加味滋生青陽片對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟的保護(hù)作用及機制研究*

李 蘇 雍蘇南

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

高血壓病是臨床較為常見的心血管疾病，易引起心、腦、腎等并發(fā)癥［1］。目前，高血壓病患者仍需終身治療，防治之路任重道遠(yuǎn)［2-6］。隨著科技的進(jìn)步、時代的發(fā)展，臨床中患者不僅要求單純的血壓控制，對于生活質(zhì)量的追求也越來越高。中醫(yī)藥治療高血壓病有著顯著優(yōu)勢，不僅能夠控制血壓，同時更能改善臨床伴隨癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。加味滋生青陽片為全國名中醫(yī)王行寬教授基于“虛、風(fēng)、瘀”理論，運用養(yǎng)陰清肝、息風(fēng)通絡(luò)法治療高血壓病（肝熱血瘀證）的經(jīng)驗方，臨床及實驗中取得了很好的療效［7-9］，然而尚缺乏其對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）腎臟及相關(guān)炎癥因子影響的研究。本研究以SHR為模型，研究腎動脈組織病理學(xué)改變與炎癥因子超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的變化，探討加味滋生青陽片對SHR腎臟保護(hù)作用及機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 加味滋生青陽片（白芍10 g，生地黃15 g，麥冬10 g，石斛10 g，天麻10 g，石決明20 g，白蒺藜10 g，鉤藤15 g，柴胡10 g，桑葉10 g，菊花10 g，薄荷10 g，牡丹皮10 g，川芎10 g；每片相當(dāng)于原材料16 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科生產(chǎn)，批號090206，規(guī)格0.40 g/片）；替米沙坦片劑（邦坦）（江蘇萬鄭生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格40 mg/片）；血漿高h(yuǎn)s-CPR酶聯(lián)免疫分析測定盒、IL-1β酶聯(lián)免疫分析測定盒、IL-10酶聯(lián)免疫分析測定盒、TNF-α酶聯(lián)免疫分析測定盒（貨號19-0308，生產(chǎn)批號20190355）均購自武漢市博士德生物科技公司。

1.2 主要儀器 電子天平TP-2200B（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；海利士4℃冰箱（浙江海利士電器有限公司）；超低溫冷凍儲存箱（武漢生物科技有限責(zé)任公司）；TG16-WS臺式高速離心機（湘儀儀器設(shè)備有限公司）；CS101-A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶實驗設(shè)備廠）；多功能酶標(biāo)儀MK-3（湖南中醫(yī)藥大學(xué)內(nèi)科學(xué)實驗室）；820 Histo stat切片機（Reichert公司）；激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；MOTIC顯微圖像攝影系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)公司）；數(shù)彩圖像顯微分析系統(tǒng)BTS-20.M（廣州華粵行公司）；洗板機（芬蘭Thermo Labsystems公司）。

1.3 實驗動物 共選用SPF級12周齡雄性大鼠48只，體質(zhì)量180～220 g，其中WKY大鼠12只，SHR大鼠36只（購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格批號：20190120）。飼料購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。本實驗所需動物及飼料均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，并通過了動物實驗倫理審查，受理號：ZYFY20190203。

1.4 分組與給藥 36只SHR隨機分為模型組、中藥組、替米沙坦，每組均為12只。12只相同周齡Wistar大鼠作為空白對照組。所有實驗大鼠均給予自由飲食、飲水，連續(xù)8周每天上午8點給藥，均按1 mL/kg進(jìn)行灌胃，給藥期間密切觀察所有實驗大鼠的精神、呼吸、飲食、活動力、飲水等狀況。按照成人臨床用藥劑量（以成人體質(zhì)量為70 kg折算）折合大鼠等效劑量，所有藥物用無菌注射用水配置成所需質(zhì)量濃度。中藥組按照3.575 g/（kg·d）給藥，替米沙坦組按照4.33 mg/（kg·d）給藥。模型組、空白對照組灌胃等體積無菌注射用水。

1.5 標(biāo)本采集與測定 1）各組大鼠進(jìn)行尾動脈收縮壓測定，測量時間為灌胃前、灌胃第4、6、8周后3 h，記錄測量數(shù)值。2）各組大鼠第8周灌胃結(jié)束后禁食不禁水1 d，水合氯醛麻醉后腹主動脈取血，離心分離血漿，采用ELISA法測定血漿hs-CRP、IL-1β、IL-10、TNF-α含量。3）采血后處死大鼠取腎臟，分離組織后剪取腎動脈于4%多聚甲醛中固定、脫水、浸蠟、包埋及切片、HE染色及脫水，封片及采圖用光鏡觀察腎動脈病理組織改變。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。本實驗結(jié)果均為計量資料，以（±s）表示。各組間樣本比較采用方差分析檢驗、多重比較，若資料不滿足正態(tài)性、方差齊性，可采用秩和檢驗或近似檢驗等方式。P＜0.05可判斷為有差異，P＜0.01可認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 各組給藥前后血壓比較 見表1。給藥前：模型組、中藥組、替米沙坦組血壓均高于空白組（P＜0.01）。4周后：中藥組、替米沙坦組及空白組血壓明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；中藥組、替米沙坦組較給藥前血壓明顯下降（P＜0.05），但中藥組血壓與替米沙坦組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；6、8周后：中藥組、替米沙坦組及空白組血壓均明顯低于模型組（P＜0.01）；模型組較給藥前血壓上升（P＜0.05）；給藥前后對比，中藥組、替米沙坦組血壓在藥物干預(yù)后明顯下降（P＜0.01）。

