UPLC法測定芭蕉藥材不同部位中羽扇豆酮和豆甾醇的含量

吳紅梅 孔娟 黃旭龍 楊小松 王祥培

摘 要 目的：建立檢測同植株芭蕉根莖、莖和葉中羽扇豆酮和豆甾醇含量的方法，并為尋找芭蕉根莖有效成分的替代資源提供依據(jù)。方法：采用超高效液相色譜（UPLC）法進(jìn)行測定，色譜柱為Zorbax Rrhd Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為乙腈-甲醇（78.5 ∶ 21.5，V/V），檢測波長為210 nm，流速為0.15 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。對9批同植株芭蕉根莖、莖和葉中羽扇豆酮和豆甾醇的含量測定結(jié)果進(jìn)行組間差異性分析、主成分分析和聚類分析。結(jié)果：羽扇豆酮和豆甾醇的質(zhì)量濃度分別在11.16～357.10、8.83～160.40 ?g/mL范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系（R2分別為0.999 2、0.999 1）;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗的RSD均小于3%;平均加樣回收率分別為101.44%、98.32%，RSD分別為1.77%、1.81%（n=6）。芭蕉莖中羽扇豆酮和豆甾醇的平均含量顯著高于根莖和葉（P<0.05）;同植株芭蕉根莖與葉中羽扇豆酮和豆甾醇的含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。主成分分析結(jié)果表明，同植株芭蕉根莖、莖、葉中羽扇豆酮和豆甾醇的含量具有差異。聚類分析將芭蕉根莖、莖和葉分為3大類，其中以芭蕉莖與其余2個部位的差異較明顯。結(jié)論：該方法簡單、快捷、專屬性強、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，可用于芭蕉藥材不同部位中羽扇豆酮和豆甾醇的含量測定;芭蕉莖可替代芭蕉根莖作為羽扇豆酮和豆甾醇的原藥材來源。

關(guān)鍵詞 芭蕉;藥材部位;超高效液相色譜法;含量測定;主成分分析;聚類分析

中圖分類號 R284.1;R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）05-0542-05

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for determining the contents of lupenone and stigmasterol in the rhizome， stem and leaf of Mosa basjoo from the same plant， and to provide reference for the substitute resource for the effective components of M. basjoo.? METHODS： UPLC method was adopted. The determination was performed on Zorbax Rrhd Eclipse Plus C18 column （100 mm×2.1 mm， 1.8 μm） with mobile phase consisted of acetonitrile-methanol （78.5 ∶ 21.5， V/V）. The detection wavelength was set at 210 nm; the flow rate was 0.15 mL/min; the column temperature was 30 ℃ and the sample size was 1 μL. The results of content determination of lupinone and stigmasterol in the rhizome， stem and leaf of 9 batches of M. basjoo from the same plant were analyzed by the methods of comparative analysis between groups， principal component analysis and cluster analysis. RESULTS： The mass concentration of lupenone and stigmasterol had a good linear relationship with the corresponding peak area within the range of 11.16-357.10 and 8.83-160.40 g/mL（R2 were 0.999 2 and 0.999 1， respectively）. RSDs of precision， repeatability and stability tests were all less than 3%. The average recovery rates of lupenone and stigmasterol were 101.44% and 98.32%， and the RSDs were 1.77% and 1.81% （n=6）， respectively. The average contents of lupenone and stigmasterol in stems of M. Basjoo were significantly higher than those of rhizome and leaves of M. basjoo （P<0.05） . There was no statistical significance in the contents of lupenone and stigmasterol between stem and leaf of M. basjoo from same plant （P>0.05）. Results of principal component analysis showed that the contents of lupanone and stigmasterol were different in rhizome， stem and leaf of M. basjoo from the same plant. Rhizome， stem and leaf of M. basjoo were divided into three types through cluster analysis， among which the rhizome had significant difference with the other two parts. CONCLUSIONS： The method is simple， rapid， specific， reproducible and accurate. It can be used for the content determination of lupenone and stigmasterol in different parts of M. basjoo. The stem of M. basjoo can replace the rhizome of M. basjoo as the source of lupinone and stigmasterol.

