十二井穴流注放血干預(yù)急性腦缺血模型大鼠HSP70及CD31表達(dá)的研究*

趙婷婷 郝利芳 張 蕊 趙立新

（山西省中醫(yī)院，山西 太原 030012）

急性腦缺血（ACI）是由于腦動(dòng)脈血管閉塞導(dǎo)致的腦部血液循環(huán)障礙，造成腦組織缺血壞死并伴隨不同程度的神經(jīng)功能缺失及其他后遺癥［1］，臨床病理表現(xiàn)為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞減少［2］，是具有高致殘和致死率的急性心腦血管疾病之一。ACI常見治療方法有藥物治療、手術(shù)治療外及干細(xì)胞替代治療等［3-4］。近年來中醫(yī)中藥對(duì)ACI的治療研究及效果受到廣泛關(guān)注，其中十二經(jīng)脈氣血流注理論也應(yīng)用于ACI的治療中［5-7］。本研究針對(duì)ACI在辰時(shí)時(shí)段高發(fā)的特點(diǎn)，結(jié)合不同時(shí)辰氣血運(yùn)行至不同經(jīng)絡(luò)的特點(diǎn)給予腦缺血模型大鼠十二井穴流注放血療法干預(yù)，比較十二井穴流注放血療法和普通十二井穴放血對(duì)ACI的治療效果，為中醫(yī)臨床治療ACI提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2～3月齡SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（220.0±10.0）g，由山西省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)條件為（23.0±1.5）℃恒溫、（60.0±5.0）%恒濕，12 h晝夜節(jié)律交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行造模。本實(shí)驗(yàn)通過山西省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)的審批，嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理委員會(huì)的各項(xiàng)要求執(zhí)行。

1.2 試藥與儀器

1）試藥：免疫組化PV-9000檢測(cè)試劑盒、DAB顯色液購自北京中杉金橋生物公司；anti-CD31、anti-HSP70抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；丁苯酞軟膠囊（0.1g/粒）購自石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司。2）儀器：針灸針（30號(hào)，1寸，漢醫(yī)牌）；2135型組織切片機(jī)（德國Leica）；Moticam 3000顯微攝影成像系統(tǒng)（美國Motic）；932型電熱燒灼器（上海醫(yī)療電子儀器廠）；Olympus光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）。

1.3 造模及分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、普通放血組、流注放血1組、流注放血2組、西藥組，每組10只，分籠飼養(yǎng)。除假手術(shù)組外，其余各組參照局灶性凝結(jié)大腦中動(dòng)脈法［8］建立大鼠大腦中動(dòng)脈梗阻（MCAO）模型，方法如下：腹腔注射200 μL 0.4%戊巴比妥鈉溶液麻醉后右側(cè)臥位固定大鼠，剃去耳后至頸部鼠毛后消毒處理，沿眼眶后至耳的連線中點(diǎn)縱向切口1～2 cm，暴露頜骨，輕抬頭部可見橫過嗅束上行的大腦中動(dòng)脈（MCA）。用燒紅的電阻絲輕靠接觸嗅束上緣暴露的MCA，使之發(fā)生快速凝閉，若發(fā)生血管破裂出血應(yīng)用小棉球局部輕壓止血，誘發(fā)MCAO模型。假手術(shù)組大鼠僅用玻璃分針游離出單側(cè)MCA，不做誘導(dǎo)處理。切口縫合并消毒，以術(shù)后出現(xiàn)同側(cè)霍納氏（Homer）綜合征、左側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失、對(duì)側(cè)偏癱、活動(dòng)時(shí)出現(xiàn)左側(cè)傾倒及懸尾時(shí)出現(xiàn)左上肢向胸前屈曲等作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 干預(yù)方法

