民族藥鐵包金基于FGF2/FGFR1通路改善抑郁樣行為的機(jī)制研究※

●李成付 張秋萍 萬慧琪 許光輝 易立濤

抑郁癥是一種常見的精神性疾病，臨床表現(xiàn)主要是情緒低落，患者往往愁眉苦臉，感受情緒能力差，對(duì)身邊事物沒有興趣，從日常生活中體驗(yàn)不到快樂。世界衛(wèi)生組織指出目前抑郁癥影響全球1.2億人，已成為全球第二大負(fù)擔(dān)疾病。抑郁癥的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率較高，治療藥物價(jià)格相對(duì)昂貴，對(duì)患者家庭和社會(huì)產(chǎn)生了相當(dāng)沉重的經(jīng)濟(jì)壓力。因此，迫切需要價(jià)格低廉，治療效果好的抗抑郁藥物。

鐵包金始載于《嶺南采藥錄》，并為《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1990）》所收錄，該標(biāo)準(zhǔn)收錄的鐵包金是鼠李科勾兒茶屬植物細(xì)葉勾兒茶Berchemia lineata(L.)DC.的干燥根，主要分布于我國(guó)南部的廣西、福建、廣東、海南等省區(qū)。其性味淡、澀、平，具有固腎益氣、鎮(zhèn)咳消滯、止血止痛等多種功效，用于腫瘤、精神病、心臟病等多種疾病的治療。關(guān)于鐵包金的報(bào)道主要集中于對(duì)其化學(xué)成分的研究，而對(duì)其藥理活性的研究較少。張國(guó)利分離到槲皮素、異鼠李素、槲皮素-7-二甲醚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃素-鼠李糖苷、異喬木萜醇和β-谷甾醇[1]；沈玉霞則分離得到9個(gè)黃酮類化合物，4個(gè)蒽醌類化合物，4個(gè)木脂素類化合物和1個(gè)萜類化合物[2]；曾曉君分離得到數(shù)個(gè)甾醇類化合物和幾個(gè)黃酮衍生物[3]。藥理學(xué)研究資料則較少，僅發(fā)現(xiàn)鐵包金具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗肝損傷和抗腫瘤等活性。因此，進(jìn)一步拓展鐵包金的藥理活性，有助于進(jìn)一步開發(fā)民族藥鐵包金的應(yīng)用價(jià)值。本文首次通過行為學(xué)模型評(píng)價(jià)鐵包金的抗抑郁作用，并從成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF2）/成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（FG?FR1）信號(hào)通路探索其抗抑郁作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物雄性ICR 小鼠，SPF 級(jí)，體重（26±2）g，10周齡，購自上海斯萊克動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK（滬）2017-005。小鼠10只/籠，室溫（22±2）°C，光暗周期為12 h/12 h（光照時(shí)間07：00—19：00），自由獲得飼料與飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑鹽酸氟西?。ㄙ徸猿Ｖ菟乃幹扑幱邢薰荆┯昧姿猁}緩沖液（pH7.4）溶解；LPS（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）用磷酸鹽緩沖液（pH7.4）溶解。FGF2抗體購買自美國(guó)Santa Cruz 公司。磷酸化FGFR1抗體、FGFR1抗體購買自美國(guó)Abcam公司。

1.3 鐵包金粉末制備鐵包金2018年采集于廣西，經(jīng)廈門市中醫(yī)院陳雪梅主任藥師鑒定為鼠李科勾兒茶屬植物細(xì)葉勾兒茶Berchemia lineata(L.)DC.的干燥根。采用液氮低溫粉碎鐵包金之后，用0.5%的CMCNa制備混懸液。

2 方法

2.1 急性給藥實(shí)驗(yàn)雄性ICR小鼠150只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為三批。每批分為以下5組（n=10）：模型對(duì)照組（生理鹽水），鐵包金低劑量組（2 g/kg），鐵包金中劑量組（4 g/kg），鐵包金高劑量組（8 g/kg），陽性對(duì)照氟西汀組（20 mg/kg）。按以上分組灌胃給藥，給藥1小時(shí)后，分別進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。

2.1.1 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 在（25±2）℃下，將小鼠放置在充滿40 cm 水的透明玻璃容器（高20 cm，直徑14 cm）中游泳。除了小鼠試圖使頭部保持在水面之上所必需的動(dòng)作以外，小鼠沒有試圖逃脫的時(shí)間被記錄為不動(dòng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)持續(xù)6 min，統(tǒng)計(jì)最后4 min 內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。

2.1.2 懸尾實(shí)驗(yàn) 將小鼠尾巴距尾尖約1 cm 處懸掛在長(zhǎng)、寬和高分別是25 cm、25 cm和30 cm的裝置中，頭部朝下懸掛，距離底部約5 cm，總記錄時(shí)間為6 min，統(tǒng)計(jì)小鼠后4 min 內(nèi)總不動(dòng)時(shí)間，即小鼠完全沒有掙扎的狀態(tài)。

