融合蛋白Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）介導(dǎo)的T細(xì)胞對B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞殺傷作用觀察

張曉龍，孟帥，吳春暖，熊冬生，張潔

1 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060；2 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院

在腫瘤的免疫治療中，激活的T 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞具有強大的殺傷能力。然而傳統(tǒng)的單克隆抗體治療不能有效募集T細(xì)胞至腫瘤微環(huán)境?？赏瑫r識別兩個不同靶抗原的雙特異性抗體（BsAbs）［1］有望克服這一問題。最具有代表性的BsAbs是用于治療前B 細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病的雙特異性T 細(xì)胞銜接子（BiTE）blinatumomab［2-3］。但blinatumomab 半衰期短，給藥時間長，患者用藥不便，并增加治療相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生率［4］。為解決BiTE 在體內(nèi)半衰期短的問題，有研究人員設(shè)計了一種串聯(lián)四價雙特異性抗體（TandAb）［5-6］。本課題組前期研究將抗CD3 單克隆抗體（HIT3a）和抗CD19 單克隆抗體（HIT19a）的可變區(qū)序列通過不同長度的柔性肽連接，設(shè)計了串聯(lián)四價雙特異性抗體Tandab（CD3/CD19），驗證了其與CD3+細(xì)胞或CD19+細(xì)胞具有良好的結(jié)合活性［7］，且在體內(nèi)外能有效介導(dǎo)T 細(xì)胞對CD19+腫瘤細(xì)胞的殺傷［8］。然而T 細(xì)胞在活化過程中往往需要第二信號的協(xié)同刺激，因此，本課題組在Tandab（CD3/CD19）的基礎(chǔ)上引入4-1BBL 胞外結(jié)構(gòu)域，設(shè)計了一種融合蛋白Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）。2018 年12 月—2020 年6 月，本研究觀察了Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）介導(dǎo)的T 細(xì)胞對B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的殺傷作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實驗材料 人急性T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat、人B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞Raji由本實驗室保存，正常人外周血由天津市血液中心提供，以上細(xì)胞均用含10% FBS、2 mmol/L L- 谷氨酰胺的RPMI-1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人胚腎293T 細(xì)胞購自ATCC 公司，用含10% FBS 及2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。限制性內(nèi)切酶NotⅠ、NheⅠ及BamHⅠ購自NEB（北京）公司。T4 DNA 連接酶、DNA Marker、DNA 上樣緩沖液購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。Taq DNA 聚合酶購自上海申能博彩生物公司。Lipofectamine2000 購自Invitrogen 公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。DNA 片段膠回收試劑盒購自大連寶生物TaKaRa 公司。超濾管購于美國Millipore 公司。HisTrap excel蛋白純化柱購自美國GE 公司。人IL-2 ELISA 試劑盒購自北京欣博盛生物科技公司。His-Tag ELISA試劑盒購自南京金斯瑞生物科技有限公司。Cyto?Tox 96 非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自Promega公司。鼠源性抗His-tag 單克隆抗體、抗人4-1BB 抗體及Alexa Fluor 488 標(biāo)記的鼠源性抗His-tag 單克隆抗體購自MBL 公司。FITC 標(biāo)記抗CD69 單克隆抗體、抗CD25 單克隆抗體及同型對照購自美國BD 公司?？谷薈D3 單克隆抗體（HIT3a）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供。

1.2 慢病毒表達載體pLentiR.SV40-Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）的構(gòu)建 采用常規(guī)酶切、連接等分子克隆方法構(gòu)建慢病毒表達載體pLentiR.SV40-Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）。NotⅠ分別單酶切pLentiR.SV40-Tandab（CD3/CD19）載體和T-（G4S）3-4-1BBL載體，將相應(yīng)長度的片段回收，并在T4 DNA 連接酶作用下進行連接，隨后通過菌液PCR 和雙酶切（NheⅠ和BamHⅠ）對連接產(chǎn)物進行鑒定。同時構(gòu)建pLentiR.SV40-4-1BBL作為對照載體。