1）普通放血組：選取位于大鼠四肢趾端的十二井穴，每側(cè)計(jì)6穴。用膠布處理毫針針尖，使其刺入皮膚深度限定在1 mm。用處理后的毫針每日7∶00依次按照少商、商陽、中沖、關(guān)沖、少?zèng)_、少澤、涌泉、隱白、大敦、厲兌、足竅陰、至陰穴的順序點(diǎn)刺放血，每穴放血量為1滴。2）流注放血1組：取穴、放血量均與普通放血組相同。依照十二經(jīng)脈流注次序，從當(dāng)值經(jīng)脈的井穴開始，每日7∶00取大鼠四肢對(duì)應(yīng)人十二井穴解剖位置［9］，依照厲兌、隱白、少?zèng)_、少澤、至陰、涌泉、中沖、關(guān)沖、足竅陰、大敦、少商、商陽順序，先左側(cè)后右側(cè)依次放血。3）流注放血2組：取穴、放血量均與普通放血組相同。依照十二經(jīng)脈流注次序，在經(jīng)脈流注和井穴交接時(shí)刻，選擇當(dāng)值經(jīng)脈的井穴放血，每日5∶00（寅時(shí)-卯時(shí)交接）先后放肺經(jīng)和大腸經(jīng)之少商、商陽穴；9∶00（辰時(shí)-已時(shí)交接）放胃經(jīng)和脾經(jīng)之厲兌、隱白穴；13∶00（午時(shí)-未時(shí)交接）放心經(jīng)和小腸經(jīng)之少?zèng)_、少澤穴；17：00（申時(shí)-酉時(shí)交接）放膀胱經(jīng)和腎經(jīng)之至陰、涌泉穴；21∶00（戌時(shí)-亥時(shí)交接）放心包和三焦經(jīng)之中沖、關(guān)沖穴；1∶00（子時(shí)-丑時(shí)交接）放膽經(jīng)和肝經(jīng)之足竅陰、大敦穴。4）西藥組：造模后按80 mg/kg腹腔注射10 mg/mL的丁苯酞稀釋液，治療時(shí)間與普通放血組針刺放血時(shí)間相同。5）假手術(shù)組及模型組：分別給予等量生理鹽水腹腔注射，正常喂養(yǎng)。治療1周后各組進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 依據(jù)改良的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分量表（mNSS）［10］對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行打分評(píng)定，通過對(duì)提尾、平衡木、握力、運(yùn)動(dòng)能力、感知能力及反射能力打分評(píng)估模型大鼠的治療及預(yù)后情況，最高分?jǐn)?shù)18分，分?jǐn)?shù)越高代表神經(jīng)系統(tǒng)功能損害越嚴(yán)重。分別于治療前、治療1周后記錄各組大鼠的評(píng)分情況，每只大鼠重復(fù)測(cè)定3次。每只大鼠重復(fù)測(cè)定3次。

1.5.2 腦組織缺血區(qū)病理變化 各組大鼠于神經(jīng)功能評(píng)分完成后給予10%水合氯醛腹腔深度麻醉，迅速開胸暴露心臟，心臟灌注處死。斷頭取腦，腦組織置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定過夜，組織浸蠟包埋，冷凍切片后用多聚耐氨酸固定于載玻片上，HE染色觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)改變，觀察神經(jīng)元是否皺縮及數(shù)量變化。

1.5.3 腦組織缺血區(qū)HSP70、CD31表達(dá) 免疫組化參照PV-9000試劑盒說明書，分別取腦組織切片，經(jīng)枸櫞酸鈉抗原修復(fù)后采用兩步法染色檢測(cè)缺血區(qū)及周圍腦組織HSP70及CD3蛋白表達(dá)情況，每組大腦在高倍鏡視野下隨機(jī)選取3個(gè)缺血區(qū)視野，拍照并計(jì)數(shù)視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)量，圖片采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)，取均值比較各組大鼠組織水平相關(guān)蛋白表達(dá)差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 造模后大鼠一般情況

除假手術(shù)組，其余5組大鼠造模后均出現(xiàn)不同程度的同側(cè)霍納氏（Homer）綜合征、左側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失、對(duì)側(cè)偏癱、行走時(shí)出現(xiàn)左側(cè)傾倒及懸尾時(shí)出現(xiàn)左上肢向胸前屈曲等行為異常表征，mNSS評(píng)分組間不存在明顯差異（表1），均符合本研究納入標(biāo)準(zhǔn)用于實(shí)驗(yàn)治療。

