青藤堿調(diào)控CUMS抑郁大鼠突觸可塑性及其對(duì)Notch和mTOR信號(hào)通路的影響*

王志堅(jiān)， 王曉敏， 劉勝兵， 郭燕君， 潘巍巍， 沈忠飛

（嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興314000）

抑郁癥是一種多因素導(dǎo)致的復(fù)雜的精神疾病，主要表現(xiàn)為思維認(rèn)知障礙、情緒低迷和自殺傾向等，全球約11%的人患有抑郁癥，給患者、家人和社會(huì)造成了巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重阻礙了社會(huì)的發(fā)展。大量研究表明，抑郁癥是一種炎癥性疾病[1]，炎癥因子在抑郁癥的發(fā)病進(jìn)程中起到重要作用，已成為抑郁癥的重要治療靶點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)家大力支持中醫(yī)藥發(fā)展，尤其是在此次新冠肺炎疫情的預(yù)防和治療中，中醫(yī)藥表現(xiàn)出良好的效果，開(kāi)發(fā)新的中醫(yī)藥抗抑郁藥物是一項(xiàng)響應(yīng)國(guó)家號(hào)召的緊迫任務(wù)。

青藤堿（sinomenine，Sin），是一種來(lái)源于中草藥防己科植物青藤的生物堿，臨床上廣泛用于系膜增生性腎炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療[2]，另外Sin 還有抗腫瘤、細(xì)胞保護(hù)、免疫抑制和抗炎作用[3]。近年來(lái)研究表明，Sin 對(duì)神經(jīng)疾病具有一定的作用，可通過(guò)提高腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達(dá)緩解抑郁癥狀[4]，亦能通過(guò)抑制神經(jīng)炎癥減輕大鼠腦缺血再灌注損傷[5]，但其對(duì)抑郁癥炎癥反應(yīng)影響的研究比較少。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示，30、50 和100 mg·kg-1·d-1的Sin 均能夠緩解慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁大鼠的抑郁癥狀，減輕炎癥反應(yīng)，且在30 mg·kg-1·d-1的低劑量灌胃處理就有著較好的效果，但對(duì)突觸可塑性、細(xì)胞凋亡、Notch 信號(hào)通路、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路等的影響尚不明確。本研究旨在探討Sin 對(duì)CUMS抑郁大鼠突觸可塑性的影響及可能的分子機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性清潔級(jí)7 周齡SD 大鼠120 只，體重180～210 g，從浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買，許可證號(hào)為SYXK（浙）2018-0016。

1.2 試劑和主要儀器 兔抗Bcl-2、cleaved caspase-3（C-C3）、β-actin、BDNF、Notch1、Hes1、Jagged1、mTOR、磷 酸 化mTOR（phosphorylated mTOR，pmTOR）、真核細(xì)胞翻譯起始因子4E 結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4EBP1）和磷酸化4EBP1（phosphorylated 4EBP1，p-4EBP1）抗體及山羊抗兔Ⅱ抗（Cell Signaling Technology）；氟西?。╢luoxetine，F(xiàn)luo；禮來(lái)制藥有限公司）；Sin（Sigma）；高爾基染色試劑盒（FD Neuro Technologies）。熒光定量PCR 儀（AFD4800）；凝膠電泳儀（Bio-Rad）；動(dòng)物行為自動(dòng)跟蹤系統(tǒng)EthoVision 3.0（Noldus）；其他試劑來(lái)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 分組和建模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對(duì)照（control，Ctrl）組、CUMS 組、Fluo 組和Sin 組（n=30），均單籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：12 h 光照/12 h 黑暗（光照時(shí)間：早7 點(diǎn)到晚7 點(diǎn)），濕度（55±5）%，溫度（22±2）℃，自由進(jìn)食進(jìn)水。對(duì)照組正常飼養(yǎng)，其余3組采用孤養(yǎng)法并結(jié)合CUMS 建立CUMS 抑郁模型[6]，按表1，每天給予一種刺激，其中連續(xù)2 天的刺激不相同，合計(jì)刺激28 d。

