雷公藤紅素對前脂肪細(xì)胞3T3-L1 成脂分化的抑制作用及其機(jī)制

劉旭，楊勝榮，王希敏

天津市南開醫(yī)院，天津300010

2 型糖尿?。═2DM）發(fā)病率呈逐年升高趨勢，我國目前有超過1 億的成年糖尿病患者［1］。90% 以上的T2DM 患者均存在胰島素抵抗（IR），同時(shí)伴或不伴有胰島素相對分泌不足。發(fā)生IR的T2DM患者體內(nèi)正常胰島素濃度的生物學(xué)效應(yīng)低于正常，究其原因是胰島素靶組織對胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低。臨床治療糖尿病大多立足于改善胰島素敏感性。肥胖是IR 發(fā)生的最主要因素［2］。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）、過氧化物酶體增殖物激活受體g2（PPARg2）和脂肪酸蛋白4（FABP4）是脂肪生成相關(guān)蛋白，這些蛋白表達(dá)增加可以明顯增強(qiáng)脂肪細(xì)胞的成脂分化。在脂肪細(xì)胞中，胰島素通過磷酸化胰島素受體來激活胰島素受體底物（IRS），磷酸化的IRS 結(jié)合磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的調(diào)節(jié)亞基p85，進(jìn)而激活催化亞基p110 來活化絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）信號(hào)通路，刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，促進(jìn)各個(gè)組織的葡萄糖攝取及利用［3-4］。雷公藤紅素來源于中藥雷公藤根皮，是一種具有多種天然活性的醌甲基三萜，是雷公藤片和雷公藤多苷片等制劑的有效成分之一。雷公藤紅素已用于多種疾病的治療，其藥理作用除了抗炎、抗腫瘤外，還有抗糖尿病和肥胖的作用［5-11］。在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖鼠模型中，雷公藤紅素能夠減少鼠進(jìn)食量，增加能量消耗，發(fā)揮強(qiáng)效減輕體質(zhì)量效果。但雷公藤紅素與脂肪分化之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。2018年10月—2019年11月，本研究以前脂肪細(xì)胞3T3-L1為模型，觀察了雷公藤紅素對成脂分化的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 前脂肪細(xì)胞3T3-L1 接種于含10% FBS、200 U/mL 青霉素、200 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，放于37 ℃、5% CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雷公藤紅素購自上海詩丹德生物公司，純度＞98%。FBS 和DMEM 培養(yǎng)基購自美國HyClone公司。CCK-8 試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。TRIzol 購自美國Invitrogen 公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購于北京全式金生物公司。PCR引物購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。C/EBPα 抗體、FABP4 抗體、PPARg2 抗體、PTPN11 抗體均購于美國Proteintech 公司。HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗購自三箭生物技術(shù)公司。

1.2 3T3-L1 細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)及雷公藤紅素作用濃度篩選 1.2.1 成脂分化誘導(dǎo) 在37 ℃、5% CO2的濕潤環(huán)境中，3T3-L1 細(xì)胞在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%FBS、0.5 μmol/L 地塞米松、0.25 mmol/L 甲基異丁基黃嘌呤、5 μg/mL胰島素和50 μmol/L吲哚美辛的α-MEM培養(yǎng)基）中培養(yǎng)3 d達(dá)到約90%融合。

1.2.2 雷公藤紅素作用濃度篩選 雷公藤紅素用DMSO 配置成50 mmol/L 備用。將3T3-L1 細(xì)胞以3×103/孔接種到96 孔板中，在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別給予0、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L 的雷公藤紅素于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將CCK-8試劑添加到每個(gè)孔中，37 ℃下培養(yǎng)2 h。用多功能酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測吸光度值。小劑量雷公藤紅素對細(xì)胞增殖能力無明顯影響，0.3μmol/L 以上劑量的雷公藤紅素作用后細(xì)胞增殖能力明顯減弱。選擇0.3 μmol/L劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 雷公藤紅素作用后3T3-L1細(xì)胞中脂質(zhì)檢測 3T3-L1 細(xì)胞在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)達(dá)到90% 融合后，分別給予0、0.3 μmol/L 的雷公藤紅素處理3 d。用冷PBS 將處理過的細(xì)胞輕輕清洗2 次，在室溫下于4%多聚甲醛中固定10 min。隨后，細(xì)胞用去離子水洗滌2 次，并在室溫下用60% 飽和油紅O 染色5 min。每孔加入4% 異丙醇，在振動(dòng)搖床上搖動(dòng)15 min，520 nm 波長下測定提取染料光吸收率反映細(xì)胞內(nèi)油紅O含量。

