不同離心條件所制PRF的生長因子釋放水平及促成纖維細(xì)胞增殖、遷移作用比較

賀波，霍繼武，熊竹友，蔣邦紅，陳宇，李光早

1 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽蚌埠233000；2 組織移植安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

富血小板纖維蛋白（PRF）作為新一代血小板制品，因其制作簡單、具有獨(dú)特三維纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［1］、能夠攜帶多種促生長因子［2］、不含富血小板血漿（PRP）所需的抗凝劑等優(yōu)點(diǎn)，被用于多種領(lǐng)域，如創(chuàng)面愈合［3］、口腔種植醫(yī)學(xué)等［4］。PRF 制備方法多種多樣，基于不同離心條件可制得不同的PRF 制品，如可注射型PRF、富白細(xì)胞PRF（L-PRF）、高級PRF（A-PRF）、高級PRF+（A-PRF+）等［5-7］。不同的PRF制品生長因子含量也有所差異。成纖維細(xì)胞作為皮膚真皮層的重要組成細(xì)胞，在創(chuàng)面愈合的新生肉芽組織形成及膠原蛋白分泌過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［8］。2020 年5 月—9 月，本研究觀察了L-PRF、A-PRF、A-PRF+三種制品中血小板衍生生長因子（PDGF-AB）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）釋放水平及各PRF 制品對皮膚成纖維細(xì)胞增殖、遷移的作用，深入了解不同PRF 制品對成纖維細(xì)胞生長能力影響的差異性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 健康成年雄性SD大鼠30 只，SPF 級，體質(zhì)量300～400 g，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物許可證編號為SCXK（魯）2019003。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程已通過蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)（2020 第145 號）。特級胎牛血清（FBS）購自CLARK 公司。DMEM/F12 培養(yǎng)基、PBS緩沖液均購自HyClone 公司。青霉素—鏈霉素雙抗、胰酶細(xì)胞消化液、CCK-8 試劑、FITC 標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗均購自Biosharp 公司。Ⅰ型膠原酶購自Yeason 公司。4% 多聚甲醛、DAPI 試劑、5% BSA 封閉液購自Solarbio 公司。波形蛋白（Vimention）一抗購自武漢三鷹生物公司。Transwell 嵌套購自Cron?ing 公司。TritionX-100 購自BioFRoxx 公司。大鼠PDGF-AB、TGF-β、VEGF 的ELISA 試劑盒均購自酶聯(lián)生物公司。

1.2 不同PRF 制品制備及條件培養(yǎng)基的獲取 以10% 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，75% 乙醇消毒左胸部皮膚，采血針于心尖搏動(dòng)明顯處穿刺采血，用10 mL不含抗凝劑的采血管采集大鼠血液9～10 mL，置于離心機(jī)中。分別以708 g 離心12 min、208 g 離心14 min、208 g 離心8 min 制備得到L-PRF、A-PRF、A-PRF+。棄去上層較清亮的貧血小板血漿層及下層的紅細(xì)胞層，保留中層膠凍狀的PRF 及少量PRF與紅細(xì)胞交界層，置于超凈臺內(nèi)無菌紗布上。將取出的PRF 制品放于兩層無菌紗布之間，壓平后分別置于24 孔板內(nèi)，加入等量含10% FBS 及1% 雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基約2 mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。分別于操作后1 h、6 h、1 d、3 d、5 d 收集孔板內(nèi)條件培養(yǎng)基，-20 ℃保存?zhèn)溆?。每次收集后重新加入等量培養(yǎng)基繼續(xù)孵育。

1.3 PRF 析出液中生長因子檢測 取出各組條件培養(yǎng)基，待溶解后，置入離心機(jī)中，2 000 r/min 離心5 min，分離雜質(zhì)內(nèi)容物，收集上清液，采用ELISA 法檢測PDGF-AB、TGF-β、VEGF。