2.2 給藥 連續(xù)刺激2 周后，將Fluo 和Sin 溶于生理鹽水中，開(kāi)始對(duì)Fluo 組和Sin 組大鼠分別給予Fluo（20 mg·kg-1·d-1）[6]和Sin（30 mg·kg-1·d-1）[5]灌胃治療，Ctrl 組和CUMS 組均灌胃相同體積的生理鹽水。連續(xù)灌胃2周時(shí)間。

2.3 行為學(xué)測(cè)試 （1）體重：建模結(jié)束后分別稱量各組大鼠體重，記錄并制作柱狀圖。（2）糖水測(cè)試：建模結(jié)束后，事先給與各組大鼠2 瓶1%糖水，進(jìn)行適應(yīng)訓(xùn)練；禁水12 h 后，準(zhǔn)備2 瓶水，重量相同，分別編號(hào)A 和B，A 為1%糖水，B 為平時(shí)喝的水，1 h 后稱量記錄A 和B 重量。糖水偏好（%）=A 減少克數(shù)/（A+B減少克數(shù)）×100%。（3）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：建模后，根據(jù)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)步驟[7]，記錄分析各組大鼠在格子里面的移動(dòng)總距離和中央活動(dòng)時(shí)間，每只大鼠測(cè)試前均應(yīng)清理干凈曠場(chǎng)區(qū)域，以免產(chǎn)生干擾。（4）強(qiáng)迫游泳：參照文獻(xiàn)進(jìn)行[5]，記錄大鼠游泳6 min 中后4 min 的不動(dòng)時(shí)間，即頭部不能進(jìn)入水中，直立姿勢(shì)漂浮的時(shí)間。

表1 溫和刺激名稱及刺激時(shí)間Table 1. The name of each mild stimulus and stimulating time

2.4 RNA 提取及qPCR 大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，冰上撥出海馬組織，液氮中研磨并加入Trizol 試劑，按照說(shuō)明書(shū)步驟提取組織中的總RNA。計(jì)算RNA 濃度并用Fermentas 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行qPCR[7]，并根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算出各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列Table 2. Sequences of the primers

2.5 蛋白質(zhì)提取及Western blot 參照文獻(xiàn)[6]，大鼠麻醉后斷頭取腦，迅速分離海馬組織后放-80℃冰箱備用。冰箱取出后加入液氮和裂解液，于研缽中研磨裂解，經(jīng)4℃離心，取上清液測(cè)定蛋白濃度（BCA 試劑盒），定量后煮沸變性，配膠上樣（30 μg總蛋白）進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，用5%的脫脂奶粉封閉1 h 后，4℃冰箱過(guò)夜孵育Ⅰ抗（BDNF、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2、C-C3、p-mTOR、mTOR、p-4EBP1、4EBP1 和β-actin），用PBST 緩沖液洗滌各條帶（每次5 min，共3 次），室溫孵育Ⅱ抗2 h，用PBST緩沖液洗滌各條帶（每次5 min/次，共3 次），加入發(fā)光劑顯影定影，條帶掃描后用ImageJ 測(cè)算目的蛋白的灰度值[8]。

2.7 高爾基染色 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠后，迅速處死取腦，經(jīng)PBS 緩沖液洗滌后放入等體積的A 液和B 液混合液中，6 h 后更換一次新鮮的A液B 液混合液，連續(xù)浸泡14 d 后，取出腦組織放入C液（避光），24 h 后更換新鮮C 液并在4℃冰箱避光保存3 d。冰箱取出腦組織沉入甘油（15%）和蔗糖（20%）混合液中24 h，用冰凍切片機(jī)進(jìn)行常規(guī)切片（100 μm），貼在載玻片上，經(jīng)過(guò)不同梯度（50%、75%、95%和100%）的乙醇脫水和二甲苯透明后，用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察，選擇典型CA1區(qū)神經(jīng)元并拍照，用ImageJ 軟件分析由胞體發(fā)出的樹(shù)突上第一個(gè)樹(shù)突分支，即二級(jí)樹(shù)突上（長(zhǎng)度30～60 μm）的樹(shù)突棘數(shù)量，計(jì)算10 μm 的平均樹(shù)突棘數(shù)量，即得到樹(shù)突棘密度[8]。

