石蒜堿誘導(dǎo)H₂₂荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性及機(jī)制研究

辛國松 張晶 李吉業(yè) 季宇彬 劉斌 李鈞 陳鷹翔 于淼

摘 要 目的：探討石蒜堿誘導(dǎo)H22荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性及其機(jī)制。方法：以昆明種小鼠為對(duì)象，通過前肢腋部皮下接種H22肝癌小鼠腹水構(gòu)建小鼠實(shí)體瘤模型，將造模后的小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組（羥基喜樹堿6 mg/kg）和石蒜堿低、中、高劑量組（10、20、40 mg/kg），每組10只。陰性對(duì)照組小鼠灌胃等體積生理鹽水，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)給藥7天。末次給藥后，檢測(cè)小鼠的瘤體質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率。另通過腹腔注射H22肝癌小鼠腹水構(gòu)建小鼠腹水瘤模型，同法分組、給藥。末次給藥后，記錄小鼠的生存時(shí)間并計(jì)算生存延長率，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠腫瘤細(xì)胞的早期凋亡率;在設(shè)立正常對(duì)照組（未荷瘤正常小鼠）的基礎(chǔ)上，采用熒光探針鈣黃綠素乙酰甲酯染色法考察各組小鼠腫瘤細(xì)胞的線粒體膜通透性，采用Rhodamine 123染色法考察其線粒體電位變化，采用比色法和Western blot法分別檢測(cè)其胱天蛋白酶3（Caspase-3）活性和凋亡相關(guān)蛋白[Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C（Cyt-C）、Caspase-9]的表達(dá)情況。結(jié)果：與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和石蒜堿各劑量組小鼠瘤體質(zhì)量均顯著降低，生存時(shí)間均顯著延長，腫瘤細(xì)胞的早期凋亡率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;其抑瘤率分別為39.41%、23.36%、36.50%、56.93%，生命延長率分別為49.23%、29.09%、50.19%、69.08%。與正常對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞線粒體膜通透性、Caspase-3蛋白活性以及Cyt-C、Caspase-9蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，線粒體膜電位、Bcl-2/Bax比值顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與陰性對(duì)照組比較，各藥物組小鼠腫瘤細(xì)胞線粒體膜通透性和Bcl-2/Bax比值均顯著降低，線粒體通透性、Caspase-3蛋白活性和Cyt-C、Caspase-9蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：石蒜堿可誘導(dǎo)H22荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡，這種作用可能與其開放線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔以增加線粒體通透性、降低線粒體膜電位、誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 石蒜堿;荷瘤小鼠;線粒體;抗腫瘤;細(xì)胞凋亡;機(jī)制

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）05-0571-07

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the activity of lycorine to the in vivo apoptosis of tumor cells in H22-bearing mice and its mechanism. METHODS： Kunming mice were inoculated subcutaneously with ascites of H22 hepatoma mice in the armpit of forelimb to establish solid tumor model. After modeling， mice were randomly divided into negative control group， positive control group （hydroxycamptothecin 6 mg/kg）， lycorine low-dose， medium-dose and high-dose groups （10， 20， 40 mg/kg）， with 10 mice in each group. Negative control group was given constant volume of normal saline intragastrically， and administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 7 days. After last medication， the weight of tumor was detected and anti-tumor rate was calculated. Ascites tumor model of mice was established by intraperitoneal injection of H22 hepatoma mice ascites， and then were grouped with same method and given relevant medicine as above. After last medication， survival time of mice was recorded and the life prolongation rate was calculated. The early apoptotic rate of tumor cells in mice was detected by flow cytometry. On the basis of normal control group （normal mice without tumor）， the mitochondrial membrane permeability of tumor cells in each group was investigated by Calcein AM staining. The changes of mitochondrial potential were investigated by Rhodamine 123 staining. Colorimetry and Western blot assay were adopted to detect the Caspase-3 activity and expression of apoptosis-related protein （Bcl-2， Bax， Cyt-C and Caspase-9）. RESULTS： Compared with negative control group， the tumor weight of positive control group and lycorine groups were decreased significantly， while the survival time was significantly prolonged， and the early apoptotic rate of tumor cells was significantly increased （P<0.05 or P<0.01）; the anti-tumor rates were 39.41%， 23.36%， 36.50%， 56.93%， and life prolongation rates were 49.23%， 29.09%， 50.19%， 69.08%. Compared with normal control group， the mitochondrial membrane permeability， Caspase-3 protein activity and protein expression of Cyt-C and Caspase-9 were significantly increased， while the mitochondrial membrane potential and Bcl-2/Bax ratio were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with negative control group， mitochondrial membrane permeability and Bcl-2/Bax ratio were decreased significantly in administration groups， while mitochondrial permeability， Caspase-3 protein activity and protein expression of Cyt-C and Caspase-9 were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Lycorine can induce the apoptosis of tumor cells in H22-bearing mice， the effects of which may be associated with opening mitochondrial membrane permeability transition pore to increase mitochondrial permeability， decreasing mitochondrial membrane potential and up-regulating the expression of apoptosis-related proteins.