1.4 PRF對成纖維細(xì)胞增殖、遷移作用觀察

1.4.1 成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 取健康成年SD 大鼠，背部取皮區(qū)剔毛備皮，碘伏及75% 乙醇消毒，取得2 cm×2 cm 的背部皮膚，置于75% 乙醇中浸泡約20 min。將標(biāo)本放入超凈臺中，于含雙抗的PBS 中浸泡10 min。用無菌刀片剔除表皮層及皮下組織，PBS 緩沖液漂洗干凈后剪成2 mm×2 mm 組織顆粒，放入含0.25% Ⅰ型膠原酶的離心管內(nèi)消化。將離心管放入37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中消化5 h，每隔30 min 搖晃震蕩1 次。待組織基本消化后，經(jīng)70 μm 細(xì)胞濾器過濾去除雜質(zhì)，置于離心機(jī)內(nèi)2 000 r/min 離心6 min。棄去管內(nèi)液體，用含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基吹打后分裝入T25培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，3 d 換1 次液。待細(xì)胞生長至融合度80%～90% 時(shí)進(jìn)行傳代，將P3 細(xì)胞以9×103/孔接種于12 孔板的2 孔中，待細(xì)胞生長至鋪滿孔徑的90%時(shí)，進(jìn)行Vimentin 免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定。成纖維細(xì)胞在倒置顯微鏡下多數(shù)呈長梭形，部分呈扁平星形或三角形分布，細(xì)胞突起明顯。細(xì)胞抗Vimentin 染色呈綠色，均為陽性表達(dá)，細(xì)胞核呈橢圓形，被DAPI染液染成藍(lán)色，胞質(zhì)透明不著色。

1.4.2 細(xì)胞增殖能力檢測 取P3 代成纖維細(xì)胞，以2×103/孔接種于96 孔板中預(yù)培養(yǎng)24 h，取不同PRF 條件培養(yǎng)基，使用總體積的20%［9］。將細(xì)胞分為L-PRF 組、A-PRF 組、A-PRF+組、空白組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別以L-PRF、A-PRF、A-PRF+條件培養(yǎng)基和10% FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后1、3、5 d 加入10 μL 的CCK-8 試劑，孵育2 h 后，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的光密度（OD）值表示細(xì)胞增殖能力。

1.4.3 細(xì)胞遷移能力檢測 取P3 代成纖維細(xì)胞，消化離心后，PBS 清洗2 次，用不含PBS 的培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度，取200 μL 約4×104個(gè)細(xì)胞的懸液加入上層室，下層室分別加入L-PRF、A-PRF、A-PRF+條件培養(yǎng)基和10% FBS培養(yǎng)基各600 μL，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。24 h 后，用鑷子夾出上室，內(nèi)表面用棉棒輕柔刮擦以去除內(nèi)側(cè)面細(xì)胞，PBS清洗2次，稍作風(fēng)干后，以4%多聚甲醛（上室200 μL、下室500 μL）固定15 min，PBS 清洗2 次。加入500 μL 的0.1% 結(jié)晶紫染色液于下室內(nèi)，染色20 min。PBS 清洗2 次，置于新孔，小室內(nèi)加100 μL PBS，鏡下觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各PRF 條件培養(yǎng)基中生長因子釋放水平比較 L-PRF 培養(yǎng)基中PDGF-AB 水平于6 h 時(shí)達(dá)最高值，之后緩慢下降；A-PRF及A-PRF+培養(yǎng)基前3 d呈上升趨勢，后開始下降；A-PRF、A-PRF+培養(yǎng)基制備1 d 后PDGF-AB 釋放水平高于L-PRF，且A-PRF+培養(yǎng)基制備1、3 d時(shí)PDGF-AB 釋放水平高于A-PRF（P均＜0.05）。L-PRF 培養(yǎng)基中TGF-β 釋放水平于1 d前均呈上升趨勢，后開始下降，A-PRF、A-PRF+總體呈上升趨勢；制備6 h 后，L-PRF、A-PRF、A-PRF+培養(yǎng)基TGF-β 釋放水平依次增高（P均＜0.05）。各PRF 培養(yǎng)基中的VEGF 于制備后6 h 釋放達(dá)最高值，后 明顯 降 低；A-PRF、A-PRF+ 培 養(yǎng) 基 制備1 d 后VEGF 釋放水平高于L-PRF，A-PRF+ 培養(yǎng)基制備6 h、5 d 后VEGF 釋放水平高于A-PRF（P均＜0.05）。制備5 d內(nèi)A-PRF、A-PRF+培養(yǎng)基PDGF-AB、TGF-β、VEGF 總體釋放水平高于L-PRF 培養(yǎng)基（P均＜0.05）。見表1、表2。

