長(zhǎng)鏈非編碼RNA DDX11-AS1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響及其機(jī)制

羊丹，徐菁，陳保銀，馬竹芳

三二〇一醫(yī)院，陜西漢中723000

肝細(xì)胞癌（HCC）是肝臟腫瘤最常見的類型［1-2］?，F(xiàn)有的治療方法對(duì)晚期HCC患者的療效有限［3］。增殖和轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是惡性腫瘤兩個(gè)最重要的生物學(xué)特征，是腫瘤進(jìn)展的重要原因［4］。研究HCC 進(jìn)展相關(guān)機(jī)制將有助于進(jìn)一步探索新的治療靶點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）已被證明與HCC 的進(jìn)展有關(guān)，隨著高通量測(cè)序等技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多新的lncRNA被發(fā)現(xiàn)［5］。DEAD/DEAH 盒解旋酶11 反義RNA1（DDX11-AS1）是與腫瘤密切相關(guān)的lncRNA之一，在胃癌、食管癌和骨肉瘤等多種腫瘤中高表達(dá)［6-8］。SHI 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，DDX11-AS1 在HCC 中表達(dá)上調(diào)，與患者預(yù)后不良相關(guān)，可能是HCC 治療的潛在靶點(diǎn)。但DDX11-AS1是否與HCC的增殖和侵襲相關(guān)，目前仍不明確。2018 年8 月—2020 年1 月，本研究觀察了DDX11-AS1對(duì)HCC細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并探討可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 人HCC 細(xì)胞HepG2、Huh-7、SK-hep-1 及正常肝細(xì)胞LO2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院。DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。TRIzol 試劑購(gòu)自日本TaKaRa 公司。ULtraRT一步法RT-PCR 試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博公司。DDX11-AS1 siRNA 購(gòu)自廣州銳博生物生物技術(shù)有限公司。MTS 試劑購(gòu)自美國(guó)Biovision 公司。Tran?swell小室購(gòu)自美國(guó)Coring公司。蛋白裂解液和蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司。PI3K、pPI3K、AKT、pAKT 和GAPDH 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。PI3K/AKT 信號(hào)通路激活劑SC79購(gòu)自皓元生物技術(shù)有限公司。

1.2 不同HCC 細(xì)胞DDX11-AS1 檢測(cè) 將HepG2、Huh-7、SK-hep-1 及LO2 細(xì)胞接種于含10% 胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2全濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)棄掉培養(yǎng)基，PBS 洗3 次，加入TRIzol 試劑，完全裂解細(xì)胞，并依次加入氯仿、異丙醇和無(wú)水乙醇離心后獲取細(xì)胞中總RNA。按照RTPCR 試劑盒說(shuō)明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系包括2×ULtraRT one step Buffer 25 μL、ULtraRT one step EnzymeMix 1 μL、上下游引物各2 μL、RNA 1 μL，用無(wú)RNA 酶的雙蒸水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄45 ℃30 min，PCR 預(yù)變性95 ℃5 s，變性94 ℃5 s，退火65 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，變性、退火、延伸共40 個(gè)循環(huán)。以2-??Ct計(jì)算DDX11-AS1 相對(duì)表達(dá)量。DDX11-AS1 上游引物序列為5"-TTAGGAGGACAACGAATCACCTC-3"，下游引物序列為5"-GTCATCTCCCAGAACCAGACTTT-3"。內(nèi)參GAPDH 上游引物序列為5"-TGAAGGTCG?GAGTCAACGGATTT-3"，下游引物序列為5"-GCCATG?GAATTTGCCATGGGTGG-3"。

1.3 干擾DDX11-AS1 表達(dá)對(duì)HCC 細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響觀察

1.3.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 取“1.2”中DDX11-AS1表達(dá)水平相對(duì)較高的HCC 細(xì)胞，以1.0×105/孔鋪至6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。將HCC細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分別轉(zhuǎn)染NC siRNA和DDX11-AS1 siRNA，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，采用qRT-PCR法測(cè)得對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中DDX11-AS1 相對(duì)表達(dá)量分別為1.02 ± 0.04、0.35 ± 0.08，提示DDX11-AS1 siRNA可以抑制HCC細(xì)胞中DDX11-AS1的表達(dá)。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力觀察 細(xì)胞增殖率測(cè)算：收集兩組細(xì)胞，以2×103/孔接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48 h后每孔更換培養(yǎng)基100 μL，并加入MTS 試劑20 μL，在培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm 處的光密度（OD）值；以實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值×100% 計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞克隆形成率測(cè)算：收集兩組細(xì)胞，以2×103/孔接種于6 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d 更換1 次新鮮培養(yǎng)基；待肉眼可見的細(xì)胞克隆團(tuán)形成時(shí)終止細(xì)胞培養(yǎng)，PBS 洗3 次，甲醇溶液固定10 min，吉姆薩染色，干燥后計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆團(tuán)；以實(shí)驗(yàn)組克隆團(tuán)數(shù)/對(duì)照組克隆團(tuán)數(shù)×100% 計(jì)算細(xì)胞克隆形成率。