KEYWORDS? ?Lycorine; Tumor-bearing mice; Mitochondrial; Anti-tumor; Apoptosis; Mechanism

石蒜堿廣泛存在于石蒜科植物中，是一種異喹啉類生物堿[1-3]。該化合物的分子量為287.30，化學(xué)式為C16H17NO4，純品為無色棱柱狀的結(jié)構(gòu)晶體，熔點(diǎn)為275～280 ℃，微溶于氯仿、乙醇和石油醚，可溶于稀酸，但難溶于水[1-3]?，F(xiàn)有研究表明，石蒜堿主要是從石蒜的鱗莖、文殊蘭的種子和葉片、朱頂紅的葉片中被提取出來的[4-7]，具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗病毒、鎮(zhèn)靜等[8-12]。近年來，國內(nèi)外專家學(xué)者對(duì)石蒜堿的抗腫瘤作用進(jìn)行了諸多研究，發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞[13-15]、人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞[16-17]、人白血病U937細(xì)胞[18]、人食管癌Eca-109細(xì)胞[19]、人肝癌HepG2細(xì)胞[20]、人胃癌SGC-7901細(xì)胞[21]均具有顯著的抑制作用，但現(xiàn)有研究大多以體外試驗(yàn)為主，缺少對(duì)石蒜堿體內(nèi)抗腫瘤藥效學(xué)研究的相關(guān)報(bào)道，且抗腫瘤作用機(jī)制尚未明確。因此，本研究以此為切入點(diǎn)，通過建立小鼠體內(nèi)腫瘤模型，從細(xì)胞水平、分子水平對(duì)石蒜堿的抗腫瘤活性進(jìn)行探討，并初步挖掘其作用機(jī)制，旨在為石蒜堿抗腫瘤作用機(jī)制的闡明以及其相關(guān)抗腫瘤新藥的研發(fā)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ECO-170P-230型培養(yǎng)箱（美國NBS公司），CKX-41-32型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），標(biāo)準(zhǔn)型PB-10 pH計(jì)（德國Sartorius公司），AR1140型分析天平（美國OHAUS公司），DL-CJ-1N型醫(yī)用型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），TCS-SP2型激光共聚焦掃描顯微鏡（德國Leica公司），L-90K型低溫高速離心機(jī)（美國Beckman公司），680型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），DYY-7C型電泳儀、WD-9413C型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一儀器廠）等。

1.2 主要藥品與試劑

石蒜堿原料藥（批號(hào)34296，純度98%）購自阿拉丁試劑有限公司;羥基喜樹堿原料藥（批號(hào)20130112，純度98%）購自哈爾濱圣泰藥業(yè)有限公司;熒光染料Rhodamine 123（批號(hào)C2215S）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）二抗（批號(hào)A0277）、兔Bcl-2多克隆抗體（批號(hào)AB116）、小鼠細(xì)胞色素C（Cyc-C）多克隆抗體（批號(hào)AC908）、小鼠Bax多克隆抗體（批號(hào)AB026）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)AC033）、兔Caspase-9多克隆抗體（批號(hào)AC062）、兔β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號(hào)AF5003）、考馬斯亮藍(lán)快速染色液（批號(hào)P0017）均購自碧云天生物技術(shù)研究所;臺(tái)盼藍(lán)染液（批號(hào)：C0040）購自北京索萊寶科技有限公司;胰酶（批號(hào)C0202）、PI染色細(xì)胞凋亡試劑盒（批號(hào)C1056）、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C2006）、熒光探針鈣黃綠素乙酰甲酯（Calcein AM）染料（批號(hào)C2009S）、裂解液（批號(hào)P0013）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣緩沖液（批號(hào)P0015）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;小牛血清（批號(hào)11011-8611）購自浙江天杭生物科技股份有限公司;Reagent A溶液（批號(hào)23221）購自北京諾為生物科技有限公司;AP-NBT/BICT顯色液（批號(hào)5972）購自上海一基生物試劑有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)10491）購自北京博奧華醫(yī)生物科技有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物與細(xì)胞

