.05），纈沙坦組優(yōu)于中藥高劑量組，中藥高劑量組優(yōu)于中藥低劑量組；OBH組心肌AngⅡ高于SHR組和WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可下降心肌AngⅡ（P＜0.05），但3個用藥組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠AngⅡ、MDA、Mn-SOD水平比較（±s）

表3 各組大鼠AngⅡ、MDA、Mn-SOD水平比較（±s）

組別WKY組SHR組OBH組中藥低劑量組中藥高劑量組纈沙坦組n 6 6 6 6 6 6血清AngⅡ（pg/mL）257.89±55.38 598.66±678.54*678.54±106.31*#565.00±122.87*◇445.61±75.32*#◇※352.73±62.14*#◇※△心肌AngⅡ（μg/g）34.57±14.59 82.34±17.57*104.82±27.73*#73.70±23.90*◇64.04±20.56*◇56.30±23.07*#◇心肌 MDA（nmol/mg）3.32±0.81 6.47±0.79*7.68±0.41*5.12±0.25*#◇4.85±0.58*#◇4.74±0.45*#◇心肌 Mn-SOD（U/mg）52.23±7.58 18.39±3.56*14.66±4.13*34.26±7.02*#◇38.57±6.65*#◇39.17±7.15*#◇

2.5 各組大鼠心肌氧化應(yīng)激指標比較

見表3。結(jié)果顯示OBH組心肌MDA水平高于WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可降低MDA（P＜0.05），3個用藥組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；OBH組心肌Mn-SOD水平低于WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可升高心肌Mn-SOD（P＜0.05），3個用藥組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.6 各組大鼠心肌NOX4、NF-κB p65蛋白水平和ERK1/2磷酸化比值比較

見表4，圖2。結(jié)果顯示OBH組NOX4水平高于WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可降低NOX4水平（P＜0.05），3個用藥組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；OBH組NF-κB p65表達高于SHR組和WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可降低NF-κB p65水平（P＜0.05），3個用藥組組間比較差異無統(tǒng)計學意義；OBH組ERK1/2磷酸化比值高于SHR組和WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可降低心肌ERK1/2磷酸化比值（P＜0.05），3個用藥組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表4 各組心肌NOX4、NF-κB p65蛋白水平和ERK1/2磷酸化比值比較（±s）

表4 各組心肌NOX4、NF-κB p65蛋白水平和ERK1/2磷酸化比值比較（±s）

組別WKY組SHR組OBH組中藥低劑量組中藥高劑量組纈沙坦組n 6 6 6 6 6 6 NOX4 0.25±0.08 0.73±0.25*1.06±0.30*0.65±0.17*◇0.63±0.22*◇0.51±0.33◇NF-κB p65 0.23±0.03 0.68±0.16*0.98±0.17*#0.64±0.04*◇0.69±0.08*◇0.55±0.12*◇ERK1/2磷酸化比值0.92±0.14 1.71±0.39*2.42±0.63*#1.80±0.21*◇1.40±0.20◇1.35±0.56◇

圖2 各組大鼠心肌NOX4、NF-κB p65、ERK1/2蛋白表達水平

3 討 論

我國高血壓患病率高達29.6%，患者已達3億［4］。左室肥厚（LVH）是高血壓常見的靶器官損害，也是心臟病發(fā)病率和死亡率增加的獨立危險因素。高血壓和肥胖分別占LVH病因的25%和14%，二者合并存在則高達52%［6］，不容忽視。

中醫(yī)將OBH多歸于“眩暈”等范疇，屬本虛標實之證。OBH者多恣食肥甘厚味，肝氣易動，脾失健運，痰濁內(nèi)蘊，阻塞脈道，血運失暢，瘀血漸生，痰瘀阻滯，損傷心脈，可致心肌重構(gòu)。活血潛陽祛痰方是基于“陽亢、血瘀、痰濁”的組方，課題組既往發(fā)現(xiàn)，該方既能降壓，又可降低OBH大鼠的Lee's指數(shù)，為緩解LVH奠定了基礎(chǔ)［7］。OBH大鼠心肌細胞變性明顯，心肌纖維排列紊亂成波浪狀，核固縮，成纖維細胞增殖明顯，心臟質(zhì)量指數(shù)、LVMI和LVM-cor均顯著升高（P＜0.05），具有明顯的LVH。中藥能顯著降低LVMI，中藥高劑量組心臟質(zhì)量指數(shù)、LVM-cor值、血清和心肌AngⅡ水平顯著降低（P＜0.05），療效優(yōu)于中藥低劑量組。

NOX4是心臟活性氧（ROS）的主要來源［8］，參與了壓力和容量負荷增加引起的心肌肥厚［9］和AngⅡ誘導的心肌肥大［10］。過表達NOX4或AngⅡ誘導心肌內(nèi)源性NOX4增加，可誘導心臟纖維化和心肌細胞凋亡［11］。奧美沙坦酯可抑制NOX4基因表達和ROS的產(chǎn)生，發(fā)揮了改善心肌纖維化和心肌重構(gòu)的作用，且該作用獨立于其降壓作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)OBH組心肌有明顯的氧化應(yīng)激失衡，其Mn-SOD水平降低，而MDA和NOX4表達水平升高?；钛獫撽栰钐捣娇山档蚆DA和NOX4表達（P＜0.05），提高Mn-SOD水平（P＜0.05）。可見調(diào)控氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)可能是活血潛陽祛痰方改善心肌重構(gòu)的機制之一。

過表達NOX4和/或外源性AngⅡ輸注均可激活心肌NF-κB信號通路［11］。NF-κB激活后可移位到核內(nèi)，促進相關(guān)炎性因子的釋放，導致心肌成纖維細胞（CF）的增殖，參與心肌肥厚［13］。ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶家族中的一個重要亞族，可調(diào)節(jié)細胞增殖。活化的ERK1/2通過級聯(lián)反應(yīng)激活NF-κB使其磷酸化，誘導炎癥反應(yīng)，促進糖尿病和高血壓心肌中膠原沉積［14-15］。體外實驗發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可激活CF中的ERK1/2和NF-κB［16］，參與了膠原積聚和纖維化。ERK1/2敲除可以逆轉(zhuǎn)主動脈結(jié)扎小鼠的高血壓性心肌肥厚［17］，抑制ERK1/2也能阻斷內(nèi)皮素-1誘導的SHR心肌細胞的肥大［18］。因此，下調(diào)ERK1/2—NF-κB信號通路可能是改善心肌重構(gòu)的靶點?；钛獫撽栰钐捣侥芟抡{(diào)OBH心肌中ERK1/2和NF-κB的激活來改善心肌肥厚，炎癥反應(yīng)可能是OBH心肌重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)。

綜上可見，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)交互作用參與了OBH心肌重構(gòu)，二者間作用錯綜復雜，具體機制有待進一步研究?；钛獫撽栰钐捣娇筛纳芆BH大鼠心肌肥厚，具有靶器官保護作用，調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是其可能作用機制。