miR-664b-3p調(diào)控Caspase-1介導(dǎo)細(xì)胞焦亡在深靜脈血栓形成中的作用

褚楚，劉文，郭紅，趙霖，魏然，張振，郭強(qiáng)，朱肖肖，王彬，李霞

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所），濟(jì)南250062；2 山東德升生物工程有限公司；3 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

深靜脈血栓形成（DVT）是臨床常見(jiàn)的周?chē)芗膊?，因血液在深靜脈內(nèi)不正常凝固導(dǎo)致靜脈回流障礙［1］。目前DVT 的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，探討其發(fā)病機(jī)制對(duì)于尋找有效的防治措施具有重要意義。細(xì)胞焦亡是一種炎性程序性細(xì)胞死亡，由兩種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）介導(dǎo)，包括經(jīng)典的Cas?pase-1和非經(jīng)典的Caspase-4/5/11。其中，Caspase-1可激活白細(xì)胞介素（IL）1β 和IL-18 前體產(chǎn)生成熟的IL-1β 和IL-18，同時(shí)裂解焦孔素D（GSDMD）形成具有成孔作用的活性片段GSDMD-N 以誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡［2］。微小核糖核酸（miRNAs）通過(guò)與其靶基因3′非翻譯區(qū)（3′UTR）結(jié)合抑制基因轉(zhuǎn)錄或翻譯［3］。越來(lái)越多的研究表明，miRNAs 參與了DVT 的發(fā)生和發(fā)展，但其調(diào)控細(xì)胞焦亡在DVT 中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。2020 年2 月—10 月，我們通過(guò)檢測(cè)DVT 患者外周血細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白及miR-664b-3p 水平變化，探討miR-664b-3p 通過(guò)靶向調(diào)控Caspase-1 介導(dǎo)細(xì)胞焦亡在DVT 發(fā)病中的作用，為臨床治療DVT 提供新的靶點(diǎn)與依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將2019 年1 月—2020 年1 月收治的急性期DVT 患者納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合第3 版《深靜脈血栓形成的診斷和治療指南》［4］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，屬于急性期混合型單純下肢DVT；②單側(cè)肢體發(fā)病，病程＜15 d；③年齡18～80 歲；④尚未采用溶栓等藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并活動(dòng)性下肢潰瘍；②合并心、腦、肺疾病及肝、腎功能異常；③有出血性疾病或出血傾向；④妊娠期婦女。本研究共收集DVT 患者30 例（DVT 組），男18 例、女12 例，年齡（56.8 ± 6.2）歲；選取同期健康志愿者30 例（健康對(duì)照組），男14例、女16例，年齡（54.8 ± 7.6）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本采集與試劑準(zhǔn)備 受試對(duì)象均于清晨空腹抽取靜脈血6 mL，分離血清用于ELISA 檢測(cè)，經(jīng)人外周血淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）用于qPCR 和Western blotting 檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)主要試劑：人外周血淋巴細(xì)胞分離液、RIPA 裂解液購(gòu)于索萊寶科技有限公司；TRIzol Reagent、UItraSYBR Mixture均購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；293T 細(xì)胞購(gòu)于南京科佰生物科技有限公司；Lipofectamine2000 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；人IL-1β、IL-18 蛋白ELISA 試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；miR-664b-3p mimics（上游序列為5′-UUCAUUUGCCUCCCAGCCUACA-3′，下游序列為5′-UAGGCUGGGAGGCAAAUGAAUU-3′）、陰性對(duì)照（NC，上游序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCAC?GUTT-3′，下 游 序 列 為5′-ACGUGACACGUUCG?GAGAATT-3′）及miR-664b-3p、內(nèi)參U6 引物由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見(jiàn)表1；Caspase-1 抗體、GAPDH 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；GSDMD-N 抗體購(gòu)于美國(guó)Novus Biologicals 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體購(gòu)于北京中杉金橋公司；野生型與突變型Caspase-1 3′UTR 載體均由美國(guó)Promega公司設(shè)計(jì)合成。