2.2 各組細(xì)胞增殖能力比較 見表3。

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較 空白組、L-PRF 組、A-PRF 組、A-PRF+組培養(yǎng)24 h 后穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（24.01 ± 2.41）、（40.81 ± 2.61）、（66.91 ± 2.21）、（74.51 ± 3.55）個(gè)。L-PRF 組、A-PRF 組、A-PRF+組穿膜細(xì)胞數(shù)高于空白組，且A-PRF 組、A-PRF+組穿膜細(xì)胞數(shù)高于L-PRF組（P均＜0.05）。

表1 各PRF條件培養(yǎng)基制備不同時(shí)點(diǎn)PDGF-AB、TGF-β、VEGF釋放水平比較（）

表1 各PRF條件培養(yǎng)基制備不同時(shí)點(diǎn)PDGF-AB、TGF-β、VEGF釋放水平比較（）

注：與L-PRF相比，*P＜0.05；與A-PRF相比，△P＜0.05。

培養(yǎng)基L-PRF 1 h 6 h 1 d 3 d 5 d A-PRF 1 h 6 h 1 d 3 d 5 d A-PRF+1 h 6 h 1 d 3 d 5 d PDGF-AB（pg/mL）TGF-β（ng/mL）VEGF（pg/mL）1 869.27 ± 96.76 2 178.51 ± 113.66 1 862.39 ± 96.87 1 566.26 ± 22.01 899.29 ± 16.15 2.71 ± 0.15 4.56 ± 0.17 6.84 ± 0.39 3.33 ± 1.35 2.75 ± 0.17 54.35 ± 2.25 72.56 ± 2.24 36.41 ± 2.00 31.13 ± 2.04 22.84 ± 2.65 1 752.43 ± 76.81 1 997.03 ± 53.75 2 176.64 ± 42.22*2 541.30 ± 97.45*2 153.16 ± 118.68*2.98 ± 0.58 5.83 ± 0.09*9.75 ± 0.44*11.77 ± 1.28*6.40 ± 0.84*69.89 ± 2.95*80.92 ± 1.66*43.29 ± 1.08*40.33 ± 1.75*23.39 ± 1.81 69.19 ± 0.64*88.96 ± 1.83*△43.13 ± 2.37*41.91 ± 2.21*33.66 ± 1.99*△1 799.55 ± 44.77 2 053.15 ± 67.65 2 769.87 ± 46.07*△3 247.44 ± 103.63*△2 397.93 ± 115.51*3.58 ± 0.13 6.81 ± 0.32*△12.40 ± 1.04*△16.10 ± 0.69*△11.64 ± 0.91*△

表2 各PRF條件培養(yǎng)基制備5 d內(nèi)PDGF-AB、TGF-β、VEGF總釋放水平比較（）

表2 各PRF條件培養(yǎng)基制備5 d內(nèi)PDGF-AB、TGF-β、VEGF總釋放水平比較（）

注：與L-PRF相比，*P＜0.05；與A-PRF相比，△P＜0.05。

培養(yǎng)基L-PRF A-PRF A-PRF+VEGF（pg/mL）217.28 ± 4.02 257.81 ± 6.12*276.85 ± 6.20*△PDGF-AB（pg/mL）8 375.68 ± 273.96 1 062.55 ± 306.31*12 267.95 ± 239.01*△TGF-β（ng/mL）20.19 ± 1.56 36.73 ± 1.94*50.53 ± 1.38*△

表3 各組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力比較（）

表3 各組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力比較（）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與L-PRF組相比，△P＜0.05。

組別A-PRF+組A-PRF組L-PRF組空白組細(xì)胞增殖能力5 d 1.76 ± 0.09*1.72 ± 0.03*1.59 ± 0.07*0.98 ± 0.12 1 d 0.38 ± 0.03 0.28 ± 0.02 0.29 ± 0.04 0.35 ± 0.04 3 d 1.41 ± 0.10*△1.31 ± 0.06*△1.10 ± 0.02*0.62 ± 0.01