清潔級(jí)健康昆明種小鼠雌雄各半，5周齡，體質(zhì)量18～22 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供[動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（黑）2017-010];小鼠H22肝癌細(xì)胞株由哈爾濱商業(yè)大學(xué)理學(xué)院提供。

2 方法

2.1 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠抗腫瘤作用研究

2.1.1 H22荷瘤小鼠實(shí)體瘤模型的建立 取出凍存好的H22肝癌細(xì)胞株復(fù)蘇后，以RPMI 1640培養(yǎng)基重懸為5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取小鼠，于腹腔部位消毒后，取上述細(xì)胞懸液按0.2 mL/只腹腔接種，常規(guī)飼養(yǎng)5～8天，以腹腔明顯變大、腹水飽滿為接種成功。隨后，于無菌條件下對(duì)小鼠腹部進(jìn)行消毒，并用一次性醫(yī)用注射器抽取接種成功的小鼠的淡黃色腹水（即腫瘤液），使用顯微鏡觀察腹水狀態(tài)并以細(xì)胞計(jì)算板進(jìn)行計(jì)數(shù);采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活性（保證其活性在95%以上），然后用4 ℃無菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，再按0.2 mL/只皮下接種于正常小鼠右前肢腋部，常規(guī)飼養(yǎng)直至出現(xiàn)明顯瘤體為造模成功。

2.1.2 H22荷瘤小鼠腹水瘤模型的建立 取出凍存好的H22肝癌細(xì)胞株復(fù)蘇后，以RPMI 1640培養(yǎng)基重懸為5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取小鼠，按“2.1.1”項(xiàng)下方法接種并抽取淡黃色腹水（即腫瘤液）;同法調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，再按0.2 mL/只接種于正常小鼠腹腔，常規(guī)飼養(yǎng)直至其腹腔明顯變大、腹水飽滿為造模成功。

2.1.3 分組與給藥 分別取按“2.1.1”“2.1.2”項(xiàng)下方法成功復(fù)制H22實(shí)體瘤和腹水瘤模型的荷瘤小鼠各50只，均隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組（羥基喜樹堿6? ?mg/kg，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[22]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果）和石蒜堿低、中、高劑量組（石蒜堿10、20、40 mg/kg，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[22]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果），每組10只。陰性對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水0.2 mL，各給藥組小鼠腹腔注射相應(yīng)藥液[均以磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）配制，下同]0.2 mL，每天1次，連續(xù)給藥7天。實(shí)驗(yàn)期間所有小鼠均正常攝食、飲水。

2.1.4 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠抑瘤作用的檢測(cè) 使用實(shí)體瘤小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。末次給藥24 h后，稱定小鼠體質(zhì)量，以頸椎脫臼法將其處死并以仰臥位固定，于胸部消毒后，在其右前肢腋窩處將瘤體剝離;稱定瘤體質(zhì)量，并計(jì)算石蒜堿抑瘤率：抑瘤率=（陰性對(duì)照組平均瘤體質(zhì)量-給藥組平均瘤體質(zhì)量）/陰性對(duì)照組平均瘤體質(zhì)量×100%。

2.1.5 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠生存時(shí)間影響的檢測(cè) 使用腹水瘤小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。末次給藥后，記錄各組小鼠的平均生存時(shí)間，觀察時(shí)間設(shè)定為30天（若小鼠生存超過此時(shí)間，則按30天進(jìn)行計(jì)算）[23]，計(jì)算小鼠生命延長率：生命延長率=（給藥組平均生存天數(shù)-陰性對(duì)照組平均生存天數(shù)）/陰性對(duì)照組平均生存天數(shù)×100%。

