SBF2-AS1 在食管鱗癌中的表達(dá)變化及其對腫瘤細(xì)胞KYSE410增殖、放療敏感性的影響

李曉敏，查文娟，鐵小偉，李皓，高飛，劉陽晨

蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬泰興市人民醫(yī)院，江蘇泰州225400

食管癌是常見的惡性腫瘤之一［1］。我國食管癌病理類型主要為鱗狀細(xì)胞癌［2］。因食管癌早期癥狀缺乏特異性，且易發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移，大多數(shù)患者確診已為晚期，失去手術(shù)機(jī)會，5 年生存率＜30%。放療是中晚期食管癌的主要治療手段［3］。然而，晚期食管癌患者放療后局部控制不理想或復(fù)發(fā)者占50%～60%［4］。放療抵抗是影響腫瘤治療效果和患者預(yù)后的重要因素。因此，尋找食管癌放療敏感性相關(guān)分子標(biāo)志物，有望提高放療敏感性。研究證實，長鏈非編碼RNA（lncRNA）與多種惡性腫瘤（如非小細(xì)胞肺癌、食管鱗癌、胃癌、鼻咽癌等）的增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移、化療耐藥、放療敏感性等有關(guān)［5-9］。SBF2-AS1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，位于染色體11p15.1，是SBF2的一個2 708 nt的反義RNA［10］。研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中高表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展［11-12］。2019 年10 月—2020 年6 月，本研究觀察了SBF2-AS1在食管鱗癌中的表達(dá)變化及其對食管鱗癌細(xì)胞KYSE410 增殖、放療敏感性的影響，探討可能的作用機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織、細(xì)胞及主要實驗材料 食管鱗癌切除手術(shù)中留取的食管鱗癌組織及其配對的癌旁（距腫瘤組織邊緣＞5 cm）正常組織87例?；颊吣?6 例、女21例，年齡18～70（61.33 ± 7.06）歲，腫瘤直徑≤5 cm 56 例、＞5 cm 31 例，TNM 分期T1～T2期35 例、T3～T4期52 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N0～N156 例，N2～N331 例，分化程度為低分化45 例、中高分化42 例?；颊邽槌踉\，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療，經(jīng)術(shù)后組織病理檢查證實診斷，臨床病理資料和隨訪資料完整。排除合并其他部位惡性腫瘤者，合并嚴(yán)重肝、腎等重要臟器功能不全者。食管鱗癌細(xì)胞KYSE410、食管正常上皮細(xì)胞HEEPIC 由蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬泰興市人民醫(yī)院實驗室凍存。RPMI1640、胎牛血清購自美國Gibco公司。 TRIzol、PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa 公司。siRNA-SBF2-AS1 及引物購自上海生物工程有限公司。Lipofectamine RNA iMAX Reagent 購自美國Invitrogen 公司。CCK-8、EdU、0.1% 結(jié)晶紫、胰蛋白酶、Western blotting 試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自BD Biosciences 公司。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 食管鱗癌組織、細(xì)胞中SBF2-AS1 檢測 采用TRIzol 試劑提取食管鱗癌組織、癌旁正常組織及KYSE410 細(xì) 胞 和HEEPIC 細(xì) 胞 的 總RNA。 按 照PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以GAPDH 作為內(nèi)參照。SBF2-AS1 上游引物序列為5′-CACGACCCAGAAAGAvGTCTAC-3′，下游引 物 序 列 為5′-CCCGGTACCTTCCTGTCATA-3′；GAPDH 上游引物序列為5′-CTGGGCTACACTGAG?CACC-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-AAGTGGTCGTT?GAGGGCAATG-3′。以2－ΔΔCt計算目的基因相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3 下調(diào)SBF2-AS1表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響觀察

1.3.1 細(xì)胞分組 KYSE410 細(xì)胞用含10% 胎牛血清和1% 雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，分為siR?NA-SBF2-AS1 組、NC 組。 使 用Lipofectamine RNA iMAX Reagent分別將siRNA-SBF2-AS1、NC轉(zhuǎn)染siR?NA-SBF2-AS1 組、NC 組細(xì)胞。qRT-PCR 檢測siR?NA-SBF2-AS1組細(xì)胞中SBF2-AS1表達(dá)較NC組顯著下降（分別為0.33 ± 0.02、1.00 ± 0.00）。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8實驗。將siRNA-SBF2-AS1組、NC組的細(xì)胞按2×103/孔接種于96 孔板中，分別于0、24、48、72、96 h 后每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定光密度（OD）值。每組設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值。

