釀酒酵母鉻離子抗性及富集作用初步研究

周建琴 祝宗英 孫婉悅 蔡佳鑫 才卓瑪 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學院藥學院

一、前言

（一）鉻的生物化學功能

許多研究表明，鉻的生物化學功能主要是作為胰島素的加強劑作用。Schwarz 和Mertz[1]首先觀察到鉻在糖代謝中的作用。從啤酒酵母中分離的生物活性鉻制劑和合成的生物活性鉻配合物，兩者都能降低糖尿病小鼠的血漿葡萄糖和甘油三酯[2]。

（二）富鉻酵母的研究意義

無機鉻形式不利于人體吸收，而有機鉻則能促進對鉻的吸收。富鉻酵母是最普遍的一種補鉻形式。制備富鉻酵母的常用酵母菌種是啤酒酵母（又稱釀酒酵母）[3]。啤酒酵母是一種安全可靠、它是不需要做毒性試驗即可直接食用的少數(shù)幾種菌種之一；啤酒酵母是發(fā)酵工藝成熟，生產(chǎn)周期短，便于生產(chǎn)控制；啤酒酵母是目前作為微量元素載體最優(yōu)勢的菌種；此外，啤酒酵母還富含其它人體所必須的營養(yǎng)素，用它來制備富鉻酵母，除具有補給鉻的功效外，還兼具補給氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的作用。因此，選用啤酒酵母作為鉻的補給載體意義顯著。富鉻酵母一般是通過在酵母培養(yǎng)基中加入無機鉻鹽（如KCr（SO4）2）的方法來制備的[4]：酵母在高濃度鉻環(huán)境中吸收并同化無機鉻化合物，之后轉(zhuǎn)化為有機鉻富集在酵母細胞中。

本研究涉及抗鉻離子較強的酵母菌株的篩選，以此為出發(fā)菌經(jīng)活化，抗性篩選擴大培養(yǎng)，分析了在不同鉻濃度，培養(yǎng)時間，對鉻富集的影響以及抗鉻菌株最佳吸收條件及有機鉻含量和分布，為制備富鉻酵母和利用工業(yè)化廢酵母治理鉻污染奠定了基礎。

二、材料

（一）試劑

酵母提取物，葡萄糖，蛋白胨，麥芽，濃HNO3，HClO4，KCr（SO4）2。

（二）培養(yǎng)基

（1）YEPD 培養(yǎng)基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，加蒸餾水至1L，加入20 克瓊脂，pH6.0，115℃濕熱滅菌15min，冷藏備用。

（2）麥芽汁培養(yǎng)基：取適量干麥芽，將其磨碎，一份麥芽加四份水，在65℃水浴鍋中糖化3～4h，糖化程度用碘法判斷之。將糖化液用4～6 層紗布過濾，濾液攪拌煮沸后再過濾。將濾液稀釋到5～6 波美度，pH 約6.4，加入2%瓊脂，115℃濕熱滅菌15min。

（三）主要儀器及設備

電子天平，單人雙面凈化工作臺，DNH-D 冷凍恒溫振蕩器皿，5804 離心機，血球記數(shù)板，研缽，顯微鏡，TAS-986 原子吸收分光光度計。

（四）酵母菌株

本實驗中所用的10 株啤酒酵母株來源由江蘇食品藥品學院研究院和啤酒車間提供。

三、方法

（一）KCr（SO4）2 母液配制

稱取50 克KCr（SO4）2水溶后，移至100mL 容量瓶中，定容至刻度，121℃滅菌15min，常溫下保存待用。

（二）鉻離子抗性酵母的篩選

（1）菌株的復蘇，活化

①將菌株原種接5ml 試管斜面活化一次（3 支，28℃，36-48h）

②從三支試管中選出一支生長良好的接種至5ml 麥汁試管活化第二次（3 支，28℃48h）

③從三支麥汁試管中選出一支生長良好的平板劃線（3 支，28℃，72h）

④挑選形態(tài)較好的單菌落，接種5ml 液體YEPD 培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)36h，作為涂布平板的種子酵母