2.1.6 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞早期凋亡影響的檢測(cè) 使用腹水瘤小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。（1）腫瘤細(xì)胞收集：于末次給藥次日（于處死前），用注射器于小鼠腹腔中抽取腹水1 mL，以2 000 r/min離心10 min后，棄去上層清液;沉淀用0.85%NH4Cl溶液洗滌3次，然后再用生理鹽水洗滌3次，再以2 000 r/min離心10 min，棄去上層清液，即得腫瘤細(xì)胞，待用。（2）細(xì)胞早期凋亡率檢測(cè)：將上述H22荷瘤小鼠的腫瘤細(xì)胞用PBS吹打并清洗1次，以2 000 r/min離心5 min，棄去上層清液，沉淀用-20 ℃的70%乙醇重懸后于4 ℃固定24 h;隨后，以2 000 r/min離心10 min，棄去上層清液，沉淀（即腫瘤細(xì)胞）避光加入PI染液800 μL，輕輕吹打、混勻，于室溫下避光孵育30 min，濾過，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的早期凋亡率。

2.2 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞線粒體膜功能影響的研究

2.2.1 分組與給藥 取接種成功的腹水瘤模型小鼠50只，按“2.1.1”項(xiàng)下方法分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組（羥基喜樹堿，6 mg/kg）和石蒜堿低、中、高劑量組（10、20、40 mg/kg），每組10只;同時(shí)取10只不荷瘤的正常小鼠作為正常對(duì)照組。陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水0.2 mL，各給藥組腹腔注射相應(yīng)藥液0.2 mL，每天1次，連續(xù)給藥7天。實(shí)驗(yàn)期間所有小鼠均正常攝食飲水。

2.2.2 細(xì)胞收集 （1）腫瘤細(xì)胞：方法同“2.1.6（1）”項(xiàng)。（2）正常小鼠肝細(xì)胞：取正常對(duì)照組小鼠肝組織適量并切成小塊，用PBS清洗后放入試管中，加入胰酶于37 ℃消化15 min，用小牛血清中止消化，濾過，將消化后的組織液以2 000 r/min反復(fù)離心2 min×3次，收集沉淀，加入0.85%NH4Cl溶液1 mL以破除血細(xì)胞，再以1 500 r/min離心5 min，收集沉淀，即得正常小鼠肝細(xì)胞，待用。

2.2.3 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞線粒體膜通透性影響的檢測(cè) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法收集正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞和其余各組小鼠腫瘤細(xì)胞適量，用Reagent A溶液混勻，以2 000 r/min離心10 min，棄去上層清液，沉淀加入Calcein AM染料避光染色20 min，以1 000 r/min離心10 min，棄去上層清液，沉淀（即受試細(xì)胞）用Reagent A溶液清洗后，再加入該溶液500 μL，吹打并混勻。精確吸取該細(xì)胞混懸液100 μL，采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，以檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度（即FI值）來反映細(xì)胞的粒體膜通透性，F(xiàn)I值越大則其線粒體膜通透性越低。

2.2.4 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位變化影響的檢測(cè) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法收集正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞和其余各組小鼠腫瘤細(xì)胞適量，用PBS吹打并清洗1次，避光加入Rhodamine 123染料，避光孵育30 min，以2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀（即受試細(xì)胞）經(jīng)PBS清洗2次后，用PBS 400 μL重懸，并使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，以檢測(cè)到的FI值來反映細(xì)胞的線粒體膜電位，F(xiàn)I值越大則其線粒體膜電位越高。

2.2.5 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白活性影響的檢測(cè) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法收集正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞和其余各組小鼠腫瘤細(xì)胞適量，用PBS吹打并清洗1次，以2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀加入裂解液適量，于冰浴中裂解15 min;于4 ℃下以16 000 r/min離心15 min，取上層清液，使用比色法以酶標(biāo)儀檢測(cè)Caspase-3蛋白的活性（嚴(yán)格按相應(yīng)試劑盒說明書操作）。