1.3.3 細(xì)胞侵襲能力觀察 收集兩組細(xì)胞，以無(wú)血清培養(yǎng)基洗3 次，制備為1×106/mL 的無(wú)血清細(xì)胞重懸液，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。取細(xì)胞重懸液100 μL 加至Transwell 小室的上室膜上，含10% 胎牛血清的培養(yǎng) 基500 μL 加 至Transwell 小 室 的 下 室 中，并 將Transwell小室放入下室中。放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h 后終止培養(yǎng)，PBS 將未穿膜的細(xì)胞洗去，甲醇溶液固定10 min，吉姆薩染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。

1.3.4 細(xì)胞中PI3K/AKT 信號(hào)通路蛋白檢測(cè) 收集兩組細(xì)胞，加入RIPA 蛋白裂解液，冰上震蕩裂解30 min。4 ℃、14 000 r/min 離心30 min，去除細(xì)胞碎片，獲得細(xì)胞總蛋白。檢測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性，80 V 電壓下行蛋白電泳分離2 h，于350 mA將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶常溫孵育1 h。加入PI3K、pPI3K、AKT、pAKT 和GAPDH 一抗4 ℃孵育過(guò)夜，加入兔二抗室溫孵育2 h。TBST洗3次后，采用ECL 超敏化學(xué)發(fā)光曝光條帶，Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.4 SC79對(duì)DDX11-AS1作用的干預(yù)觀察

1.4.1 HCC 細(xì)胞分組及處理 將HCC 細(xì)胞分為NC 組、si-DDX11-AS1 組 和SC79 組，NC 組轉(zhuǎn)染NC siRNA，si-DDX11-AS1 組 和si-DDX11-AS1+SC79 組轉(zhuǎn)染DDX11-AS1 siRNA。SC79組細(xì)胞加入5 μmol/L的SC79 10 μL，NC 組 和si-DDX11-AS1 組 加 入DMSO 10 μL，作用48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 細(xì)胞增殖能力觀察 收集三組細(xì)胞，采用MTS法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力。方法參照“1.3.2”。

1.4.3 細(xì)胞侵襲能力觀察 收集三組細(xì)胞，采用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。 方法參照“1.3.3”。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 細(xì)胞中DDX11-AS1 表達(dá)變化 HepG2、Huh-7、SK-hep-1、LO2 細(xì)胞中DDX11-AS1 相對(duì)表達(dá)量分別為7.28 ± 0.78、3.55 ± 0.54、5.08 ± 0.12、1.00 ± 0.02，HepG2、Huh-7、SK-hep-1 細(xì) 胞 中DDX11-AS1 表達(dá)高 于LO2 細(xì) 胞，其中HepG2 細(xì)胞DDX11-AS1表達(dá)量最高（P均＜0.05）。

2.2 干擾DDX11-AS1 表達(dá)對(duì)HCC 細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率、克隆形成率、穿膜細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞中pPI3K、pAKT 蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組（P均＜0.05）。見表1、表2。

2.3 SC79 激 活PI3K/AKT 通路 對(duì)si-DDX11-AS1 組HCC 細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力的影響 SC79 組、si-DDX11-AS1 組細(xì)胞增殖率和穿膜細(xì)胞數(shù)低于NC組，SC79 組細(xì)胞增殖率和穿膜細(xì)胞數(shù)高于si-DDX11-AS1組（P均＜0.05）。見表3。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞增殖、侵襲能力指標(biāo)比較（）

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞增殖、侵襲能力指標(biāo)比較（）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)（個(gè)）47.33 ± 7.02*102.67 ± 11.02細(xì)胞增殖率（%）67.33 ± 5.99*100.00 ± 2.00克隆形成率（%）33.87 ± 3.01*100.00 ± 1.00

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較（）

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組pAKT 0.06 ± 0.04*0.50 ± 0.10 PI3K 0.81 ± 0.17 0.86 ± 0.09 pPI3K 0.11 ± 0.07*0.41 ± 0.11 AKT 0.56 ± 0.13 0.53 ± 0.09

表3 SC79組、si-DDX11-AS1組、NC組細(xì)胞增殖、侵襲能力指標(biāo)比較（）

表3 SC79組、si-DDX11-AS1組、NC組細(xì)胞增殖、侵襲能力指標(biāo)比較（）

注：與NC組相比，*P＜0.05；與si-DDX11-AS1組相比，#P＜0.05。

組別SC79組si-DDX11-AS1組NC組穿膜細(xì)胞數(shù)（個(gè)）72.67 ± 7.51*#39.33 ± 15.01*112.33 ± 19.08細(xì)胞增殖率（%）76.20 ± 5.92*#60.21 ± 8.06*100.00 ± 5.00