表1 各組給藥前后血壓比較（mmHg，±s）

表1 各組給藥前后血壓比較（mmHg，±s）

注：與空白組比較，◇◇P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與本組給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組 別n 給藥前 給藥4周后 給藥6周后 給藥8周后空白組模型組中藥組替米沙坦組12 12 12 12 120.44±8.76 191.33±10.77◇◇192.26±9.20◇◇192.87±12.85◇◇123.13±7.82▲▲205.46±12.69*181.07±10.44▲*■177.37±9.99▲*121.15±10.77▲▲228.64±10.79*176.48±12.11▲*▲■169.57±11.82▲▲**121.71±8.87▲▲238.61±11.34**165.51±9.37▲▲**■164.47±10.59▲▲**

2.2 各組血漿hs-CRP、IL-1β、IL-10、TNF-α水平比較 見表2。藥物灌胃干預(yù)8周后，SHR組、替米沙坦組血漿hs-CRP值高于空白組（P＜0.05或P＜0.01），空白組、中藥組、替米沙坦組血漿hs-CRP值明顯低于SHR組（P＜0.01），但中藥組、替米沙坦組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。SHR組、替米沙坦組血漿IL-1β均明顯高于空白組（P＜0.01），空白組、中藥組、替米沙坦組血漿IL-1β均明顯低于SHR組（P＜0.01）；而中藥組低于替米沙坦組（P＜0.05）。8周后各組血漿IL-10比較，空白組、中藥組、替米沙坦組均高于SHR組（P＜0.01）。但中藥組、替米沙坦組兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。SHR組、替米沙坦組血漿TNF-α均明顯高于空白組（P＜0.01），中藥組、替米沙坦組、空白組血漿TNF-α均明顯低于SHR組（P＜0.01），中藥組血漿TNF-α低于替米沙坦組（P＜0.05）。

表2 各組hs-CRP、IL-1β、IL-10、TNF-α含量比較（±s）

表2 各組hs-CRP、IL-1β、IL-10、TNF-α含量比較（±s）

組別空白組模型組中藥組替米沙坦組n 12 12 12 12 hs-CRP（μg/L）4.80±0.06▲▲8.40±0.34◇◇5.02±0.26▲▲5.67±0.63◇▲▲IL-1β（ng/L）47.68±1.54▲▲74.64±2.47◇◇54.44±3.34▲▲■60.63±3.18◇◇▲▲IL-10（ng/L）62.77±2.64▲▲41.64±2.15 52.07±1.71▲▲50.65±1.86▲▲TNF-α（ng/L）216.85±12.57▲▲372.19±23.20◇◇231.29±13.32▲▲■256.67±14.57◇◇▲▲

2.3 加味滋生青陽片對SHR腎動脈病理學(xué)影響 肉眼觀察：各組腎動脈外觀無明顯變化，在形態(tài)及色澤等方面無顯著差異。顯微鏡下觀察：空白組腎動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞完整，無炎性細(xì)胞浸潤，彈力纖維明顯，平滑肌細(xì)胞無水腫；模型組腎動脈壁有不同程度的炎細(xì)胞浸潤，以黏附為主，內(nèi)皮細(xì)胞局灶性壞死脫落，彈性纖維紊亂，平滑肌細(xì)胞排列不整齊，部分平滑肌細(xì)胞有水腫；替米沙坦組腎動脈壁有不同程度的炎細(xì)胞黏附浸潤，以中膜平滑肌浸潤為主，內(nèi)皮細(xì)胞完整，彈性纖維排列整齊，平滑肌細(xì)胞排列較整齊，無細(xì)胞水腫；中藥組腎動脈壁少量炎細(xì)胞黏附浸潤，內(nèi)皮細(xì)胞較完整，彈性纖維排列正常，平滑肌細(xì)胞排列清晰。