1.3 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）的純化 按照Li?pofectamine2000 操作說明分別將pLentiR.SV40-Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）、pLentiR.SV40-Tandab（CD3/CD19）及pLentiR.SV40-4-1BBL 轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，48 h 后收集培養(yǎng)上清備用。 根據(jù)HisTrap Excel（1 mL）親和鎳柱的操作說明，對攜帶His 標(biāo)簽的目的蛋白于AKTA Primer 純化系統(tǒng)中進行純化。將含目的蛋白樣品過濾除菌后置于超濾管（Amicon Ultra 30K）中濃縮，分裝后保存于－80 ℃冰箱備用。同時取少許濃縮液根據(jù)His Tag ELISA 試劑盒操作說明進行定量。隨后對樣品進行Western blotting 檢測，步驟參照文獻［8］。

1.4 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）與靶抗原的結(jié)合活性檢測 取對數(shù)生長期的Raji 細(xì)胞及分別經(jīng)HIT3a 抗體或抗人4-1BB 抗體封閉后的Jurkat 細(xì)胞，分別加入純化后的Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）、Tandab（CD3/CD19）、4-1BBL 或等體積的PBS，于4 ℃條件下共同孵育1 h。離心棄上清后，冷PBS 洗滌細(xì)胞3 次。向細(xì)胞中加入Alexa Fluor 488 標(biāo)記的抗His-tag 抗體（終濃度為0.5 μg/mL），于4 ℃條件下孵育30 min。冷PBS 洗滌細(xì)胞2 次后，將細(xì)胞重懸于500 μL 的PBS，流式細(xì)胞儀檢測Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）與CD19+細(xì)胞（Raji 細(xì)胞）、CD3+細(xì)胞（Jurkat細(xì)胞）、4-1BB+細(xì)胞（Jurkat細(xì)胞）的結(jié)合活性。1.5 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）介導(dǎo)的T 細(xì)胞對Raji細(xì)胞的殺傷作用觀察

1.5.1 細(xì)胞分組及處理 采用CytoTox 96 非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒（Promega，LDH釋放法）檢測T 細(xì)胞對CD19+B 細(xì)胞的殺傷能力［9］。將健康成人富含血小板的白膜經(jīng)密度梯度離心獲取外周血單個核細(xì)胞，按照試劑盒操作說明通過免疫磁珠分選CD3+T 細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測獲得率。收集處于對數(shù)生長期的Raji 細(xì)胞，將其密度調(diào)整為2×106/mL，分別取50 μL（1×105個細(xì)胞）加入96 孔板中，然后按照一定效靶比（E∶T=20∶1）加入T 細(xì)胞，使每孔的總體積為100 μL。分別于每孔加入0.08、0.8、8 pmol/mL 的Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）、Tandab（CD3/CD19）、4-1BBL 各100 μL。同時設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞最大釋放孔、體積校正對照孔及培養(yǎng)基背景對照孔，所有實驗孔和對照孔至少設(shè)置3 個復(fù)孔。混勻后，以250 g 離心4 min 以確保效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞充分接觸。將離心板置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下孵育8 h。

1.5.2 T 細(xì)胞對Raji 細(xì)胞殺傷能力檢測 在收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清前45 min，向靶細(xì)胞最大釋放孔及體積校正對照孔分別加入20 μL 的裂解液。孵育8 h 后，250 g 離心4 min。用排槍從每孔轉(zhuǎn)移50 μL上清至一個新的96 孔平底板中，每孔加入配置好的底物液，室溫避光孵育，30 min后每孔加入50 μL的終止液，1 h內(nèi)于490 nm處測量OD值。細(xì)胞殺傷百分比=（OD實驗孔-OD效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔-OD靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔）/（OD靶細(xì)胞最大釋放孔-OD靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔）×100%。

1.5.3 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-2 檢測 分組及操作參照“1.5.1”，融合蛋白作用濃度為8 pmol/mL，孵育24 h 后，分別收集細(xì)胞及培養(yǎng)液上清。采用ELI?SA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的IL-2。