2.8 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 將大鼠麻醉處死，取出腦組織進(jìn)行固定透明并石蠟包埋，在石蠟切片機(jī)上切片后經(jīng)過(guò)二甲苯和不同濃度的乙醇進(jìn)行脫蠟，進(jìn)行常規(guī)HE 染色，然后再經(jīng)過(guò)不同濃度的乙醇脫水和二甲苯透明后，用中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察[8]。

2.9 ELISA 實(shí)驗(yàn) 取各組大鼠海馬部稱重勻漿離心取上清液，按照ELISA 試劑盒（碧云天）步驟檢測(cè)海馬中白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量[5]，單位為μg/（g tissue）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraghPad Prism 8 和SPSS 17 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組之間采用單因素方差分析，用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Sin作用后體重、糖水偏好和行為學(xué)指標(biāo)的變化

如圖1 所示，與Ctrl 組相比，CUMS 組大鼠體重和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中央不動(dòng)時(shí)間顯著減少，糖水偏好和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總距離顯著下降，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增加；而Sin作用后，體重、移動(dòng)總距離和中間停留時(shí)間均顯著增加，強(qiáng)迫游泳中的不動(dòng)時(shí)間顯著降低，糖水偏好顯著增加（P＜0.05）。

Figure 1. The changes of body weight，sucrose preference and behavioral indicators in the 4 groups. A：body weight；B：sucrose preference；C：total distance；D：open-field test；E：forced swimming. Mean±SD. n=30. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.圖1 4組大鼠之間體重、糖水?dāng)z取及行為學(xué)指標(biāo)的變化

2 Sin 作用后海馬結(jié)構(gòu)完整，樹(shù)突棘密度升高，突觸相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)

與Ctrl 組相比，CUMS 組海馬區(qū)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，多數(shù)細(xì)胞變性萎縮（圖2A）；樹(shù)突棘密度下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2B；突觸重塑相關(guān)蛋白BDNF 在蛋白和mRNA 水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖2C、D。Sin 作用后，海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)為圓形較規(guī)則，細(xì)胞核清晰（圖2A）；樹(shù)突棘密度顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2B；BDNF 表達(dá)在蛋白和mRNA 水平均顯著上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖2C、D。

3 Sin 作用后海馬Notch 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)

Western blot 結(jié)果顯示，與Ctrl 組相比，CUMS 組Notch1、Hes1和Jagged1表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；Sin作用后，Notch1、Hes1 和Jagged1 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖3A。qPCR 結(jié)果與Western 結(jié)果一致，見(jiàn)圖3B。

4 Sin作用后海馬Bcl-2表達(dá)上調(diào)，C-C3表達(dá)下調(diào)

如圖4 所示，與Ctrl 組相比，CUMS 組抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），凋亡蛋白caspase-3活化形式C-C3 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；Sin 作用后，Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），C-C3表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。我們同時(shí)用qPCR 檢測(cè)Bcl-2 和caspase-3 的mRNA 水 平，結(jié) 果 與Western blot 結(jié) 果一致。

5 Sin 作用后海馬mTOR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)

如圖5 所示，與Ctrl 組相比，CUMS 組mTOR 和下游靶基因4EBP1磷酸化水平顯著降低；Sin處理后p-mTOR和p-4EBP1均顯著上調(diào)（P＜0.05）。

6 Sin作用后海馬炎癥反應(yīng)降低

ELISA 結(jié)果顯示，與Ctrl 組相比，CUMS 組大鼠海 馬 組 織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 顯 著 上 調(diào)（P＜0.05）；Sin 處理后，IL-1β 和TNF-α 顯著下調(diào)（P＜0.05），而IL-6無(wú)顯著變化（P＞0.05），見(jiàn)圖6。