圖1 各組腎動脈病理切片（HE染色，400倍）

3 討 論

滋生青陽湯出自清代名醫(yī)費伯雄所著的《醫(yī)醇義》，全方由生地黃、白芍、麥冬、石斛、天麻、石決明、磁石、桑葉、菊花、牡丹皮、柴胡、薄荷組成。王教授在此方基礎(chǔ)上去磁石，加白蒺藜、鉤藤、川芎，方中白芍滋養(yǎng)陰血以養(yǎng)肝體，所謂“養(yǎng)其肝血，則其用自平”；石決明、白蒺藜?xì)w肝經(jīng)，平肝潛陽，清肝明目，與白芍同用，剛?cè)嵯酀?，滋養(yǎng)、平潛兼顧，可收陰平陽秘之功，三藥共為君藥。生地黃、麥冬、石斛協(xié)同白芍滋陰以固肝體；天麻、鉤藤以加強石決明、白蒺藜之效，同為臣藥。桑葉、菊花清肝明目；柴胡、薄荷疏肝解郁，升發(fā)青陽，引藥入肝，能遂“肝欲散，急食辛以散之”之性，共為佐藥。牡丹皮、川芎寒溫共濟，活血通絡(luò)同為使藥。全方具有養(yǎng)陰清肝、息風(fēng)通絡(luò)之功效?，F(xiàn)代藥理研究證明滋生青陽片組方藥物不僅具有一定的降壓作用，而且有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗氧化、利尿、抗心肌缺血、減慢心率、抗血小板聚集等作用。

高血壓病是一個慢性炎癥過程，有多種炎癥因子參與其發(fā)生發(fā)展［10］。高血壓病在疾病的慢性炎癥過程中可激活淋巴細(xì)胞系統(tǒng)和單核細(xì)胞系統(tǒng)，并產(chǎn)生炎癥因子，對交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)產(chǎn)生影響，從而進(jìn)行血壓調(diào)節(jié)，損傷血管內(nèi)皮功能，加速血管重塑過程等［11］。在高血壓病發(fā)展過程中若某些原因使炎癥因素被清除，機體可出現(xiàn)炎癥穩(wěn)態(tài)；若某些病因?qū)е卵装Y因素持續(xù)存在，炎癥因子水平始終處于異常狀態(tài)，可使炎癥因子持續(xù)分泌并且維持在相對較高的水平，機體炎癥穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能損傷而發(fā)生血管重塑。因此，通過各種手段降低炎癥水平，延緩或控制血管重塑已成為高血壓病的重要治療法則之一［12-13］。研究認(rèn)為，腎臟的炎癥浸潤是高血壓病的一大特征，腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)在高血壓的發(fā)生過程中扮演著重要的角色［14-15］。其影響血壓的可能機制是通過影響局部炎癥因子的釋放而影響腎臟等靶器官血管重塑，導(dǎo)致血壓升高。hs-CRP、IL-1β、TNF-α等多種細(xì)胞因子共同構(gòu)成炎癥細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，參與多種炎癥性疾病的病理過程［16］。研究證明，hs-CRP、IL-1β、TNF-α參與腎臟血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展，其機制可能是它們在腎臟細(xì)胞上的異常表達(dá)刺激各種生長因子的表達(dá)，作用于腎血管平滑肌細(xì)胞，加速血管重塑。抗炎因子IL-10是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，可抑制炎癥免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫，通過對血管外基質(zhì)及血管平滑肌細(xì)胞的影響，明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解可通過多種途徑預(yù)防、延緩腎血管重構(gòu)［17-19］。

前期臨床研究表明，滋生青陽片能降低SHR血壓，而且能逆轉(zhuǎn)左室肥厚和心肌的超微結(jié)構(gòu)損害，抑制血漿內(nèi)皮素的產(chǎn)生，降低血漿血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）及醛固酮濃度［8-9］。循環(huán)系統(tǒng)和局部組織中AngⅡ水平可在機體處于炎癥病理狀態(tài)時明顯增高［20］。而AngⅡ可介導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展。在本實驗中，與相同周齡的空白組大鼠相比，模型組大鼠血壓水平不斷上升，且其腎動脈壁有不同程度的炎細(xì)胞浸潤，以黏附為主，內(nèi)皮細(xì)胞局灶性壞死脫落，彈性纖維紊亂，平滑肌細(xì)胞排列不整齊，部分平滑肌細(xì)胞有明顯水腫，并伴隨著血漿促炎因子hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高，抗炎因子IL-10水平下降，表明炎癥反應(yīng)與自發(fā)性高血壓大鼠的腎動脈血管重塑有著密切關(guān)系。實驗發(fā)現(xiàn)，中藥組及替米沙坦組大鼠在藥物灌胃干預(yù)后血壓水平明顯下降，且其腎動脈重構(gòu)現(xiàn)象存在明顯改善，同時出現(xiàn)血漿hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平降低，而IL-10水平升高。由此我們可以推斷，血漿中炎癥因子水平對中藥組以及替米沙組大鼠的血壓下降和改善腎動脈血管重構(gòu)產(chǎn)生了影響。本實驗研究結(jié)果表明，中藥組加味滋生青陽片在延緩SHR腎動脈血管重塑方面優(yōu)于替米沙坦，而且可以更好地降低促炎因子IL-1β、TNF-α水平。因此，我們認(rèn)為加味滋生青陽湯對SHR的腎動脈血管重塑過程具有保護(hù)效應(yīng)，其具體機制可能和其改變血漿炎癥因子水平相關(guān)。