1.4 下調(diào)SBF2-AS1表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞放療敏感性的影響觀察

1.4.1 細(xì)胞分組及放療方法 分組及操作參照“1.3.1”。將siRNA-SBF2-AS1 組、NC 組處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×104/孔接種于6 孔板中，貼壁后用4 Gy的X射線照射，6 mV射線，劑量率為300 mU/min，機(jī)架角為180°，SSD源皮距100 cm，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4.2 細(xì)胞增殖能力觀察 采用EdU 實驗。用細(xì)胞培養(yǎng)液1∶500稀釋EdU，37 ℃預(yù)熱5 min；放療處理細(xì)胞后，將6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液留至1 mL，每孔加入稀釋預(yù)熱后的EdU，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄去培養(yǎng)液；按照EdU 試劑盒說明書每孔加入固定液、通透液、洗滌液，棄去洗滌液；每孔加入用PBS 1∶1 000稀釋的Hoechst33342反應(yīng)液，室溫避光孵育10 min，棄去反應(yīng)液，洗滌液洗滌3 次、每次3～5 min；熒光顯微鏡下觀察，有綠色熒光為增殖細(xì)胞。

1.4.3 細(xì)胞凋亡率測算 采用流式細(xì)胞術(shù)。將經(jīng)放療處理后的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 漂洗1 次，胰酶消化細(xì)胞，離心后去上清，PBS 漂洗2 次，收集1×106個細(xì)胞，重懸細(xì)胞于100 μL 結(jié)合緩沖液中，加入An?nexinV-FITC 5 μL 混勻后加入PI 5 μL 混勻，室溫避光孵育20 min，加入結(jié)合緩沖液400 μL 濾過濾網(wǎng)，流氏細(xì)胞儀測算兩組細(xì)胞凋亡率。

1.4.4 放療敏感性評價 采用克隆形成實驗。取siRNA-SBF2-AS1組、NC組細(xì)胞分別以2×102、5×102、1×103、2×103、5×103/孔接種于96 孔板中，給予0、2、4、6、8 Gy 的射線照射，照射條件同“1.4.1”，每組設(shè)置3 個復(fù)孔；繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞10～14 d，待形成肉眼可見的菌落時，棄去培養(yǎng)基，PBS 漂洗2 遍，用90% 乙醇固定細(xì)胞15 min，棄去乙醇，PBS 漂洗2 遍，用0.1% 結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下計數(shù)單克隆數(shù)（≥50 個細(xì)胞計為1 個單克?。?。計算兩組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF）和細(xì)胞克隆形成率（PE）。SF=（受照射組PE/對照組細(xì)胞PE）×100%。PE=（克隆細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。繪制單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線。根據(jù)細(xì)胞存活曲線得出D0（終斜率的倒數(shù)）、Dq（準(zhǔn)閾劑量）、SF2（離體腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)2 Gy照射后的SF），并計算放射增敏比。放射增敏比=si-NC組D0/siRNA-SBF2-AS1組D0。

1.4.5 細(xì)胞中E2F 轉(zhuǎn)錄因子1（E2F1）蛋白檢測采用Western blotting 法。用含有PMSF 的PIPA 裂解液提取siRNA-SBF2-AS1組、NC 組細(xì)胞總蛋白，冰上孵育30 min，4 ℃、12 000 g 離心15 min，取上清液。用BCA 蛋白分析試劑盒進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣品與5×loading buffer混勻，金屬浴100 ℃煮沸5 min。用10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移至聚氟乙烯（PVDF）膜上，封閉2 h，洗滌液洗膜3次。加入稀釋的抗E2F1 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，然后用稀釋的辣根過氧化物標(biāo)記的二抗室溫下孵育2 h。取ECL熒光檢測試劑盒，在暗室中加入適量A 液、B 液的混合液，滴于膜上，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，分析各組E2F1蛋白相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌SBF2-AS1表達(dá)變化及與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 食管鱗癌組織、癌旁正常組織中SBF2-AS1 相對表達(dá)量分別為1.94 ± 1.24、0.95 ±0.64，KYSE410 細(xì)胞、HEEPIC 細(xì)胞中SBF2-AS1 相對表達(dá)量分別為5.18 ± 0.07、1.00 ± 0.00，食管鱗癌組織和細(xì)胞中SBF2-AS1 表達(dá)高于癌旁正常組織和正常食管上皮細(xì)胞（P均＜0.05）。腫瘤直徑＞5 cm者、T3～T4期者SBF2-AS1 相對表達(dá)量分別高于直徑≤5 cm者、T1～T2期者（P均＜0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)的食管鱗癌組織中SBF2-AS1表達(dá)比較（）