3 討論

HCC 是病死率很高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［1］。肝切除、肝移植、局部消融治療和經(jīng)動(dòng)脈化學(xué)栓塞等療法廣泛用于HCC 的治療［10］，但HCC 的惡性程度較高，常復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致HCC 患者的預(yù)后較差［3］。HCC 的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，涉及多種因素，包括乙型或丙型肝炎病毒感染、黃曲霉毒素等暴露、飲酒過(guò)量、遺傳和表觀遺傳學(xué)等改變［11-12］，確切的發(fā)病機(jī)制仍不明確。深入研究HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)于開發(fā)有效治療干預(yù)措施、改善HCC患者預(yù)后至關(guān)重要。

lncRNA 是一種長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸的RNA，由于其缺少完整的開放閱讀框，不具有編碼蛋白質(zhì)的功能［13］。lncRNA 參與人體多個(gè)生理過(guò)程的調(diào)節(jié)，其表達(dá)失調(diào)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，這使得ln?cRNA 有望成為惡性腫瘤診斷和治療的靶點(diǎn)［14］。DDX11-AS1 是DDX11 的反義RNA，DDX11 是一種DNA 依賴性的ATPase 和解旋酶，參與DNA 復(fù)制和姐妹染色單體的內(nèi)聚，而DDX11-AS1 可以調(diào)節(jié)DDX11 的活性，因此DDX11-AS1 是DNA 復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)程所必需的［15］。研究發(fā)現(xiàn)，DDX11-AS1 的異常表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展。SHI 等［9］采用生物學(xué)信息分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)HCC 組織中DDX11-AS1 高表達(dá)，并預(yù)示較差的預(yù)后，與HCC 惡性進(jìn)展相關(guān)。本研究首先檢測(cè)了DDX11-AS1 在HCC 細(xì)胞中的表達(dá) 情 況，發(fā) 現(xiàn)HepG2、Huh-7、SK-hep-1 細(xì) 胞 中DDX11-AS1 表達(dá)均高于正常肝細(xì)胞，與大數(shù)據(jù)分析的結(jié)果一致［9］。選擇DDX11-AS1 表達(dá)相對(duì)較高的HepG2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染DDX11-AS1 siRNA，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制DDX11-AS1 表達(dá)后，HCC 細(xì)胞的增殖能力和轉(zhuǎn)移能力均降低，與膀胱癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中DDX11-AS1 表達(dá)的相關(guān)研究結(jié)果一致［16-17］。這表明DDX11-AS1表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)HCC的惡性進(jìn)展。

現(xiàn)已證實(shí)DDX11-AS1 可以被癌基因MYC 激活，同時(shí)被抑癌基因p53負(fù)調(diào)控，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［14］。FENG 等［18］報(bào)道，DDX11-AS1通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展。PI3K/AKT 信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞分化、增殖、凋亡等均具有重要的調(diào)控作用，且PI3K/AKT 信號(hào)通路與HCC 發(fā)病關(guān)系密切。PI3K 是一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，其磷酸化水平的提高與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。而其下游信號(hào)分子AKT 在HCC 中處于激活狀態(tài)［19］。抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路激活，腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移受到抑制，因此PI3K/AKT 信號(hào)通路被認(rèn)為是抗腫瘤治療的有效靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制DDX11-AS1 表達(dá)后，HCC 細(xì)胞中pPI3K 和pAKT 蛋白表達(dá)降低，表示PI3K/AKT 信號(hào)通路的激活受到抑制。 SC79 是PI3K/AKT 信號(hào)通路激活劑，可以增加PI3K 磷酸化水平。為了進(jìn)一步研究DDX11-AS1是否通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)HCC 細(xì)胞的增殖和侵襲能力，我們以SC79 處理DDX11-AS1 表達(dá)受到抑制的HCC 細(xì)胞，觀察結(jié)果顯示，SC79 可以使因DDX11-AS1 表達(dá)降低而導(dǎo)致增殖、侵襲能力受抑制的HCC 細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為得到部分恢復(fù)，提示DDX11-AS1 可能通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)HCC 的惡性進(jìn)展。

綜上所述，HCC 細(xì)胞中DDX11-AS1 表達(dá)上調(diào)；干擾DDX11-AS1 表達(dá)可抑制HCC 細(xì)胞的增殖和侵襲能力，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)。DDX11-AS1有望成為抗HCC治療的新靶點(diǎn)。