1.5.4 T 細(xì)胞活化標(biāo)志物檢測 收集融合蛋白作用濃度為8 pmol/mL 的各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管中，PBS 洗滌1 次。于每管中加入20 μL APC 標(biāo)記的抗CD3 抗體，4 ℃孵育30 min。PBS 洗滌2 次后于每管中加入20 μL FITC 標(biāo)記的抗CD25抗體或FITC 標(biāo)記的抗CD69 抗體，4 ℃孵育30 min。PBS 洗滌2 次，用300 μL PBS 重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測CD3+CD69+細(xì)胞、CD3+CD25+細(xì)胞的比例。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8 或Excel軟件。計量資料以表示。兩組比較采用t檢驗。多組比較采用單因素方差分析（one-way ANO?VA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pLentiR.SV40-Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）構(gòu)建情況 抗CD3、抗CD19 的可變區(qū)序列和4-1BBL胞外區(qū)序列分別通過不同長度的G4S 柔性肽串聯(lián)。將整個表達框克隆入慢病毒表達載體中，多肽鏈一經(jīng)表達，由于分子間同源結(jié)構(gòu)的相互作用和二硫鍵的形成，兩條多肽鏈?zhǔn)孜步Y(jié)合，形成同源二聚體結(jié)構(gòu)（圖1），這種結(jié)構(gòu)分別具有兩個同時針對CD3、CD19、4-1BB 的結(jié)合位點。Western blotting 結(jié)果表明，非還原狀態(tài)的表達產(chǎn)物Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）在160 kD 或79 kD 處有相應(yīng)條帶；還原后僅在79 kD處有條帶，與實驗設(shè)計相符（圖2）。

圖1 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）的分子模型

2.2 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）與CD19+、CD3+、4-1BB+細(xì)胞的結(jié)合率 融合蛋白Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）與CD19+、CD3+、4-1BB+細(xì)胞均具有較好的結(jié)合活性。見表1。

圖2 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）Westernblotting檢測結(jié)果

2.3 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）介導(dǎo)的T 細(xì)胞對Raji細(xì)胞的殺傷作用 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）組T 細(xì)胞對Raji 細(xì)胞殺傷百分比與Tandab（CD3/CD19）組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但均高于4-1BBL 組（P均＜0.01）。在效靶比一定時（E∶T=20∶1），隨著融合蛋白Tandab濃度增高，T細(xì)胞對Raji細(xì)胞的殺傷百分比逐漸增高，作用呈劑量依賴性（P均＜0.01）。詳見表2。Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）組、Tandab（CD3/CD19）組、4-1BBL 組、PBS 組中細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的IL-2相對水平分別為4.58 ± 1.06、6.83 ± 0.89、2.36± 0.60、1.03 ± 0.30，前三組均高于PBS 組（P均＜0.05）。 Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）組、Tandab（CD3/CD19）組CD3+CD69+細(xì)胞、CD3+CD25+細(xì)胞比例高于4-1BBL組、PBS組（P均＜0.01）。見表3。

表1 融合蛋白與CD19+、CD3+、4-1BB+細(xì)胞的結(jié)合率（%）

表1 融合蛋白與CD19+、CD3+、4-1BB+細(xì)胞的結(jié)合率（%）

注：與Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）組相比，*P＜0.05，#P＜0.01。

組別Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）組Tandab（CD3/CD19）組4-1BBL組結(jié)合率4-1BB+細(xì)胞46.63 ± 3.75－69.83 ± 3.17#CD3+細(xì)胞87.00 ± 3.99 96.90 ± 2.33*－CD19+細(xì)胞95.77 ± 2.10 98.97 ± 0.15－

表2 不同濃度融合蛋白介導(dǎo)的T細(xì)胞對Raji細(xì)胞的殺傷百分比比較（%）

表2 不同濃度融合蛋白介導(dǎo)的T細(xì)胞對Raji細(xì)胞的殺傷百分比比較（%）

注：與4-1BBL組相比，*P＜0.01；同組內(nèi)不同作用濃度兩兩相比，#P＜0.05。

組別Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）組Tandab（CD3/CD19）組4-1BBL組細(xì)胞殺傷百分比8 pmol/mL 70.35 ± 3.50*#69.47 ± 4.10*#11.64 ± 1.52 0.08 pmol/mL 32.57 ± 2.64*#37.68 ± 6.70*#5.29 ± 2.33 0.8 pmol/mL 43.74 ± 2.13*#47.19 ± 4.15*#6.76 ± 1.63

表3 8 pmol/mL融合蛋白作用后各組CD3+CD69+細(xì)胞、CD3+CD25+細(xì)胞比例比較（%，）

表3 8 pmol/mL融合蛋白作用后各組CD3+CD69+細(xì)胞、CD3+CD25+細(xì)胞比例比較（%，）

注：與PBS組相比，*P＜0.01；與4-1BBL組相比，#P＜0.01。

組別Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）組Tandab（CD3/CD19）組4-1BBL組PBS組CD3+CD25+細(xì)胞比例16.37 ± 2.44*#20.55 ± 2.73*#7.23 ± 1.70 4.99 ± 1.10 CD3+CD69+細(xì)胞比例73.78 ± 3.31*#81.70 ± 3.72*#30.31 ± 3.18*6.98 ± 0.60