1.4 雷公藤紅素作用的3T3-L1 細(xì)胞中脂肪生成相關(guān)基因檢測 3T3-L1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法同“1.3”。用TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將每個(gè)樣本的RNA 1 μg 逆轉(zhuǎn)錄成cD?NA，逆轉(zhuǎn)錄條件為25 ℃10 min，37 ℃1 h，85 ℃2 min。應(yīng)用SGExcel Fast SYBR Mixture kits 進(jìn)行qP?CR 檢測。95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃10 s、60 ℃10 s、72 ℃10 s，共40 個(gè)循環(huán)。以β-tubulin 為內(nèi)參。C/EBPα 上游引物序列為5′-CTGATTCTTGCCAAACT?GAG-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-GAGGAAGCTA?AGACCCACTAC-3′；PPARγ上游引物序列為5′-CTT?GACAGGAAAGACAACGG-3′，下游引物序列為5′-GCTTCTACGGATCGAAACTG-3′；FABP4上游引物序列為5′-AAATCACCGCAGACGACAGG-3′，下游引物序 列 為5′-GGCTCATGCCCTTTCATAAAC-3′。 以2－ΔΔCt表示目的基因相對表達(dá)量。

1.5 雷公藤紅素作用的3T3-L1 細(xì)胞中脂肪生成相關(guān)蛋白檢測 3T3-L1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法同“1.3”。處理后的細(xì)胞用RIPA 裂解液裂解，應(yīng)用BCA 蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。每組取20 μg蛋白樣本行12% SDS-PAGE 電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜；5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入一抗tubulin 抗體（1∶2 000）、C/EBPα 抗體（1∶1 000）、FABP4 抗體（1∶1 000）、PPARγ 抗體（1∶1 000）于4 ℃孵育過夜；PBST 洗膜后，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，PBST 洗膜后用ECL 化學(xué)發(fā)光法染色；Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.6 雷公藤紅素作用靶點(diǎn)預(yù)測及驗(yàn)證 利用在線藥物靶點(diǎn)預(yù)測軟件Swiss Target Predication 分析雷公藤紅素的潛在作用靶點(diǎn)。3T3-L1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法同“1.3”。分別采用RT-PCR 法和Western blot?ting法檢測預(yù)測靶點(diǎn)基因和蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 或Dunnett 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素作用的3T3-L1 細(xì)胞中脂質(zhì)積累情況 0、0.3 μmol/L的雷公藤紅素處理3 d后，3T3-L1細(xì)胞中脂質(zhì)累積分別為97.33% ± 1.45%、33.33%± 3.48%，雷公藤紅素處理后細(xì)胞中脂質(zhì)累積減少（P均＜0.01）。見圖1。

圖1 不同濃度雷公藤紅素作用的3T3-L1細(xì)胞中脂質(zhì)積累情況

2.2 雷公藤紅素對3T3-L1 細(xì)胞脂肪生成相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響 0.3 μmol/L 雷公藤紅素作用后，3T3-L1 細(xì)胞中C/EBPα、PPARg2、FABP4 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度雷公藤紅素作用后3T3-L1細(xì)胞脂肪生成相關(guān)基因及蛋白表達(dá)比較（）

表1 不同濃度雷公藤紅素作用后3T3-L1細(xì)胞脂肪生成相關(guān)基因及蛋白表達(dá)比較（）

注：與0 μmol/L組相比，*P＜0.05。

濃度0 μmol/L 0.3 μmol/L C/EBPα mRNA 1.229 ± 0.229 0.175 ± 0.071*蛋白1.107 ± 0.056 0.432 ± 0.028*蛋白1.145 ± 0.022 0.239 ± 0.071*PPARg2 mRNA 1.151 ± 0.115 0.299 ± 0.035*蛋白1.054 ± 0.026 0.591 ± 0.030*FABP4 mRNA 0.887 ± 0.113 0.151 ± 0.063*

2.3 雷公藤紅素藥物作用靶點(diǎn)預(yù)測及驗(yàn)證情況雷公藤紅素藥物作用靶點(diǎn)主要與酶（20.0%）、核受體（20.0%）、磷酸酶（13.3%）、TLR-1 和IL-1 受體（6.7%）、細(xì)胞色素P450（6.7%）等相關(guān)。在預(yù)測出的30 多種雷公藤紅素可能藥物靶點(diǎn)中，PTPN11 排名位于前列，提示PTPN11 很可能是雷公藤紅素的作用靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0、0.3 μmol/L 雷公藤紅素處理的3T3-L1 細(xì)胞中PTPN11 mRNA 相對表達(dá)量分別為1.079 ± 0.079、0.375 ± 0.029，PTPN11 蛋白相對表達(dá)量分別為1.128 ± 0.064、0.669 ± 0.084。雷公藤紅素作用于3T3-L1 細(xì)胞后，PTPN11 mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào)（P均＜0.05）。