2.1.3 開場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 將小鼠置入一個(gè)長(zhǎng)寬均為40 cm、高為30 cm 的白色曠場(chǎng)內(nèi)，底板也為白色，且其底部劃分為25塊相等的正方形（8×8 cm），每次將小鼠放在正中央格子后開始計(jì)時(shí)，每次計(jì)時(shí)3 min，監(jiān)測(cè)指標(biāo)為小鼠跨格次數(shù)及僅后肢站立的直立次數(shù)。

2.2 LPS 實(shí)驗(yàn)雄性ICR 小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為以下6組（n=10）：正常對(duì)照組（生理鹽水），模型對(duì)照組（生理鹽水），鐵包金低劑量組（2 g/kg），鐵包金中劑量組（4 g/kg），鐵包金高劑量組（8 g/kg），氟西汀組（20 mg/kg）。按以上分組持續(xù)灌胃給藥7天，最后1次給藥1 h 后，除正常對(duì)照組外，其余組的小鼠腹腔注射0.83 mg/kg LPS[4]，進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，之后處死動(dòng)物取大腦海馬組織。

2.2.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 按照之前的文獻(xiàn)[5]進(jìn)行適當(dāng)?shù)母?。在測(cè)試之前，對(duì)小鼠進(jìn)行糖水訓(xùn)練。將兩瓶1%蔗糖溶液在每個(gè)籠子上放置24 h，然后用一瓶純水代替一瓶1%蔗糖溶液24 h，期間，12 h 時(shí)對(duì)水瓶更換一次位置。適應(yīng)后，剝奪水食12個(gè)h，之后開始正式實(shí)驗(yàn)。在測(cè)試過程中，將小鼠置于單獨(dú)的籠子中，小鼠可以分別在兩個(gè)瓶子中自由飲用1%蔗糖溶液和水。在實(shí)驗(yàn)開始12 h后，將1%蔗糖溶液和水互換位置。24 h 后，記錄消耗的蔗糖溶液和水的重量，并計(jì)算糖水偏好值。

2.2.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 同2.1.1。

2.2.3 組織提取 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)后，摘小鼠眼球快速放光血液。然后斷頭處死小鼠，快速取出海馬，立即用液氮凍結(jié)。組織樣本在-80 ℃下貯存至分析完成。

采用RIPA 裂解液對(duì)海馬組織進(jìn)行勻漿，隨后于層析柜振蕩器中振蕩15 min，之后將勻漿液以12000 r/min 的速率離心5 min，取上清液測(cè)定蛋白濃度。蛋白溶液在加入上樣緩沖液后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜。5%小牛血清蛋白封閉1 h 后，加入相應(yīng)抗體（1：1000）孵育過夜，之后加入連接HRP的二抗并孵育1 h。最后采用ECL顯影液于化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光成像。

2.3 數(shù)據(jù)分析所有的數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)差異用單因素方差分析結(jié)合Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 急性給藥實(shí)驗(yàn)

3.1.1 鐵包金對(duì)小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間的影響 給藥1 h 后，低、中、高劑量的鐵包金均能顯著降低小鼠的游泳不動(dòng)時(shí)間（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01），同時(shí)陽性藥氟西汀也可顯著降低小鼠的游泳不動(dòng)時(shí)間（P＜0.05）。見表1。

表1 鐵包金對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間的影響（n=10，）

表1 鐵包金對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間的影響（n=10，）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.1.2 鐵包金對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間的影響 給藥1 h 后，低、中、高劑量的鐵包金均能顯著降低小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間（P＜0.05或P＜0.01），同時(shí)陽性藥氟西汀也可顯著降低小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間（P＜0.01）。見表2。

表2 鐵包金對(duì)小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間的影響（n=10，）

表2 鐵包金對(duì)小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間的影響（n=10，）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.1.3 鐵包金對(duì)自發(fā)活動(dòng)的影響 給藥1 h 后，低、中、高劑量鐵包金及氟西汀對(duì)小鼠跨格次數(shù)和直立次數(shù)均沒有顯著性影響。見表3。

表3 鐵包金對(duì)小鼠開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中自發(fā)活動(dòng)的影響（n=10，）

表3 鐵包金對(duì)小鼠開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中自發(fā)活動(dòng)的影響（n=10，）

3.2 LPS實(shí)驗(yàn)

3.2.1 鐵包金對(duì)LPS 小鼠糖水偏好值的影響 與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠糖水偏好值顯著降低（P＜0.01）。低、中、高劑量鐵包金均可顯著增加小鼠糖水偏好值（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。同時(shí)，陽性對(duì)照氟西汀組也可增加小鼠糖水偏好值（P＜0.01）。見表4。

3.2.2 鐵包金對(duì)LPS小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間的影響 與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著增加（P＜0.01）。中、高劑量鐵包金可顯著降低小鼠不動(dòng)時(shí)間（P＜0.05）。同時(shí)，陽性對(duì)照氟西汀組也可降低小鼠不動(dòng)時(shí)間（P＜0.05）。見表5。