3 討論

目前主要有兩種策略來募集T 細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。第一種是利用嵌合抗原受體（CAR）修飾的T 細(xì)胞，同時為了增強效應(yīng)，還可在CAR 中引入共刺激分子如CD28、4-1BB 或OX40［9］。另一種募集T 細(xì)胞的途徑是 通 過BsAbs［10］。BsAbs 的一端 可 以 與T 細(xì)胞活化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，另一端則可以與靶細(xì)胞上的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合。本課題組曾構(gòu)建和表達與CD3抗原、CD19抗原分別具有兩個結(jié)合位點的串聯(lián)四價雙特異性抗體Tandab（CD3/CD19），它可以募集T細(xì)胞從而有效殺傷CD19+B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞［8］。

T 細(xì)胞的激活在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要作用。初始T 細(xì)胞活化的第一信號是T 細(xì)胞受體的激活，第二信號便是共刺激信號。其中CD28/B7 是研究較多的共刺激通路，近年來對4-1BB/4-1BBL共刺激通路的研究也逐漸增多。4-1BB 主要表達在激活的T 細(xì)胞表面［11］，與其配體4-1BBL 或激動性抗體結(jié)合后可減少抗原特異性CTL 凋亡、提高效應(yīng)T 細(xì)胞的殺傷功能，且有助于向記憶細(xì)胞的分化和維持［12-13］。盡管免疫檢查點抑制劑在多種實體瘤中已被證明能夠顯著提高客觀緩解率和生存期，但僅10%～30% 的惡性腫瘤患者有治療反應(yīng)［14］，這可能與腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞大部分因代謝能量不足而處于耗竭狀態(tài)有關(guān)，PD-1 阻斷療法也無法恢復(fù)線粒體活性［15］。然而，共刺激分子4-1BB 在耗竭性T 細(xì)胞中常呈高表達［15-16］，激活4-1BB 后可通過p38-MAPK 通路增強線粒體活性，恢復(fù)腫瘤浸潤T細(xì)胞的供能［15］。另一項研究也證實，在膠質(zhì)瘤模型中聯(lián)合使用4-1BB激動性抗體和抗PD-1抗體后可以明顯延長小鼠的存活期［17］。因此，在腫瘤的免疫治療中，靶向共刺激受體4-1BB也是一種有效策略。

本研究中，我們在Tandab（CD3/CD19）的基礎(chǔ)上引入4-1BBL 胞外結(jié)構(gòu)域，設(shè)計了一種融合蛋白Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）。Western blotting 檢測結(jié)果顯示，在非還原狀態(tài)下Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）同時具有單體、二聚體、多聚體等多種形式的存在，推測是由于分子間相互作用形成了同源多聚體。FACS 結(jié)果顯示，Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）與CD3 分子的結(jié)合力較Tandab（CD3/CD19）有所下降，且Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）與4-1BB 的結(jié)合力較4-1BBL組也有所降低，推測可能的原因是多肽鏈羧基端4-1BBL 胞外區(qū)的引入影響了部分多肽鏈同源聚合成Tandab（CD3/CD19/4-1BBL），另外空間位阻可能也影響與CD3分子和4-1BB 的結(jié)合。殺傷作用檢測結(jié)果表明，Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）介導(dǎo)的T 細(xì)胞對Raji 細(xì)胞的殺傷效果與Tandab（CD3/CD19）相當(dāng)。我們在后續(xù)研究中將進一步優(yōu)化連接4-1BBL 胞外區(qū)結(jié)構(gòu)與抗CD3 抗體重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)的柔性肽的長度，進而在體內(nèi)模型中探討引入4-1BBL 后是否能增強T 細(xì)胞對CD19+腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

綜上所述，融合蛋白Tandab（CD3/CD19/4-1BBL）具有同時與CD3、CD19 和4-1BB 分子結(jié)合的能力，并可有效介導(dǎo)T 細(xì)胞對Raji 細(xì)胞的殺傷作用。上述結(jié)果為后期在體內(nèi)驗證該融合蛋白對CD19+腫瘤細(xì)胞的抑制作用提供了實驗基礎(chǔ)。