3 討論

雷公藤紅素作為一種傳統(tǒng)中藥，也已被用于糖尿病和肥胖的治療［15］。文獻(xiàn)報(bào)道，雷公藤紅素可通過抑制NF-κB信號(hào)通路激活來減少前脂肪細(xì)胞3T3-L1 中活性氧生成，提高線粒體膜電位［16-17］。雷公藤紅素可通過激活PI3K/Akt 通路來增加胰島素信號(hào)通路活性［18］。雷公藤紅素還有助于增加高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠對瘦素的敏感性。還有研究認(rèn)為，雷公藤紅素能夠減少攝食量、增加能量消耗，從而發(fā)揮強(qiáng)效減重作用［15］。胰島β 細(xì)胞功能障礙是T2DM 決定性的發(fā)病因素。雷公藤紅素可以直接作用于胰島β 細(xì)胞，抑制胰島β 細(xì)胞凋亡［19］。但是，雷公藤紅素對成脂分化的調(diào)控作用尚未見研究報(bào)道。本研究觀察了雷公藤紅素對前脂肪細(xì)胞3T3-L1 成脂分化的影響，并探討相關(guān)機(jī)制，進(jìn)一步探索雷公藤紅素在糖尿病治療中的潛在價(jià)值。

脂肪細(xì)胞的特征表現(xiàn)之一是脂滴形成。細(xì)胞內(nèi)脂滴大小和數(shù)量是評價(jià)細(xì)胞成脂分化程度的量化指標(biāo)。本研究油紅O 染色結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度雷公藤紅素作用的3T3-L1 細(xì)胞胞質(zhì)著色比較深，脂滴體積較大，脂滴數(shù)目較多，表明各組細(xì)胞都出現(xiàn)了成脂分化現(xiàn)象，但雷公藤紅素作用組成脂分化能力受到抑制，且抑制程度與雷公藤紅素作用濃度相關(guān)。這表明，雷公藤紅素能夠抑制前脂肪細(xì)胞的成脂分化。

PPARg2 和C/EBPα 是脂肪細(xì)胞分化的兩種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。其中PPARg 屬于核受體超家族成員，是在成脂分化過程中起核心調(diào)控作用的特異性轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控C/EBPalpha、FABP4 表達(dá)來調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化速度和脂滴形成［12］。FABP4 是成熟脂肪細(xì)胞胞質(zhì)蛋白，是反映成脂分化能力的關(guān)鍵指標(biāo)之一［13-14］。本研究結(jié)果顯示，0.3 μmol/L 雷公藤紅素作用后，3T3-L1 細(xì)胞中C/EBPα、PPARg2、FABP4 mRNA 及蛋白相對表達(dá)量均降低，進(jìn)一步表明未經(jīng)雷公藤紅素處理的細(xì)胞成脂分化能力最高，而雷公藤紅素作用降低了前脂肪細(xì)胞的成脂分化能力。

本研究利用在線藥物靶點(diǎn)預(yù)測軟件Swiss Tar?get Predication 分析雷公藤紅素的潛在作用靶點(diǎn)，結(jié)果顯示，雷公藤紅素藥物作用靶點(diǎn)主要與酶、核受體、磷酸酶、TLR-1 和IL-1 受體、細(xì)胞色素P450 等相關(guān)，PTPN11 可能是雷公藤紅素的潛在作用靶點(diǎn)，且雷公藤紅素可在mRNA 和蛋白水平降低PTPN11 的表達(dá)。研究表明，脂肪組織通過分泌包括瘦素在內(nèi)的多種脂肪因子來調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝及生理活動(dòng)［20］。瘦素是目前研究較為廣泛的脂肪因子，其可誘導(dǎo)STAT3 磷酸化并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中，使瘦素靶基因轉(zhuǎn)錄，完成瘦素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PTPN11基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP-2），后者參與胞外刺激信號(hào)傳入胞內(nèi)的過程，調(diào)控Ras/Raf/MAPK、JAK/STAT、ERK 及PI3K 等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化。除了SHP-2廣為人知的對腫瘤的調(diào)節(jié)作用外，SHP-2亦調(diào)控肥胖發(fā)生。SHP-2可調(diào)節(jié)瘦素的表達(dá)水平，SHP-2基因敲除小鼠的后代即使正常飲食也會(huì)比野生型小鼠易于出現(xiàn)早期肥胖。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及本研究中雷公藤紅素抑制3T3-L1 細(xì)胞成脂分化的結(jié)果，推測PTPN11 基因編碼的SHP-2 很有可能是雷公藤紅素抗成脂分化作用的靶點(diǎn)。

綜上所述，雷公藤紅素可抑制前脂肪細(xì)胞3T3-L1 成脂分化，其機(jī)制與下調(diào)PTPN11 表達(dá)、抑制脂肪生成相關(guān)蛋白信號(hào)通路有關(guān)，上述研究結(jié)果仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。