2.2 各組大鼠mNSS評(píng)分結(jié)果比較

見表1。根據(jù)mNSS評(píng)分結(jié)果下顯示假手術(shù)組大鼠治療前后均無神經(jīng)功能缺陷，模型組大鼠治療前后均表現(xiàn)為明顯神經(jīng)功能缺陷，普通放血組、流注放血1組、流注放血2組和西藥組大鼠治療后mNSS評(píng)分均較治療前顯著降低（P＜0.05）；與普通放血組相比，流注放血2組、西藥組大鼠治療后mNSS評(píng)分顯著降低（P＜0.05），同時(shí)西藥組與流注放血2組大鼠治療后mNSS評(píng)分間無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠mNSS評(píng)分結(jié)果比較（分，±s）

表1 各組大鼠mNSS評(píng)分結(jié)果比較（分，±s）

注：與本組治療前比較，*P＜0.05；與普通放血組比較，△P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05。下同。

治療后0.50±0.01 13.33±1.67 10.26±1.01*▲9.66±0.88*▲8.35±0.69*△7.53±0.70*△組別假手術(shù)組模型組普通放血組流注放血1組流注放血2組西藥組n 10 10 10 10 10 10治療前1.00±0.02 13.14±1.41 12.86±1.26 13.19±1.19 13.05±0.94 13.21±1.54

2.3 各組大鼠腦組織病理變化

見圖1。結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，染色清晰，細(xì)胞正常，無明顯病理改變。模型組大鼠病理變化較為嚴(yán)重，顯微鏡下可見組織嚴(yán)重破損，神經(jīng)元細(xì)胞大量丟失，膠質(zhì)細(xì)胞增生并伴有大面積的血細(xì)胞聚集，局部存在炎性細(xì)胞浸潤。普通放血組大鼠病理切片較模型組相比組織結(jié)構(gòu)略有恢復(fù)，其他方面改變差異并不明顯。流注放血1組大鼠腦組織破損已大部分恢復(fù)，細(xì)胞仍大量腫脹。流注放血2組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，神經(jīng)元多數(shù)處于完整正常狀態(tài)，但局部仍可見損傷區(qū)域周邊存在較多細(xì)胞膨大、胞核皺縮等現(xiàn)象。西藥組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量顯著恢復(fù)，膠質(zhì)細(xì)胞略有增生，少量細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象。

圖1 各組大鼠腦組織病理變化（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠腦組織HSP70、CD31蛋白表達(dá)比較

見表2，圖2～圖3。免疫組化染色后HSP70及CD31陽性反應(yīng)細(xì)胞呈棕黃色深染，各組大鼠腦組織切片中陽性細(xì)胞表達(dá)量計(jì)數(shù)結(jié)果見表2。與模型組大鼠相比，普通放血組大鼠腦組織中HSP70、CD31蛋白表達(dá)量稍有增加但無顯著差異（P＞0.05），流注放血1組、流注放血2組及西藥組大鼠腦組織中HSP70、CD31蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；普通放血組大鼠腦組織HSP70、CD31蛋白表達(dá)量與流注放血1組無明顯差異（P＞0.05），而顯著低于流注放血2組和西藥組（P＜0.05）；西藥組大鼠腦組織中HSP70、CD31蛋白陽性表達(dá)數(shù)最多，但與流注放血2組大鼠無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠腦組織HSP70、CD31陽性表達(dá)數(shù)量比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織HSP70、CD31陽性表達(dá)數(shù)量比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組普通放血組流注放血1組流注放血2組西藥組n 10 10 10 10 10 10 HSP70+20.56±5.15▲15.11±4.96▲19.67±6.86▲24.44±5.79*▲28.89±6.85*△33.78±6.78*△CD31+2.33±1.00▲3.33±1.12▲4.00±0.71▲5.56±1.42*▲7.89±0.78*△8.44±1.24*△