（2）不同種酵母耐金屬鉻篩選

制備鉻離子濃度分別為0.05mg/ml，0.10mg/ml，0.15 mg/ml，0.2 mg/ml，0.25mg/ml 的固體培養(yǎng)基50ml，待冷卻到50℃用微量可調(diào)移液器吸取100μl 麥芽汁培養(yǎng)基，滴入50ml 錐形瓶中，搖勻，澆注平板，28℃恒溫培養(yǎng)，48h 后觀察不同來源酵母菌株的培養(yǎng)情況，從中篩選鉻離子抗性較好的酵母菌株。

（3）鉻離子抗性菌株的馴化

將篩選到的抗性酵母菌株接入5ml 含鉻0.25mg/ml 的YEPD 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，放入恒溫調(diào)節(jié)搖瓶柜中馴化培養(yǎng)，溫度28℃，36h，澆注鉻離子濃度分別為0.05mg/ml，0.10mg/ml，0.15 mg/ml，0.20 mg/ml，0.25mg/ml 的平板，篩選抗性克隆。

（三）酵母的擴大培養(yǎng)

活化后挑選生長健壯、飽滿的單細胞菌落3～4 個分別接到試管斜面上培養(yǎng)（優(yōu)選3～4 個斜面，28℃培養(yǎng)48h）；選擇一個生長良好的斜面接種到25 支麥芽汁試管中進行28℃培養(yǎng)36～48h，生長到細胞濃度為1×107個/ml，按10%的接種量分別接入含KCr（SO4）2量 為0.05mg/ml，0.10mg/ml，0.15mg/ml，0.20 mg/ml，0.25mg/ml 的 麥 汁 培 養(yǎng) 基500ml 三角瓶5 到6 只，28℃震蕩培養(yǎng)96h。

表1 培養(yǎng)后鉻含量的分布狀況

（四）酵母細胞數(shù)的測定

在生長到第12h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h 取樣，測定酵母的細胞數(shù)。無菌條件下各吸取1ml 發(fā)酵液，滴20μl 于細胞記數(shù)板上，在顯微鏡下統(tǒng)計細胞數(shù)，每樣做5 次，取平均數(shù)M。然后根據(jù)公式：細胞濃度=M*50（個/ml）獲得發(fā)酵液中的細胞濃度。

（五）干酵母粉的制備

將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液分裝到50 ml 的離心管，5000rmp 離心10 分鐘，收集沉淀，用100ml 蒸餾水5000rmp 離心10 分鐘，重復洗滌3 次。將酵母細胞沉淀放置在烘箱內(nèi)105℃，熱風烘干7-8 小時，稱重后在密閉玻璃瓶內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

（六）發(fā)酵液中和酵母粉中鉻含量的測定

將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液分裝到50 ml 的離心管，5000rmp 離心10min，取1mL 上清液測定其中的鉻含量。

稱取1g 酵母粉用研缽研碎，100mL 燒杯中，加入20 mL 濃HNO3，10mLHClO4，在燒杯上蓋一個表面皿，在恒溫電板上加熱至120℃加熱1 小時，升溫到180℃加熱2小時，在加熱到200℃至冒白煙，消化液呈無色透明即可，冷卻，將消化液轉(zhuǎn)移至100或250mL 容量瓶中，并用蒸餾水多次洗滌燒杯，定容至刻度，即為富鉻酵母粉樣品溶液，原子吸收光譜法測定其中的鉻含量[5]。

四、結(jié)果

（一）不同來源酵母菌株對鉻離子抗性結(jié)果

不同來源酵母菌株在不同的鉻離子濃度的平板上培養(yǎng)，結(jié)果：鉻離子濃度在0.05mg/ml 和0.10umg/ml 時，10 株菌株都能生長，單菌落生長飽滿，且形態(tài)比較明顯。在鉻濃度為0.15mg/ml 時，除淮藥11 和食品2B，其余8 株受到鉻的抑制作用，菌體不能生長。而鉻濃度為0.20mg/ml 時，除食品2B 能生長外，其余9 株都不能生長，當鉻濃度為0.25mg/ml 時，10 株酵母菌株都不能正常生長，結(jié)果說明酵母菌株食品2B 具有較好的抗鉻離子能力，因此我們選食品2B 為出發(fā)菌，繼續(xù)研究。