表1 miR-664b-3p、U6基因引物序列及產(chǎn)物片段

1.3 PBMC 中活化的Caspase-1（Cleaved Caspase-1）、GSDMD-N及miR-513c-5p檢測(cè)

1.3.1 Cleaved Caspase-1、GSDMD-N 蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。 用RIPA 裂解液提取各組PBMC 總蛋白，SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜；1×PBST 洗膜（10 min×4 次），二抗室溫?fù)u床孵育1 h；1×PBST 洗膜（10 min×4 次），加入顯影液顯影，化學(xué)發(fā)光法染色；Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶與GAPDH灰度值比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 miR-664b-3p 檢 測(cè) 采 用qPCR 法。 用TRIzol 法進(jìn)行提取各組PBMC 中的RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA 濃度與純度。 按照miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行miRNA 的cD?NA 合成，選用UltraSYBR Mixture PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以2－ΔΔCt計(jì)算miR-664b-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.4 血清IL-1β、IL-18 蛋白檢測(cè) 取離心所得血清，以ELISA 法檢測(cè)IL-1β、IL-18 蛋白，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。使用酶標(biāo)儀測(cè)定雙波長(zhǎng)（450 nm、630 nm）處的光密度（OD）值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算IL-1β、IL-18蛋白水平。

1.5 miR-664b-3p 與Caspase-1 的關(guān)系預(yù)測(cè) 采用Target Scan7.2 生物信息學(xué)軟件，預(yù)測(cè)miR-664b-3p與Caspase-1 mRNA 3′UTR 之間是否存在直接結(jié)合位點(diǎn)。

1.6 miR-664b-3p 靶向調(diào)控Caspase-1 情況觀察以pmirGLO為載體構(gòu)建包含結(jié)合位點(diǎn)的野生型及突變型Caspase-1 mRNA 3′UTR 質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染miR-664b-3p mimics 及NC，24 h后收集細(xì)胞并檢測(cè)雙熒光素酶報(bào)告基因活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism7.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以表示，兩組數(shù)據(jù)比較行配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組PBMC 中Cleaved Caspase-1、GSDMD-N 蛋白及miR-664b-3p表達(dá)水平比較 由表2可見(jiàn)，DVT組較健康對(duì)照組PBMC中Cleaved-Caspase-1、GSDMD-N蛋白表達(dá)升高而miR-664b-3p表達(dá)降低（P均＜0.05）。

表2 兩組PBMC中Cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白及miR-664b-3p表達(dá)比較（）

表2 兩組PBMC中Cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白及miR-664b-3p表達(dá)比較（）

注：與健康對(duì)照組相比，*P＜0.05；

組別DVT組健康對(duì)照組n 30 30 Cleaved Caspase-1 2.04 ± 0.11*1.00 ± 0.04 miR-664b-3 0.67 ± 0.05*1.02 ± 0.08 GSDMD-N 2.37 ± 0.05*0.99 ± 0.05

2.2 miR-664b-3p 與Caspase-1 關(guān)系的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果 miR-664b-3p 與Caspase-1 mRNA 3′UTR之間具有潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，提示miR-664b-3p可能通過(guò)結(jié)合Caspase-1 mRNA 的3′UTR 進(jìn)而抑制其表達(dá)。

2.3 miR-664b-3p 對(duì)Caspase-1 mRNA 3′UTR 熒光素酶報(bào)告基因活性的影響 由表3 可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染miR-664b-3p mimics 可以降低野生型Caspase-1 mRNA 3′UTR 熒光素酶報(bào)告基因活性（P＜0.05），但對(duì)突變型Caspase-1 mRNA 3′UTR 報(bào)告基因活性無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表3 miR-664b-3p對(duì)Caspase-1 mRNA 3′UTR熒光素酶報(bào)告基因活性的影響（）

表3 miR-664b-3p對(duì)Caspase-1 mRNA 3′UTR熒光素酶報(bào)告基因活性的影響（）

注：與轉(zhuǎn)染NC的細(xì)胞相比，*P＜0.05。

轉(zhuǎn)染物Caspase-1 mRNA 3′UTR熒光素酶報(bào)告基因活性野生型0.74 ± 0.00*1.00 ± 0.04 miR-664b-3p mimics NC突變型1.00 ± 0.08 0.99 ± 0.03

2.4 兩組血清IL-1β、IL-18 蛋白水平比較 由表4可見(jiàn)，DVT 組較健康對(duì)照組外周血IL-1β 及IL-18 蛋白水平升高（P均＜0.05）。

表4 兩組血清IL-1β、IL-18蛋白水平比較（）

表4 兩組血清IL-1β、IL-18蛋白水平比較（）

注：與健康對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別健康對(duì)照組DVT組IL-18 123.00 ± 15.55 526.00 ± 16.03*n 30 30 IL-1β 1.45 ± 0.13 5.56 ± 0.17*