圖2 各組大鼠腦組織HSP70蛋白表達(dá)（IHC染色，400倍）

圖3 各組大鼠腦組織CD31蛋白表達(dá)（IHC染色，400倍）

3 討 論

《靈樞經(jīng)》《類經(jīng)》等著作中描述井穴為十二經(jīng)脈陰陽之氣的始發(fā)之處［11］，十二經(jīng)脈的“根”即為各經(jīng)散布在手足四肢末端的井穴，因此井穴具有清熱安神、蘇厥鎮(zhèn)痛、醒腦開竅等作用，特別對(duì)于外感所致的高熱久稽、溫?zé)嵝皻庖l(fā)的高熱驚厥以及氣血不通所致的軀體痛癥的治療研究較為深入［12］，這其中針灸井穴起效快、療效顯著受到廣泛重視。氣血在十二經(jīng)脈內(nèi)的流注次序從手太陰肺經(jīng)開始，依次流至手陽明大腸經(jīng)、足陽明胃經(jīng)、足太陰脾經(jīng)、手少陰心經(jīng)、手太陽小腸經(jīng)、足太陽膀胱經(jīng)、足少陰腎經(jīng)、手厥陰心包經(jīng)、手少陽三焦經(jīng)、足少陽膽經(jīng)、足厥陰肝經(jīng)，再流至手太陰肺經(jīng)，形成一個(gè)“陰陽相貫，如環(huán)無端”的整體循行系統(tǒng)［13］。在十二經(jīng)脈氣血流注理論中，手足陰陽表里經(jīng)的井穴在四肢末端井井相會(huì)能實(shí)現(xiàn)陰陽交錯(cuò)，產(chǎn)生經(jīng)氣，經(jīng)氣不斷的積聚、充實(shí)進(jìn)而促進(jìn)經(jīng)脈氣血沿著十二經(jīng)脈氣血循環(huán)灌注［14］。

天之陰陽隨時(shí)間而遞相變化，“天人合一，天人相應(yīng)”，人體陰陽亦隨之改變，故可從一日十二時(shí)辰所屬地支闡述人體陰陽盛衰的節(jié)律變化。子午流注學(xué)說以一天十二時(shí)辰流注十二經(jīng)，即寅時(shí)從肺經(jīng)開始依次流注大腸經(jīng)、胃經(jīng)、脾經(jīng)、心經(jīng)、小腸經(jīng)、膀胱經(jīng)、腎經(jīng)、心包經(jīng)、三焦經(jīng)、膽經(jīng)而終止于丑時(shí)肝經(jīng)，遵循氣血晝夜流注規(guī)律而擇時(shí)施治即為子午流注納子法，又稱“納支法”［15］。井穴針灸基于這一理論遵循十二經(jīng)脈氣血流注的各時(shí)辰和井穴循序逐漸發(fā)展和完善了起來，針對(duì)不同疾病的時(shí)間醫(yī)學(xué)規(guī)律和日夜節(jié)律變化給予了新的治療思路和方法。