KEYWORDS Mosa basjoo; Medicinal part; UPLC; Content determination; Principal component analysis; Cluster analysis

芭蕉根為芭蕉科植物芭蕉Musa basjoo Sied. et Zucc.的干燥根莖，是貴州苗族地區(qū)習(xí)用苗藥，收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，具有清熱解毒、止渴利尿的功效[1]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，芭蕉根具有抑制α-葡萄糖苷酶、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理活性[2-3]。芭蕉根中含有多糖類、皂苷類、黃酮類、香豆素類、蒽醌類、酚類、強心苷等化學(xué)成分[4-6]。其中，五環(huán)三萜類成分羽扇豆酮具有降血糖、抗炎以及改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用[7-9];甾體類成分豆甾醇具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降低膽固醇等藥理作用[10]。芭蕉根中的活性成分羽扇豆酮和豆甾醇主要是由其根莖部位分離提取而得[11]，但芭蕉根莖被采挖后，植株便不可再生，而其地上部位的莖和葉多被丟棄，不僅污染環(huán)境，還造成了資源浪費[12]。因此，探究芭蕉莖和葉能否替代根莖作為羽扇豆酮和豆甾醇的原藥材來源，既有利于保護藥材資源，又可以減輕環(huán)境污染?；诖耍狙芯坎捎贸咝б合嗌V（UPLC）法檢測同植株芭蕉根莖、莖和葉中羽扇豆酮和豆甾醇的含量，并進(jìn)行組間比較分析、主成分分析和聚類分析，以期為芭蕉的莖、葉能否替代其根莖作為羽扇豆酮和豆甾醇的原藥材來源提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所使用的的主要儀器有：Waters ACQUITY型UPLC儀、光電二極管矩陣（PDA）檢測器（美國Waters公司），AL204-IC型分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，DZF-0型真空干燥箱（上海賀德實驗設(shè)備有限公司），HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司），HS-10260T型超聲波清洗儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 主要試劑

本研究所使用的主要試劑有：羽扇豆酮對照品（貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥物分析實驗室自制，純度≥98%），豆甾醇對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號D-042-161216，純度≥98%），甲醇、乙腈（德國Merck公司，均為色譜純）;水為屈臣氏蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

本課題組在貴州、福建兩地采挖了9批芭蕉藥材，經(jīng)貴州民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院王祥培教授鑒定均為芭蕉科植物芭蕉M. basjoo Sied. et Zucc.。分別取其根莖、莖和葉，切碎、曬干、打粉、過四號篩、密封，得27份樣本（編號及來源見表1，表中①②表示同一來源不同批次藥材）;將樣本置于陰涼干燥處保存，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Zorbax Rrhd Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為乙腈-甲醇（78.5 ∶ 21.5，V/V），檢測波長為210 nm，流速為0.15 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取芭蕉的根莖、莖和葉粉末各約1.0 g，精密稱定，分別置于錐形瓶中，加入50 mL甲醇，超聲（功率260 W，頻率40 kHz）提取2次，每次30 min;用濾紙濾過，合并2次濾液，置于蒸發(fā)皿中，水浴加熱揮干后，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.2.2 混合對照品溶液 取羽扇豆酮和豆甾醇對照品各適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為598、461 ?g/mL的混合對照品母液;取混合對照品母液適量，加入甲醇稀釋，配制成每1 mL含羽扇豆酮119.6 ?g、豆甾醇92.2 ?g的混合對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液（即甲醇）各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖 1。由圖1可知，芭蕉根莖、莖、葉中羽扇豆酮和谷甾醇與各自相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于6 000，且陰性對照無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品母液適量，以甲醇稀釋并制成羽扇豆酮質(zhì)量濃度分別為11.16、22.32、38.72、89.26、178.50、357.10 ?g/mL和豆甾醇質(zhì)量濃度分別為8.83、13.64、27.28、54.56、109.20、160.40 ?g/mL的系列混合對照品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、對照品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液1 μL注入色譜儀，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，羽扇豆酮和豆甾醇峰面積的RSD分別為0.93%、2.40%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 稱取樣品粉末（編號S16）適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，羽扇豆酮和豆甾醇峰面積的RSD分別為1.50%、1.67%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 稱取樣品粉末（編號S16）適量，精密稱定，平行6份，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量。結(jié)果，羽扇豆酮和豆甾醇含量的RSD分別為1.43%、2.08%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品粉末（編號S16）約0.5 g，精密稱定，平行6份，置于圓底燒瓶中，加入適量的混合對照品溶液，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算羽扇豆酮和豆甾醇的加樣回收率，結(jié)果見表3。由表3可知，羽扇豆酮和豆甾醇的平均加樣回收率分別為101.44%、98.32%，RSD分別為1.77%、1.81%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 芭蕉根莖、莖和葉中羽扇豆酮和豆甾醇的含量測定