表1 不同臨床病理參數(shù)的食管鱗癌組織中SBF2-AS1表達(dá)比較（）

注：與腫瘤直徑＞5 cm者相比，*P＜0.05；與T3～T4期者相比，#P＜0.05。

臨床病理參數(shù)性別n SBF2-AS1男女66 21 2.14 ± 1.12 2.44 ± 1.30年齡（歲）≤60＞60腫瘤直徑≤5 cm＞5 cm TNM分期T1～T2 T3～T4淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0～N1 N2～N3分化程度低分化高分化52 35 2.08 ± 1.07 2.41 ± 1.28 31 56 2.05 ± 1.39*2.31 ± 1.02 35 52 1.73 ± 1.10#2.54 ± 1.10 56 31 2.18 ± 1.19 2.18 ± 1.13 2.29 ± 1.26 2.14 ± 1.06 45 42

2.2 下調(diào)SBF2-AS1 表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響 轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h 后siRNA-SBF2-AS1 組細(xì)胞增殖能力低于NC 組（P均＜0.05）。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染不同時點siRNA-SBF2-AS1組、NC組細(xì)胞增殖能力比較（）

表2 轉(zhuǎn)染不同時點siRNA-SBF2-AS1組、NC組細(xì)胞增殖能力比較（）

注：與同時點NC組相比，*P＜0.05。

組別siRNA-SBF2-AS1組NC組細(xì)胞增殖能力96 h 1.52 ± 0.09*2.27 ± 0.05 0 h 0.21 ± 0.00*0.21 ± 0.00 24 h 0.51 ± 0.09*1.04 ± 0.06 48 h 1.00 ± 0.09*1.63 ± 0.07 72 h 1.36 ± 0.06*1.96 ± 0.05

2.3 下調(diào)SBF2-AS1表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞放療敏感性的影響 不同X 線照射條件的siRNA-SBF2-AS1組細(xì)胞增殖率、E2F1蛋白表達(dá)均低于NC 組，細(xì)胞凋亡率高于NC 組；照射后細(xì)胞增殖率和E2F1 蛋白表達(dá)低于未照射細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率高于未照射細(xì)胞（P均＜0.05）。詳見表3。siRNA-SBF2-AS1 組細(xì)胞D0、Dq、SF2低于NC 組（P均＜0.05），單擊多靶模型參數(shù)值計算其放射增敏比為2.00 ± 0.10。見表4。

表3 siRNA-SBF2-AS1組、NC組不同X線照射條件下細(xì)胞增殖率、凋亡率及E2F1蛋白表達(dá)比較（）

表3 siRNA-SBF2-AS1組、NC組不同X線照射條件下細(xì)胞增殖率、凋亡率及E2F1蛋白表達(dá)比較（）

注：與相同條件NC 組相比，*P＜0.05；與同組未照射細(xì)胞相比，#P＜0.05。

組別細(xì)胞增殖率（%）細(xì)胞凋亡率（%）E2F1蛋白表達(dá)siRNA-SBF2-AS1組照射未照射NC組照射未照射26.67 ± 0.56*#35.13 ± 1.09*15.88 ± 0.61*#11.79 ± 0.31*0.37 ± 0.02*#0.57± 0.00*0.59 ± 0.00#0.91 ± 0.01 42.35 ± 0.80#52.72 ± 0.54 8.74 ± 0.34#6.59 ± 0.53