本研究選取大鼠雙側(cè)十二經(jīng)井穴進(jìn)行針刺放血治療，分別設(shè)立普通放血組、流注放血1組、流注放血2組，流注放血1組按十二經(jīng)脈流注次序在單一時(shí)段對(duì)十二經(jīng)井穴放血治療，流注放血2組依照子午流注時(shí)間理論對(duì)十二經(jīng)井穴放血治療：每日寅時(shí)-卯時(shí)交接時(shí)刻先后放肺經(jīng)、大腸經(jīng)之少商、商陽；辰時(shí)-已時(shí)交接時(shí)刻放胃經(jīng)、脾經(jīng)之厲兌、隱白；午時(shí)-未時(shí)交接時(shí)刻放心經(jīng)、小腸經(jīng)之少?zèng)_、少澤；申時(shí)-酉時(shí)交接時(shí)刻放膀胱經(jīng)、腎經(jīng)之至陰、涌泉；戌時(shí)-亥時(shí)交接時(shí)刻放心包、三焦經(jīng)之中沖、關(guān)沖；子時(shí)-丑時(shí)交接時(shí)刻放膽經(jīng)、肝經(jīng)之足竅陰、大敦。比較普通放血法、按經(jīng)脈流注次序單一時(shí)段放血以及子午流注放血對(duì)MCAO模型大鼠的治療效果。結(jié)果顯示，相較于治療前，普通放血組、流注放血1組、流注放血2組和西藥組治療方法均對(duì)模型大鼠神經(jīng)功能具有顯著改善效果。比較各組治療后大鼠mNSS評(píng)分可見除注射治療丁苯酞軟膠囊陽性藥治療神經(jīng)缺陷效果最佳外，3組針灸放血方法中流注放血2組治療效果與西藥組無異，普通放血組和流注放血1組治療效果較差。說明依照十二經(jīng)脈流注次序，在經(jīng)脈流注和井穴交接時(shí)刻，選擇當(dāng)值經(jīng)脈針灸放血的治療方法優(yōu)于普通放血法和單一時(shí)段流注放血方法，其對(duì)神經(jīng)功能缺陷的治療效果及腦組織損傷區(qū)域病理狀態(tài)的逆行改善效果顯著提高。在分子水平，HSP70是熱休克蛋白（HSPs）家族的主要成員之一，HSPs受到熱休克因子（HSF）誘導(dǎo)相關(guān)靶基因上熱休克原件（HSE）的表達(dá)而激活，因此在正常腦組織中HSP70為顯著低表達(dá)［16］，在缺氧、缺血及其他應(yīng)急刺激下HSP70表達(dá)量會(huì)發(fā)生顯著變化。本研究模型組大鼠腦組織HSP70表達(dá)量最少，各治療組大鼠HSP70的表達(dá)量隨其治療效果改善而增加，同時(shí)免疫組化結(jié)果顯示HSP70的應(yīng)激性表達(dá)分布主要集中于壞死神經(jīng)元、局部梗死區(qū)域及炎性細(xì)胞浸潤區(qū)域周圍。以往研究表明，HSP70能夠發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用并改善腦內(nèi)損傷部位炎性環(huán)境［17］，提示針灸井穴流注放血方法能夠通過激活HSP70的表達(dá)分泌，發(fā)揮對(duì)ACI模型大鼠的治療作用，推測(cè)其作用機(jī)制可能與炎癥抑制、削弱興奮性氨基酸對(duì)神經(jīng)元的損傷，清除腦內(nèi)過氧化物積聚、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞有關(guān)。另一方面，CD31作為血管內(nèi)皮特異性標(biāo)志物［18］，CD31的表達(dá)增加表明針灸井穴流注放血能夠促進(jìn)腦血管內(nèi)皮新生，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物增加改善缺血區(qū)腦組織病理結(jié)構(gòu)變化，減少了血細(xì)胞在組織內(nèi)的進(jìn)一步積聚，與HE染色觀測(cè)結(jié)果一致。同樣說明了十二井穴流注放血的治療方法優(yōu)于普通針灸放血，能加速腦組織損傷部位血管新生，改善腦血流的循環(huán)代謝。

前期研究多集中于腦缺血后即刻給予十二井穴放血對(duì)細(xì)胞內(nèi)c-fos蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)、腦血管流速雙向調(diào)節(jié)及各井穴電生理等方面的顯著調(diào)節(jié)作用［19-20］。治療方法也局限于單一治療時(shí)段及針刺順序，未對(duì)針灸井穴和時(shí)間與經(jīng)脈血流循環(huán)順序的相關(guān)性加以重視和探究。本研究首次探究了十二井穴流注放血對(duì)ACI大鼠腦組織的保護(hù)作用及對(duì)神經(jīng)缺陷的調(diào)節(jié)作用，且其治療效果優(yōu)于普通辨證取穴及十二井穴放血法?！夺樉拇蟪伞罚?1］記載“剛?cè)嵯嗯?，陰陽結(jié)合，氣血循環(huán)，時(shí)穴開闔”，表明子午流注取穴施治方法能夠調(diào)和人體陰陽經(jīng)脈銜接、疏通經(jīng)絡(luò)從而改善氣血溝通循環(huán)，促進(jìn)機(jī)體功能的恢復(fù)。本研究采用的十二井穴流注放血遵循了體內(nèi)血液流經(jīng)十二經(jīng)脈支端隨時(shí)辰變化的客觀規(guī)律，擇時(shí)取穴，符合子午流注“天人合一”“臟氣法時(shí)”的理論基礎(chǔ)［22］。根據(jù)體內(nèi)氣血虛衰的周期性變化規(guī)律配合氣血灌注順序定時(shí)、定序施針放血的治療方法，有效地激發(fā)機(jī)體的內(nèi)在調(diào)節(jié)功能，并對(duì)腦缺血損傷所致血管梗阻、血管阻塞等具有治療效果，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)作用機(jī)制可能與激活HSP70表達(dá)保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)腦損傷部位血管新生有關(guān)。此外本研究仍需深入探究十二井穴流注放血對(duì)腦內(nèi)多通路、多機(jī)制的調(diào)節(jié)是否起作用，為臨床施治提供充分的理論依據(jù)。