討論

抑郁癥嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量，成為一個(gè)不可忽視的社會(huì)問(wèn)題。CUMS法建立抑郁模型，能夠有效模擬抑郁癥狀且癥狀穩(wěn)定，被廣泛用于抑郁癥治療相關(guān)研究。根據(jù)文獻(xiàn)建立CUMS 模型[6，9]，建模28 d 后，CUMS 組體重、糖水偏好、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總距離和中間停留時(shí)間均顯著降低，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯增加，這與文獻(xiàn)結(jié)果一致，說(shuō)明抑郁模型建立是成功的。Sin 灌胃處理后，上述抑郁癥狀均明顯減輕，說(shuō)明Sin 具有一定的抗抑郁作用，可能是潛在的治療抑郁癥的藥物。

Figure 2. The changes of hippocampal structure，dendritic spine density and BDNF expression in Sin-treated CUMS rats. A：HE staining of hippocampal structure（scale bar=100 μm）；B：Golgi staining of secondary dendrites and dendritic spines（scale bar=20 μm）；C，D：the expression of BDNF at protein and mRNA levels. Mean±SD，n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.圖2 Sin作用后大鼠海馬結(jié)構(gòu)、樹(shù)突棘密度和突觸重塑相關(guān)蛋白BDNF的變化

Figure 3. The changes of Notch signaling proteins Notch1，Hes1 and Jagged1 in Sin-treated CUMS rats. A：Western blot results；B：qPCR results. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.圖3 Sin作用后Notch信號(hào)通路蛋白Notch1、Hes1和Jagged1表達(dá)的變化

Figure 4. The changes of apoptosis-related proteins Bcl-2 and cleaved caspase-3（C-C3）in Sin-treated CUMS rats. A：Western blot results；B：qPCR results. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.圖4 Sin作用后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和C-C3的變化

Figure 5. The phosphorylation levels of mTOR and 4EBP1 in Sin-treated CUMS rats. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.圖5 Sin作用后mTOR和4EBP1磷酸化水平的變化

Figure 6. The changes of IL-1β，IL-6 and TNF-α in Sin-treated CUMS rats. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.圖6 Sin作用后炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的變化

近年研究表明，抑郁癥發(fā)病與海馬突觸重塑性的改變緊密關(guān)聯(lián)。抑郁發(fā)生后，海馬突觸重塑相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，伴隨神經(jīng)元的萎縮以及突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變，而氟西汀等抗抑藥物治療后海馬突觸可塑性得到明顯改善[10]。重度抑郁患者海馬區(qū)椎體細(xì)胞體積變小，并伴隨突觸蛋白表達(dá)下調(diào)。突觸重塑包括結(jié)構(gòu)和功能重塑，海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性、樹(shù)突棘密度的改變直接影響著樹(shù)突的功能[11]。此外，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子維持神經(jīng)元生存、生長(zhǎng)和微環(huán)境，并參與大腦學(xué)習(xí)和記憶[12]，對(duì)突觸重塑起著重要的調(diào)節(jié)作用，其中最重要的營(yíng)養(yǎng)因子是BDNF，在海馬和大腦皮層等豐富表達(dá)[13]，抑郁發(fā)生時(shí)，BDNF表達(dá)減少，甚至發(fā)生基因缺陷，無(wú)法正常表達(dá)。長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）是重要的功能突觸可塑性，必須依賴BDNF 才能實(shí)現(xiàn)，因此BDNF 是重要的突觸可塑性相關(guān)蛋白[20]。本實(shí)驗(yàn)中Sin處理后，抑郁大鼠海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)為圓形較規(guī)則，細(xì)胞核清晰，樹(shù)突棘密度顯著升高，BDNF 表達(dá)在蛋白和mRNA 水平均顯著上調(diào)，說(shuō)明Sin 作用后海馬突觸可塑性明顯上調(diào)。