2.2.6 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響的檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)。按“2.2.2”項(xiàng)下方法收集正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞和其余各組小鼠腫瘤細(xì)胞適量，用PBS清洗1次，徹底吸棄PBS溶液后，加入裂解液適量，于冰浴中裂解15 min，再于4 ℃下以16 000 r/min離心15 min，取上層清液置于-80 ℃條件下保存，待用。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定該上層清液中的蛋白含量后，加入適量SDS-PAGE上樣緩沖液，于100 ℃變性5 min。取變性后的蛋白樣品適量，行15% SDS-PAGE。電泳后轉(zhuǎn)膜，以脫脂奶粉封閉2 h，然后加入Bcl-2、Bax、Cyc-C、Caspase-9、β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 200），于4 ℃下孵育過夜;依次用TBST溶液、TBS溶液在室溫下洗滌10 min×2次、10 min×1次后，加入相應(yīng)二抗（稀釋度為1 ∶ 500），室溫孵育2 h;依次用TBST溶液、TBS溶液在室溫下洗滌10 min×2次、10 min×1次，以AP-NBT/BICT顯色液顯色，再置于凝膠成像系統(tǒng)上成像。使用Image G v2.8.7軟件分析，以Cyc-C、Caspase-9蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示上述蛋白的表達(dá)水平，并記錄Bcl-2/Bax的灰度值比值。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠瘤體質(zhì)量的影響

與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和石蒜堿各劑量組小鼠的瘤體質(zhì)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且石蒜堿各劑量組小鼠的瘤體質(zhì)量有隨劑量增加而降低的趨勢(shì);各給藥組的抑瘤率分別為39.41%、23.36%、36.50%、56.93%，詳見表1。

3.2 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠生存時(shí)間的影響

與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和石蒜堿各劑量組小鼠的生存時(shí)間均顯著延長（P<0.05或P<0.01），且石蒜堿各劑量組小鼠的生存時(shí)間有隨劑量增加而延長的趨勢(shì);各給藥組小鼠的生命延長率分別為49.23%、29.09%、50.19%、69.08%，詳見表1。

3.3 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞早期凋亡的影響

與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和石蒜堿各劑量組小鼠腫瘤細(xì)胞的早期凋亡率均顯著升高（P<0.01），且石蒜堿各劑量組小鼠腫瘤細(xì)胞的早期凋亡率有隨劑量增加而升高的趨勢(shì)，詳見圖1、表2。

3.4 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞線粒體膜通透性的影響

與正常對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞FI值顯著升高（P<0.01），提示其線粒體膜通透性明顯減弱;與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和石蒜堿各劑量組小鼠腫瘤細(xì)胞FI值均顯著降低，且顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05），同時(shí)石蒜堿各劑量組小鼠腫瘤細(xì)胞的FI值有隨劑量增加而降低的趨勢(shì)，提示線粒體膜通透性均不同程度地增強(qiáng)，詳見圖2、表3。

3.5 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的影響

與正常對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞FI值顯著升高（P<0.01），提示其線粒體膜電位明顯升高;與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和石蒜堿各劑量組小鼠腫瘤細(xì)胞FI值均顯著降低，且顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01），同時(shí)石蒜堿各劑量組小鼠的腫瘤細(xì)胞FI值有隨劑量增加而降低的趨勢(shì)，提示線粒體膜電位不同程度地降低，詳見圖3、表3。

3.6 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白活性的影響

與正常對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白的活性顯著增強(qiáng)（P<0.01）;與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和石蒜堿各劑量組小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白的活性均顯著增強(qiáng)，且顯著強(qiáng)于正常對(duì)照組（P<0.01），同時(shí)石蒜堿各劑量組小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白活性有隨劑量增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)，詳見表4。

3.7 石蒜堿對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值和Cyt-C、Caspase-9蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和石蒜堿各劑量組小鼠的腫瘤細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值和Cyt-C、Caspase-9蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，Cyt-C、Caspase-9蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，且顯著低于或高于正常對(duì)照組（P<0.01），同時(shí)石蒜堿各劑量組小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值和Cyt-C、Caspase-9的蛋白表達(dá)水平有隨劑量增加而降低或升高的趨勢(shì)，詳見圖4、表5。

4 討論

石蒜堿具有很高的藥用價(jià)值，但由于對(duì)該化合物抗腫瘤作用的研究起步較晚且不夠深入[3]，導(dǎo)致其抗腫瘤作用機(jī)制尚未完全闡明。因此，為了明確石蒜堿抗腫瘤作用機(jī)制，充分發(fā)揮其抗腫瘤藥用價(jià)值，本研究以肝癌細(xì)胞H22荷瘤模型小鼠為對(duì)象，對(duì)石蒜堿的體內(nèi)抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。此外，羥基喜樹堿作為市售抗腫瘤藥物，抗腫瘤機(jī)制明確[24-25]，加之其與石蒜堿同為生物堿，均為五環(huán)結(jié)構(gòu)，分子量接近，因此本研究將其選作陽性對(duì)照藥物。