（二）菌種馴化條件對酵母產(chǎn)量及富鉻能力的影響

將經(jīng)馴化的上2B 與未馴化的上2B 克隆分別接種培養(yǎng)，比較它們的酵母產(chǎn)量和富鉻的量，結(jié)果表明馴化后酵母產(chǎn)量為0.63g/500ml，未馴化的酵母產(chǎn)量為0.53g/500ml，增加不明顯，但是鉻離子的富集量明顯增加，未馴化的鉻富集量為158.1 ug/ml增加，馴化后增加為238.5 ug/ml。

（三）培養(yǎng)時間和不同鉻離子濃度對酵母生長的影響

將篩選到的酵母菌株上2B 鉻離子抗性克隆分別接種到濃度為0.20mg/ml 和0.25mg/ml 鉻離子的培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，跟蹤檢測酵母細胞數(shù)。結(jié)果表明發(fā)酵液中的酵母細胞數(shù)目隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增加，培養(yǎng)48h 后，發(fā)酵液中酵母細胞數(shù)由于絮凝作用急劇減少。酵母細胞數(shù)隨發(fā)酵時間的增長而急劇增加，到48h 時達到為7×107個細胞/mL。當鉻濃度達到0.25mg/ml 濃度時，酵母細胞數(shù)增長明顯緩慢，到48h 時達到最高，約為4.0×107個細胞/mL，表明較高濃度的鉻離子對酵母細胞的生長具有抑制作用。

（四）干酵母產(chǎn)量測定

將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液離心，取酵母，洗滌、干燥，稱取干酵母的重量，結(jié)果：隨著培養(yǎng)基中鉻濃度的增加，由于鉻的抑制作用而酵母干重會有所下降。在鉻濃度為0.05mg/mL 時，每500mL 培養(yǎng)基中干酵母重最大，為1.25g。鉻濃度為0.10mg/mL時，酵母干重為1.02g，隨著鉻離子濃度的增加，酵母干重減小但是在濃度0.10mg/mL到0.20mg/mL 之間減小幅度不大，當鉻離子濃度為0.25mg/ml 時，酵母干重小至0.41g，表明鉻離子濃度增加到一定濃度時會導致干酵母得率的下降很快。故綜合考慮鉻離子濃度對酵母的抗性和富集情況選擇培養(yǎng)酵母時添加鉻離子合適濃度為0.20mg/mL。

（五）發(fā)酵液中鉻的富集情況

分別對發(fā)酵液上清液，干酵母處理液以及酵母洗滌液樣品中的三價鉻離子進行原子吸收光譜分析，結(jié)果如表1 所示。

從表1 中可以看出三價鉻的分布狀況，培養(yǎng)基中的鉻一部分存留在發(fā)酵上清液中，一部分被菌株酵母所吸收，轉(zhuǎn)化為有機鉻。另外一部分由于絮凝作用，離心后存在于沉淀物中。酵母細胞對鉻離子的吸收量隨培養(yǎng)基中鉻離子濃度的增加而增加，但是并是成比例，表明酵母細胞對重金屬離子的刺激具有緩沖作用，多數(shù)鉻離子隨著酵母的絮凝而沉淀，沉淀量隨鉻離子濃度增加而增加。

五、討論

我們通過鉻離子抗性的篩選，得到一株對鉻離子抗性較好的酵母菌株，并通過一系列的實驗得出了酵母細胞數(shù)，干酵母重，以及鉻在培養(yǎng)基，發(fā)酵上清液，酵母細胞等中的含量分布，最后通過原子吸收光譜對鉻離子進行分析，結(jié)果表明培養(yǎng)基中的鉻離子最終會因酵母的吸收和酵母的絮凝而減少。各項實驗的結(jié)果酵母對鉻離子的最大吸收量為0.24mg/g，絮凝對鉻離子的最大沉淀量為0.26mg/g。這些數(shù)據(jù)為開發(fā)富鉻酵母的健康應用和處理環(huán)境中鉻污染問題提供了重要的科學依據(jù)。