Notch 信號(hào)通路進(jìn)化上十分保守，主要由受體、配體和下游靶分子等組成，Notch1、Jagged1 和Hes1分別是重要的受體、配體和下游靶分子，在腦內(nèi)尤其海馬組織中高表達(dá)。有研究表明，糖氧剝奪和腦缺血后，大鼠體內(nèi)Notch 信號(hào)通路被激活，體內(nèi)阻斷Notch 通路，腦部多巴胺神經(jīng)元減少，多巴胺分泌驟減直接引起一系列精神病癥狀，與腦缺血損傷、阿爾茲海默癥和抑郁等多種神經(jīng)疾病發(fā)生有關(guān)[14]。Notch 信號(hào)通路在突觸重塑、學(xué)習(xí)、記憶的調(diào)控中具有非常重要的作用[15]。本研究中，Sin 處理后，抑郁大鼠海馬組織Notch1、Jagged1 和Hes1 表達(dá)均上調(diào)，Notch信號(hào)通路被激活，Sin可能通過(guò)激活Notch信號(hào)通路蛋白的表達(dá)改善海馬突觸可塑性。

抑郁發(fā)生時(shí)伴隨著較高的凋亡水平，5-HT 再攝取抑制劑氟西汀，通過(guò)上調(diào)突觸體多唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子的表達(dá)調(diào)節(jié)突觸可塑性，且凋亡水平顯著下調(diào)[16]；柴胡皂苷也通過(guò)降低海馬細(xì)胞凋亡水平緩解大鼠抑郁癥狀[17]。這說(shuō)明細(xì)胞凋亡是重要的致病因素和治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中Sin作用后，抑郁大鼠抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)上調(diào)，C-C3 表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明凋亡水平顯著降低，Sin可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡緩解大鼠抑郁癥狀。

研究表明，mTOR 通過(guò)磷化下游靶分子4EBP1調(diào)控海馬部突觸重塑相關(guān)蛋白的表達(dá)，與突觸可塑性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，如內(nèi)穩(wěn)態(tài)突觸可塑性的調(diào)控依賴mTOR 信號(hào)通路[18]，在大鼠內(nèi)嗅-海馬通路中調(diào)節(jié)疼痛相關(guān)突觸可塑性[19]。抗抑郁藥物如氟西汀等通過(guò)上調(diào)p-mTOR 和p-4EBP1 調(diào)控CUMS 突觸重塑相關(guān)蛋白的表達(dá)[6]。本實(shí)驗(yàn)中Sin 處理后，抑郁大鼠pmTOR 和p-4EBP1 均上調(diào)，mTOR 信號(hào)通路被激活，Sin 可能通過(guò)激活mTOR 信號(hào)通路調(diào)控海馬突觸重塑。

研究表明，炎癥因子如IL-6、IL-1β 和TNF-α 參與抑郁的病理發(fā)生過(guò)程[20]，抗抑郁藥作用后，抑郁癥患者血清中炎癥因子恢復(fù)正常水平。炎癥因子通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，維持正常的突觸可塑性以及神經(jīng)代謝，最終影響情緒調(diào)節(jié)[21]。本實(shí)驗(yàn)中Sin 處理后，抑郁大鼠炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平顯著下調(diào)，炎癥反應(yīng)明顯降低，Sin 可能通過(guò)降低炎性反應(yīng)緩解抑郁癥狀，改善突觸可塑性。

綜上所述，Sin 作用后，抑郁大鼠海馬區(qū)炎癥反應(yīng)降低，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路被抑制，海馬結(jié)構(gòu)破壞較小，與突觸重塑相關(guān)的Notch 和mTOR 通路被激活，突觸重塑相關(guān)蛋白BDNF 表達(dá)上調(diào)，突觸結(jié)構(gòu)和突觸可塑性明顯改善，抑郁癥狀緩解。因此，Sin 調(diào)控CUMS 大鼠海馬神經(jīng)突觸可塑性，可能與Notch 和mTOR通路的激活有關(guān)。