3 討論

DVT 是因靜脈壁損傷、靜脈血流滯緩、血液高凝狀態(tài)引起的周?chē)芗膊?，其急性期?dǎo)致的肺栓塞及慢性期血栓形成后的綜合征嚴(yán)重危害患者生命安全及生活質(zhì)量［5］。因此，DVT 的發(fā)病機(jī)制具有重要的研究意義。內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙是DVT發(fā)生的重要因素，然而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制尚未完全闡明。

細(xì)胞焦亡是一種炎性程序性細(xì)胞死亡，其特征是GSDMD 介導(dǎo)的細(xì)胞膜腫脹破裂和IL-1β、IL-18引起的炎癥反應(yīng)［6］。當(dāng)炎癥小體被激活時(shí)，Caspase-1和其他非經(jīng)典Caspase 將其GSDMD 切割成N-端和C-端，從而破壞蛋白之間的抑制作用。游離的GSD?MD-N 末端能夠與質(zhì)膜結(jié)合，并在細(xì)胞膜上產(chǎn)生內(nèi)徑12～14 nm 的孔隙，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、裂解，并成為釋放炎癥因子（如IL-1β、IL-18）的通道［7］。炎癥反應(yīng)是區(qū)別細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志。適當(dāng)?shù)募?xì)胞焦亡及炎癥反應(yīng)對(duì)于阻斷病原體復(fù)制、直接殺滅胞內(nèi)菌及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用，但細(xì)胞焦亡不足或過(guò)度將導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控或組織損傷，引起疾病的發(fā)生和發(fā)展［8］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡減少可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力增強(qiáng)，而細(xì)胞焦亡過(guò)度導(dǎo)致的組織損傷參與了動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖、糖尿病等疾病的病理過(guò)程［9-10］。然而，目前細(xì)胞焦亡在靜脈血栓性疾病中的作用和調(diào)控機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，DVT 患者外周血細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18表達(dá)均上調(diào)，提示Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷參與了DVT 的發(fā)病。探索DVT 發(fā)病過(guò)程中細(xì)胞焦亡的調(diào)控機(jī)制，可能為DVT 的臨床治療提供新的有效靶點(diǎn)。

miRNAs 是非編碼RNA 領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNAs 參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過(guò)程的調(diào)控，以及多種疾病的發(fā)生發(fā)展［11］。近年來(lái)，miRNAs 在血管內(nèi)皮損傷和DVT 發(fā)展中的作用越來(lái)越受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，miR-195-5p表達(dá)升高，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而參與DVT 發(fā)?。?2］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-338-5p表達(dá)降低導(dǎo)致的IL-6 表達(dá)升高，以及miR-374a-5p、miR-374b-5p 表達(dá)升高導(dǎo)致的IL-10 表達(dá)降低，均與DVT 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［13-14］。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)miR?NAs 對(duì)細(xì)胞焦亡有調(diào)節(jié)作用。例如，miR-590-3p 通過(guò)靶向NLRP1/NOX4 信號(hào)通路抑制細(xì)胞焦亡從而減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變［15］；miR-214 可通過(guò)抑制Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移［16］。盡管已有上述發(fā)現(xiàn)，但miRNAs 影響細(xì)胞焦亡在DVT發(fā)病中的作用仍不清楚。

有研究報(bào)道，miR-664b-3p 參與了喉鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，DVT組患者外周血PBMC 中miR-664b-3p 表達(dá)較健康對(duì)照組降低，細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-1、GSDMD-N 及IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)升高。生物信息軟件Target Scan預(yù)測(cè)顯示，miR-664b-3p與Caspase-1 mRNA 的3′UTR 之間存在潛在堿基互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)，miR-664b-3p能夠與Caspase-1 mRNA 3′UTR 之間通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)直接結(jié)合，進(jìn)而抑制Caspase-1的轉(zhuǎn)錄與翻譯。以上結(jié)果提示，miR-664b-3p表達(dá)降低能夠解除其對(duì)靶基因Caspase-1表達(dá)的抑制，Caspase-1活性增強(qiáng)可通過(guò)切割GSDMD形成有活性的N片段，進(jìn)而在細(xì)胞膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡及炎癥因子釋放，損傷血管內(nèi)皮功能，最終導(dǎo)致DVT。

總之，本研究進(jìn)一步闡釋了DVT 的發(fā)病機(jī)制，提示miR-664b-3p調(diào)控Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡參與了DVT 的發(fā)生發(fā)展；因此，靶向上調(diào)miR-664b-3p表達(dá)以抑制Caspase-1及血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡、保護(hù)血管內(nèi)皮功能可能成為臨床治療DVT新的有效方式。