3 討論

隨著整復(fù)學(xué)科的迅速發(fā)展，自體血液提取物開始推廣應(yīng)用。PRF 作為第二代血富血小板制品，相較于PRP，其無需使用如抗凝劑等的添加劑，三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可容納更多生長因子，制備簡單，并且還提供了三維纖維蛋白基質(zhì)，可用作多種程序的支架，在引導(dǎo)性骨再生和引導(dǎo)性組織再生程序中發(fā)揮屏障膜功能［10］。鑒于這些優(yōu)點(diǎn)，PRF 已被廣泛應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)、齒槽裂骨修復(fù)等領(lǐng)域［11-12］。

PRF 富含多種生長因子，血小板內(nèi)的α 顆粒被激活后，會緩慢釋放多種生長因子，包括PDGF-AB、TGF-β、VEGF，PDGF 和TGF-β 可刺激成纖維細(xì)胞遷移并上調(diào)整聯(lián)蛋白受體的表達(dá)，而VEGF 在創(chuàng)面愈合過程中可刺激新生血管生長［13］。這些因子之間相互平衡制約，在組織愈合過程中都發(fā)揮著重要的作用［14］。近年研究報(bào)道，低速離心條件制備的A-PRF、A-PRF+更有利于纖維蛋白內(nèi)多種生長因子的釋放。研究發(fā)現(xiàn)，L-PRF、PRP、A-PRF+三者比較，以A-PRF+的生長因子釋放量更高［15］。也有學(xué)者報(bào)道，減少相對離心力則PRF生長因子釋放能力更強(qiáng)［16］。GHANAA?TI等［7］認(rèn)為，過高的離心速度會導(dǎo)致白細(xì)胞和其他生長因子損失，利用較低的離心速度有助于提高白細(xì)胞和生長因子的數(shù)量。然而DOHAN EHRENFEST等［17］的研究表明，較高離心力制備出的L-PRF的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，所釋放的生長因子含量更高。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能與PRF制作工藝的選擇有關(guān)。

本研究利用不同相對離心力及離心時(shí)間分別制備得到L-PRF、A-PRF、A-PRF+，并將其置于不同的培養(yǎng)基中獲得PRF 條件培養(yǎng)基，利用ELISA 法測定各時(shí)間段的培養(yǎng)基生長因子釋放情況及累計(jì)釋放總量，結(jié)果顯示，制備5 d 內(nèi)A-PRF、A-PRF+培養(yǎng)基PDGF-AB、TGF-β、VEGF 總體釋放水平高于L-PRF培養(yǎng)基，提示A-PRF、A-PRF+培養(yǎng)基的PDGF-AB、TGF-β、VEGF 釋放能力強(qiáng)于L-PRF 培養(yǎng)基，且以APRF+培養(yǎng)基作用最強(qiáng)。進(jìn)一步利用富含PRF 滲出液的培養(yǎng)基培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，觀察其增殖、遷移能力的變化。A-PRF+組、A-PRF 組、L-PRF 組培養(yǎng)3、5 d時(shí)細(xì)胞增殖能力均高于空白組，且培養(yǎng)3 d 時(shí)A-PRF+組、A-PRF 組細(xì)胞增殖能力高于L-PRF 組；L-PRF 組、A-PRF 組、A-PRF+組穿膜細(xì)胞數(shù)高于空白組，且A-PRF 組、A-PRF+ 組穿膜細(xì)胞數(shù)高于L-PRF 組。這提示在組織修復(fù)的過程中，較低的離心力制備得到的PRF 能夠更加有效地促進(jìn)成纖維細(xì)胞于創(chuàng)口處大量募集與增殖，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，通過降低相對離心力制備得到的A-PRF+和A-PRF的生長因子釋放性能、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和遷移的作用明顯強(qiáng)于L-PRF，且適當(dāng)縮短離心時(shí)間得到的A-PRF+作用更強(qiáng)。