首先，本研究為驗(yàn)證石蒜堿能否抑制小鼠瘤體增長而采用了實(shí)體瘤小鼠模型，擬通過觀察瘤體的質(zhì)量變化來計(jì)算石蒜堿抑瘤率;同時(shí)，為證實(shí)石蒜堿能否有效延長小鼠生存時(shí)間并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而采用了腹水瘤小鼠模型，以便能快速、簡便地從小鼠體內(nèi)取出腫瘤細(xì)胞。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中，線粒體是首個(gè)發(fā)生變化的細(xì)胞器：在細(xì)胞凋亡初期，線粒體形態(tài)會(huì)發(fā)生改變;而當(dāng)抗腫瘤藥物刺激細(xì)胞線粒體時(shí)，位于線粒體內(nèi)外膜中間的MPTP被打開，使得線粒體膜內(nèi)外滲透壓發(fā)生改變、膜電位降低，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)流導(dǎo)致線粒體體積增加、外膜破裂，從而進(jìn)一步促進(jìn)線粒體內(nèi)膜與外膜之間的凋亡相關(guān)因子釋放，這些誘導(dǎo)因子可以直接破壞細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)，激活Caspase家族蛋白，最終啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序;此外有研究指出，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位一旦發(fā)生異常，即使排除與細(xì)胞凋亡有關(guān)的所有誘導(dǎo)因素，細(xì)胞依然會(huì)發(fā)生凋亡，并且這種凋亡是不可逆轉(zhuǎn)的，可見線粒體膜電位一旦降低，細(xì)胞必然會(huì)不可逆轉(zhuǎn)地發(fā)生凋亡[26-29]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量的石蒜堿作用后，各藥物組H22荷瘤小鼠的瘤體質(zhì)量顯著降低、生存時(shí)間顯著延長、早期凋亡率顯著升高，石蒜堿低、中、高劑量組的抑瘤率有隨劑量增加而升高的趨勢(shì);同時(shí)，各給藥組荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞的線粒體膜通透性均顯著增強(qiáng)，而線粒體膜電位均顯著降低，且均有劑量依賴性趨勢(shì)，提示石蒜堿能增加腫瘤細(xì)胞線粒體膜的通透性和降低其膜電位，破壞線粒體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

有研究指出，線粒體膜電位的產(chǎn)生主要與線粒體膜內(nèi)外質(zhì)子分布不對(duì)稱有關(guān)，抗腫瘤藥物刺激線粒體膜，導(dǎo)致MPTP開放，促使線粒體膜電位降低，線粒體膜內(nèi)外凋亡誘導(dǎo)因子等就會(huì)排放或流入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，這些因子就會(huì)激活Caspase家族，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[30-32]?；诖耍狙芯繉?duì)凋亡啟動(dòng)蛋白Caspase-3活性以及凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-9蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，各藥物組小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白的活性和Cyt-C、Caspase-9蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，Bcl-2/Bax比值均顯著降低，提示石蒜堿能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外膜間的凋亡調(diào)控蛋白Cyt-C釋放，并與Caspase-9蛋白發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。

綜上所述，石蒜堿在H22荷瘤小鼠體內(nèi)具有抗腫瘤作用;其能通過破壞腫瘤細(xì)胞線粒體膜結(jié)構(gòu)功能，導(dǎo)致線粒體內(nèi)促細(xì)胞凋亡因子的釋放，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，最終發(fā)揮抗腫瘤作用。但本研究只對(duì)線粒體膜通透性以及膜電位等指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，而未分析線粒體膜損傷的超微結(jié)構(gòu)以及線粒體損傷后的功能變化，有待后續(xù)研究進(jìn)一步深入探索，以便更全面系統(tǒng)地闡釋石蒜堿基于線粒體損傷途徑的抗腫瘤機(jī)制。

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（收稿日期：2020-08-18 修回日期：2021-01-04）

（編輯：張?jiān)拢?/p>