表4 鐵包金對(duì)LPS小鼠糖水偏好值的影響（n=10，）

表4 鐵包金對(duì)LPS小鼠糖水偏好值的影響（n=10，）

注：與正常對(duì)照組比較，##P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表5 鐵包金對(duì)LPS小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間的影響（n=10，）

表5 鐵包金對(duì)LPS小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間的影響（n=10，）

注：與正常對(duì)照組比較，##P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05

3.2.3 鐵包金對(duì)小鼠海馬FGF2及FGFR1表達(dá)水平的影響 與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠FGF2及磷酸化FGFR1水平顯著降低（P＜0.05）。中、高劑量鐵包金可顯著增加LPS 小鼠海馬FGF2表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01）。低、中、高劑量鐵包金均可顯著增加LPS 小鼠海馬FGFR1磷酸化水平（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）。同時(shí)，氟西汀也可以增加FGF2及磷酸化FG?FR1水平（P＜0.01，P＜0.01）。見圖1。

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為肝主疏泄，性喜條達(dá)，情緒郁悶及情緒暴怒等精神刺激，均可使肝失疏泄，氣機(jī)不暢，以致憂思郁怒，肝氣郁結(jié)，因此中醫(yī)主要是從消郁結(jié)著手治療抑郁癥?！稄V西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》記載民族藥鐵包金具有鎮(zhèn)咳消滯的功效，此功效正契合郁證“氣機(jī)郁滯”之病機(jī)，因此本文首次對(duì)鐵包金是否具有抗抑郁作用展開了研究。

本實(shí)驗(yàn)首先采用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)來觀察鐵包金是否具有改善小鼠絕望狀態(tài)的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鐵包金顯著降低了小鼠游泳和懸尾不動(dòng)時(shí)間。與此同時(shí)，在開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，鐵包金對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)行為沒有影響，表明鐵包金降低不動(dòng)時(shí)間的作用與神經(jīng)興奮性沒有關(guān)系，即鐵包金具有抗抑郁作用。隨后，本實(shí)驗(yàn)采用LPS 誘導(dǎo)的抑郁模型再次評(píng)價(jià)了鐵包金的抗抑郁作用。LPS誘導(dǎo)的炎癥抑郁模型廣泛地被用于與炎癥相關(guān)的機(jī)制研究[6]。結(jié)果表明，LPS 顯著降低了小鼠的糖水偏好值和增加了小鼠的游泳不動(dòng)時(shí)間，表明LPS誘導(dǎo)了小鼠的快感缺失和絕望等抑郁行為，鐵包金給藥之后，顯著增加了糖水偏好值和降低了不動(dòng)時(shí)間，表明鐵包金具有較好的抗抑郁作用。

圖1 鐵包金對(duì)LPS小鼠FGF2及FGFR1表達(dá)水平的影響（n=5）

FGF是一類生長(zhǎng)因子蛋白質(zhì)家族，包含多個(gè)結(jié)構(gòu)相似的多肽。在成年大腦中，F(xiàn)GF2主要在腦室下區(qū)和齒狀回高度表達(dá)，高濃度的FGF2可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖以及促進(jìn)多能神經(jīng)干細(xì)胞分化，維持成年小鼠的神經(jīng)發(fā)生[7]。因此激活FGF2信號(hào)通路對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有潛在的治療作用[8]。同時(shí)有報(bào)道指出，神經(jīng)炎癥下調(diào)了FGF2-ERK1/2信號(hào)通路。外源FGF2可以防止神經(jīng)炎癥引起的ERK1/2磷酸化減少，減輕海馬神經(jīng)發(fā)生中神經(jīng)炎癥引起的損傷，從而緩解了神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的抑郁樣行為[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中，LPS模型組小鼠海馬FGF2含量明顯低于正常組，說明LPS 抑制了小鼠海馬FGF2的表達(dá)。給予中劑量和高劑量鐵包金之后，可增加海馬FGF2的表達(dá)；與之相對(duì)應(yīng)的是，LPS 模型組小鼠海馬FGFR1磷酸化程度明顯低于正常組，說明LPS抑制了小鼠海馬FGFR1的磷酸化。給予鐵包金之后，均可增加海馬FGFR1的磷酸化。以上結(jié)果說明鐵包金可以激活海馬FGF2/FGFR1信號(hào)通路，從而產(chǎn)生抗抑郁作用。

綜上所述，鐵包金單次及多次給藥均可緩解絕望及快感缺失等抑郁癥狀，能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)探討了鐵包金的抗抑郁作用機(jī)制與FGF2/FGFR1信號(hào)通路的活化相關(guān)，但是實(shí)驗(yàn)沒有對(duì)鐵包金有效成分進(jìn)行分離，未對(duì)FGF2/FGFR1下游信號(hào)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，也沒有對(duì)鐵包金如何通過FGF2/FGFR1通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)炎癥進(jìn)行深入研究。后續(xù)對(duì)這些問題的進(jìn)一步探索將會(huì)在抗抑郁的新藥開發(fā)中產(chǎn)生重要的意義。