取9批芭蕉藥材的27份根莖、莖和葉粉末各適量，平行3份，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算羽扇豆酮和豆甾醇的含量，結(jié)果見表4。

由表4可知，貴州省天柱縣清浪村①（編號S2）、貞豐縣①（編號S5）、金沙縣①（編號S8）、金沙縣②（編號S11）、天柱縣清浪村②（編號S14）、貞豐縣②（編號S20）和福建省長泰縣②（編號S26）所產(chǎn)7批芭蕉藥材莖中的羽扇豆酮含量均高于同植株的根莖和葉，剩余2批芭蕉藥材莖[貴州省貴陽市南明區(qū)（編號S17）和福建省長泰縣①（編號S23）]中的羽扇豆酮含量低于同植株的根莖，但高于同植株的葉。

貴州省貞豐縣①（編號S5）、金沙縣①（編號S8）、金沙縣②（編號S11）、天柱縣清浪村②（編號S14）、貴陽市南明區(qū)（編號S17）、貞豐縣②（編號S20）和福建省長泰縣②（編號S26）所產(chǎn)7批芭蕉藥材莖中的豆甾醇含量均高于同植株的根莖和葉;貴州省天柱縣清浪村①（編號S2）所產(chǎn)芭蕉藥材莖中的豆甾醇含量低于同植株的根莖和葉;福建省長泰縣①（編號S23）中的豆甾醇含量低于同植株的根莖，但高于同植株的葉。綜上所述，同植株芭蕉藥材中，莖中羽扇豆酮和豆甾醇的含量大多較其根莖和葉中的含量高。

2.5 芭蕉藥材不同部位中羽扇豆酮和豆甾醇含量的差異性分析

采用SPSS 20.0軟件對9批同植株芭蕉不同部位中羽扇豆酮和豆甾醇的含量進(jìn)行差異性分析，組間比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，與同植株芭蕉莖中羽扇豆酮和豆甾醇的含量比較，根莖和葉中2種成分的含量均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;同植株芭蕉根莖與葉中2種成分的含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。該結(jié)果提示芭蕉根莖、莖、葉中羽扇豆酮和豆甾醇含量具有一定的差異。不同部位芭蕉藥材中羽扇豆酮和豆甾醇含量的多重比較結(jié)果見表5。

此外，經(jīng)計算，羽扇豆酮和豆甾醇在芭蕉根莖中的平均含量分別為908.89、680.51 ?g/g，在芭蕉莖中的平均含量分別為1 845.09、1 076.49 ?g/g，在芭蕉葉中的平均含量分別為447.88、545.51 ?g/g，表明芭蕉莖中2種成分的平均含量均高于根莖和葉。

2.6 主成分分析

為了進(jìn)一步綜合分析芭蕉同植株不同部位中羽扇豆酮和豆甾醇含量的差異性，本研究對9批芭蕉藥材的根莖、莖和葉中上述2種成分含量進(jìn)行了主成分分析。將標(biāo)準(zhǔn)化處理后的樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件中，得到2個特征主成分PC1、PC2。從方差累計貢獻(xiàn)率來看，建立的模型累計解釋能力參數(shù)R2X和預(yù)測能力參數(shù)Q2分別為0.999、0.998，說明該模型的區(qū)分能力和預(yù)測能力都較好，所以前2個主成分已基本能反映芭蕉根莖、莖和葉中2種成分含量的主要特征。

