抑郁癥小鼠海馬組織差異表達炎癥因子基因篩選及生物信息學分析

邵青，袁東亮，王娜，閻得勝，張曉紅，張輝，權偉

1 西安市精神衛(wèi)生中心，西安710199；2 空軍軍醫(yī)大學；3 空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院

抑郁癥是一組癥狀群，包括情緒及情感紊亂，快感缺乏和精神運動癥狀，其發(fā)生發(fā)展機制復雜，具體分子機制仍不明確。既往對于抑郁癥的機制研究主要涉及下丘腦—垂體—腎上腺軸［1］、神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)［2］、神經(jīng)營養(yǎng)因子［3］、神經(jīng)可塑性過程［4］、神經(jīng)免疫軸［5］及神經(jīng)炎癥趨化因子［6］等。大量研究證實，炎癥紊亂是抑郁癥發(fā)病的免疫學基礎，也是抑郁癥免疫病理的主要特征［7］。越來越多的基礎研究結(jié)果也支持抑郁癥患者存在神經(jīng)炎癥的特征性改變，主要表現(xiàn)為小膠質(zhì)細胞激活，可伴有星形膠質(zhì)細胞激活、趨化因子水平改變等［8］。有研究報道，抑郁癥患者神經(jīng)炎癥與C 反應蛋白（CRP）、白細胞介素（IL）6 等有關［9］，但都缺乏確鑿的證據(jù)。2018 年1 月—2019 年12 月，本研究應用炎癥細胞因子與受體PCR 芯片，觀察小鼠海馬組織中84 個炎癥因子基因的差異表達情況，對差異表達基因進行生物信息學分析，為深入探討抑郁癥發(fā)病的炎癥機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 C57小鼠12只，體質(zhì)量23～25 g，雄性，由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，使用許可證號為SCXK（陜）2014-001，生產(chǎn)許可證號為SCXK（陜）2014-002。PCR 儀（PTC-100）購自MJ公司。雜交爐（G2545A）、芯片掃描儀（G2565BA）購自Agilent 公司。分光光度計（ND1000）購自Nano?drop 公司。TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司。氯仿、異丙醇及乙醇購自上海化學試劑有限公司。無RNA酶的水/糖原購自Ambion公司。

1.2 抑郁癥模型制作及海馬組織獲取 將12 只小鼠分為對照組和抑郁癥組，每組6 只。抑郁癥組參照ADZIC 等［12］的方法，通過慢性不可預知溫和應激模型（CUMS）制備小鼠抑郁癥模型，配合孤養(yǎng)。應激處理的多變性及不可預測性是模型制備成功的關鍵。對照組不造模。造模結(jié)束后，將兩組小鼠麻醉，斷頭取腦，剝開新鮮的腦膜后立即獲取皮層和海馬組織，用鑷子直接夾取海馬核團，放入液氮保存。

1.3 海馬組織中炎癥因子基因檢測及差異表達基因篩選 海馬組織勻漿，勻漿后加入TRIzol 試劑提取RNA。DNase Ⅰ消化RNA 樣品，去除其中可能含有的基因組DNA，對RNA進行純度和質(zhì)量檢測。隨后進行cDNA 合成及實時定量PCR 反應。檢測84個炎癥因子基因（見表1），得到原始基因表達數(shù)據(jù)集。采用GeneSpring GX11.5.1 軟件分析基因芯片數(shù)據(jù)，獲取兩樣本信號強度比值（Cy3/Cy5，Ratio），將Ratio＞2 或＜0.5 作為有表達差異，＞2 為表達下調(diào)、＜0.5為表達上調(diào)。Volcano Plot 篩選差異表達基因，以log2|Fold Change|＞2 及校正P＜0.05 者作為差異表達基因。

1.4 差異表達炎癥因子基因的生物信息學分析基于KEGG 數(shù)據(jù)庫和Reactom 數(shù)據(jù)庫，使用Topp?gene（https：//toppgene.cchmc.org/）在線工具對差異基因進行聯(lián)合通路富集分析；基于GO 數(shù)據(jù)庫，使用R 軟件包clusterProfiler3.8.1 對差異表達基因進行GO生物過程（GO-BP）的富集分析，在結(jié)果篩選時使用BH 校正并篩選錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR），以FDR＜0.05的富集功能項作為最后結(jié)果。

1.5 目標差異表達基因篩選 通過對GO-BP 分析及KEGG 通路分析結(jié)果進行交集，篩選目標差異表達基因。

表1 待檢小鼠炎癥因子基因種類

2 結(jié)果

2.1 兩組炎癥因子基因表達情況 與對照組相比，抑郁癥組中差異表達的細胞因子基因有6 個，表達上調(diào)的3個基因分別為CXCL5、BMP2、IL10RA，表達下調(diào)的3個基因分別為CCL12、IL5、IL1A。