表4 siRNA-SBF2-AS1組、NC組單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線參數(shù)比較（）

表4 siRNA-SBF2-AS1組、NC組單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線參數(shù)比較（）

注：與NC組相比，*P＜0.05。

組別siRNA-SBF2-AS1組NC組SF2 0.59 ± 0.09*0.72 ± 0.18 D0 Dq 0.58 ± 0.02*1.17 ± 0.10 1.24 ± 0.05*2.55 ± 0.12

3 討論

盡管近年來食管癌的診斷和治療方法已有所改進(jìn)，但晚期食管癌患者的生存率仍然很低［13］。食管癌的診治是目前研究的難點和熱點。探索食管癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因及可能的機(jī)制有助于為食管癌的診治提供新的方向。

lncRNA 表達(dá)失調(diào)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。SBF2-AS1 已被證實在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能是作為“ceRNA”靶向調(diào)控下游靶點，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。如SBF2-AS1 可通過競爭性抑制miR-30a 來靶向調(diào)節(jié)叉頭框蛋白家族成員A1表達(dá)，促進(jìn)骨肉瘤的增殖、侵襲和遷移，發(fā)揮促癌作用［14］。SBF2-AS1 可競爭性集合miR-140-5p 靶向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β 受體1 從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲［15］。研究證實，SBF2-AS1在食管鱗癌細(xì)胞ECA109 中高表達(dá)；沉默SBF2-AS1 后，細(xì)胞的增殖能力、集落形成能力、侵襲和遷移能力均顯著受到抑制［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，SBF2-AS1在食管癌組織和細(xì)胞中顯著高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期有關(guān)，與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度無關(guān)；下調(diào)SBF2-AS1 表達(dá)后，KYSE410 細(xì)胞的增殖能力顯著受到抑制，表明SBF2-AS1在食管癌中發(fā)揮促癌作用。

放療是上段食管癌及中晚期食管癌的主要治療手段。隨著放療技術(shù)的不斷發(fā)展，食管癌放療療效不斷提高，但由于腫瘤遺傳特性改變、惡性腫瘤組織對放療的敏感性差異及周圍正常組織對放射劑量耐受性限制等因素，影響放療效果，導(dǎo)致腫瘤局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移［17］。因此，探索影響腫瘤細(xì)胞放射抵抗的分子機(jī)制，改善腫瘤的放療敏感性，可為改善食管癌的治療效果及預(yù)后提供幫助。

大量研究證實，lncRNA 可調(diào)控食管癌放療敏感性。沉默Rpph1 可增加食管癌細(xì)胞的放療敏感性［18］。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本2 可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的放療抵抗［19］。最近有研究表明，SBF2-AS1可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的放療耐受，下調(diào)SBF2-AS1 可通過抑制miR-302a/MBNL3 axis 軸增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放療敏感性［20］，但在其他腫瘤中未見報道。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)SBF2-AS1 表達(dá)后，KYSE410 細(xì)胞的增殖能力下降，給予X 線照射后的細(xì)胞增殖率和存活分?jǐn)?shù)下降、凋亡率和放射增敏比增高，提示下調(diào)SBF2-AS1表達(dá)可增加食管癌細(xì)胞的放療敏感性，與SBF2-AS1在其他惡性腫瘤中的相關(guān)研究結(jié)果一致。

E2F1 是E2F 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，其可通過調(diào)控多種lncRNA 參與細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等多項生物學(xué)過程［21-23］。有研究證實，在宮頸癌中下調(diào)E2F1的表達(dá)，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率增加，其高表達(dá)與放療敏感性降低及預(yù)后不良有關(guān)［24］。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中E2F1 可誘導(dǎo)SBF2-AS1 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［25］。本研究結(jié)果顯示，對SBF2-AS1表達(dá)下調(diào)的食管鱗癌細(xì)胞進(jìn)行X 線照射后，細(xì)胞增殖抑制，細(xì)胞凋亡增多，E2F1 蛋白表達(dá)水平降低。

綜上所述，SBF2-AS1 在食管癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)；下調(diào)SBF2-AS1 表達(dá)可抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖，提高放療敏感性，其機(jī)制可能與調(diào)控E2F1 蛋白表達(dá)有關(guān)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。