以主成分建立坐標(biāo)系，得到9批芭蕉藥材根莖、莖和葉的主成分得分圖（圖2）、載荷圖（圖3）。由圖2、圖3可知，主成分得分圖的4個象限可以將樣品明顯區(qū)分開;載荷圖中芭蕉藥材中羽扇豆酮和豆甾醇的分布情況與得分圖中樣本點的分布和位置對應(yīng)[13]。結(jié)果表明，同植株芭蕉根莖、莖、葉中羽扇豆酮和豆甾醇含量具有一定的差異。

2.7 聚類分析

采用Ward聚類法對“2.5”項下提取的主成分進(jìn)行聚類分析，得到芭蕉同植株不同部位的分類情況，詳見圖4。由圖4可知，同植株不同部位的芭蕉藥材聚為3大類，其中S16（根莖）、S26（莖）、S14（莖）、S17（莖）、S8（莖）、S5（莖）、S11（莖）聚為Ⅰ類;S19（根莖）、S20（莖）、S21（葉）、S15（葉）、S18（葉）聚為Ⅱ類;S24（葉）、S6（葉）、S12（葉）、S22（根莖）、S3（葉）、S4（根莖）、S13（根莖）、S25（根莖）、S1（根莖）、S27（葉）、S2（莖）、S10（根莖）、S9（葉）、S7（根莖）、S23（莖）聚為Ⅲ類。聚類結(jié)果表明，第Ⅰ類大多為芭蕉莖部位，第Ⅱ、Ⅲ類中均有芭蕉根莖、莖和葉部位，因此芭蕉莖與其余2個部位的差異較明顯。

3 討論

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆酮具有抗炎和抗糖尿病等多種生物活性[4，8，14];豆甾醇是一種植物甾醇，具有多種生物學(xué)活性，尤其在抗腫瘤、抗炎和抗糖尿病等方面具有潛在的藥用價值[15-16]。中藥及民族藥的成分復(fù)雜，單一成分無法達(dá)到全面控制藥材質(zhì)量的目的，因此本研究建立了快速、高效且能同時檢測芭蕉藥材中羽扇豆酮和豆甾醇含量的HPLC方法，旨在為評價芭蕉藥材的質(zhì)量提供參考。

在色譜條件的考察中，筆者比較了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙腈、甲醇-乙腈-水不同比例的流動相，以及0.1、0.15、0.2 mL/min的流速對試驗結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-甲醇（78.5 ∶ 21.5，V/V）作為流動相、流速為0.15 mL/min時，羽扇豆酮和豆甾醇的峰形、分離度均較佳。同時，筆者采用全波長掃描發(fā)現(xiàn)，羽扇豆酮和豆甾醇在210 nm波長處均有最大吸收，故選擇210 nm作為檢測波長。此外，筆者還考察了25、30、35 ℃的柱溫對試驗結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30 ℃時，上述2種成分的分離度較好。綜合考慮色譜峰的分離度、基線、峰形和分析時間，最終選出了本研究的色譜條件。

由9批不同產(chǎn)地芭蕉藥材不同部位（根莖、莖、葉）共27份樣品中羽扇豆酮和豆甾醇的含量測定結(jié)果可知，同植株芭蕉藥材莖中上述2種成分的含量大多較其根莖和葉中含量高。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，芭蕉根莖、莖和葉中羽扇豆酮和豆甾醇的含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;主成分分析結(jié)果表明，同植株芭蕉根莖、莖和葉中上述2種成分的含量具有差異;聚類分析將芭蕉根莖、莖和葉分為3大類，其中以芭蕉莖與其余2個部位的差異較明顯。導(dǎo)致這一差異的原因可能與植物的遺傳以及體內(nèi)代謝成分的積累、分布、儲藏等因素相關(guān)[17-18]。

綜上所述，本文所建的UPLC法簡單、快捷、專屬性強、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，可用于芭蕉藥材不同部位中羽扇豆酮和豆甾醇的含量測定;芭蕉莖可替代芭蕉根莖作為羽扇豆酮和豆甾醇的原藥材來源。

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（收稿日期：2020-09-24 修回日期：2021-01-04）

（編輯：胡曉霖）