2.2 GO-BP分析結(jié)果 GO-BP分析結(jié)果顯示，差異表達基因主要參與白細胞遷移、白細胞趨化性及免疫系統(tǒng)過程等生物過程的調(diào)控。見表2。

表2 差異表達基因GO-BP富集分析結(jié)果

2.3 KEGG通路分析結(jié)果 KEGG通路分析結(jié)果顯示，差異表達基因主要參與細胞因子與細胞因子受體相互作用通路、趨化因子信號轉(zhuǎn)導通路及IL-17信號轉(zhuǎn)導通路等信號通路。見表3。

表3 差異表達基因KEGG通路分析結(jié)果

2.4 目標差異表達基因篩選結(jié)果 通過對GO-BP分析及KEGG 通路分析結(jié)果進行交集，篩選出4 個目標差異表達基因，為CXCL5、BMP2、IL1A、CCL12基因（倍數(shù)變化分別為2.68、2.21、0.47、0.36）。

3 討論

傳統(tǒng)觀念認為，由于血腦屏障的存在，中樞神經(jīng)系統(tǒng)通常被視為“免疫豁免區(qū)”，但這一觀念在逐漸改變，因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也可出現(xiàn)炎癥介質(zhì)水平增高［10］。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥假說在抑郁癥病理機制中具有重要作用［11］。上述觀點亦通過腦影像學技術如正電子發(fā)射體層攝影（PET）得到驗證［12］。抑郁癥為炎癥因子紊亂，即促炎因子和抑制炎癥的因子都可能增加，這一特點與其他炎癥性疾病有所不同［13］。對抑郁癥神經(jīng)炎癥的相關分子機制進行研究，有助于為未來開展抑郁癥的免疫靶向治療提供參考。

本研究采用的QIAGEN PCR 芯片具有兩個特點［14］：一是免除引物設計合成和PCR 條件的摸索，二是無需檢索文獻或前期的實驗驗證。小鼠炎癥因子與受體芯片包含84 個炎癥因子相關基因。涵蓋了趨化因子及其受體基因、IL 及其受體基因等。基因芯片結(jié)果顯示，抑郁癥組與對照組相比，表達差異的炎癥因子基因有6個，表達上調(diào)和下調(diào)的基因各3個。在抑郁癥的發(fā)病過程中有多個炎癥相關過程參與，它們涉及到白細胞遷移、白細胞趨化性及免疫系統(tǒng)等生物過程，也涉及細胞因子與細胞因子受體相互作用通路、趨化因子信號轉(zhuǎn)導通路及IL-17信號轉(zhuǎn)導通路等。這些結(jié)果再次證實了抑郁癥中多個炎癥相關基因改變的多樣性［15］。本研究共篩選出4個目標差異表達基因，分別為CXCL5、BMP2、IL1A、CCL12基因。推測它們與抑郁癥的炎癥作用機制高度相關，是引起本實驗中小鼠抑郁癥的主要差異靶基因，但具體調(diào)控機制還需進一步研究。

在4 個目標基因中，CXCL5 基因表達差異最為明顯。CXCL5 基因位于4 號染色體q13.3，編碼CX?CL5蛋白［16］。CXCL5為趨化因子CXC家族一員。趨化因子是一類小分子堿性蛋白，主要功能是趨化細胞定向移動。大多數(shù)的趨化因子屬于CC 和CXC 兩個亞族。CXC 亞族有17 個成員（CXCL1-17），CXC亞族主要作用于中性粒細胞，這個亞族中比較重要的趨化因子有IL-8（CXCL8）、γ干擾素誘生的單核因子（Mig/CXCL9）、γ 干擾素誘生蛋白10（IP-10/CX?CL10）、基質(zhì)細胞來源因子1（SDF-1/CXCL12）等［17］。CXCL5 主要表達于中性粒細胞、單核細胞，也能表達于嗜酸性粒細胞。中性粒細胞是先天性免疫監(jiān)視的重要組成部分，同時在炎癥導致的病理損傷中發(fā)揮重要作用［18］。有文獻顯示，CXCL5 信號通路與神經(jīng)炎癥及血腦屏障損傷相關，并可導致腦白質(zhì)損傷［19］。另有學者發(fā)現(xiàn)，CXCL5 與創(chuàng)傷性腦損傷［20］、人腦內(nèi)皮屏障破壞［21］等相關。CXCL5 與抑郁癥的關系及其中相關機制還需要進一步驗證。